一种猪cik细胞的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种猪CIK细胞的制备方法，该方法主要包括收集外周血淋巴细胞层，并对收集的外周血淋巴细胞进行诱导培养，该方法通过对CIK细胞制备方法进行优化试验，建立了适用于猪CIK细胞的培养体系，利用该培养体系培养猪外周血淋巴细胞5d后，可以使体系中淋巴细胞的总数增长近16倍，利用该培养体系可以为体外细胞免疫试验提供大量的具有NK细胞表型的免疫细胞。
【专利说明】
一种猪CIK细胞的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于CIK细胞制备领域，特别涉及一种猪CIK细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002] ΝΚ细胞，即自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，具有杀伤性强、杀伤效果高效、 可直接杀死癌细胞等特点，ΝΚ细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身 组织细胞和寄生虫等。ΝΚ细胞现已被越来越多地应用于各种临床研究之中，尤其是对人类 及啮齿类的研究较为透彻。但某些大型动物如猪、牛等，其细胞表征与啮齿类相比差异很 大，目前临床研究也相对较少，因此能建立一种能够高效地分离猪ΝΚ细胞并使其能在体外 稳定增殖的方法便尤为方便重要。
[0003] CIK细胞(cytokine-induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)是将人外周血、 脐血或骨髓的单个核细胞在体外用细胞因子培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该 种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞。
[0004] 通过细胞因子而诱导细胞培养的方法在近些年中已有大量报道，而目前人的CIK 细胞已研发成功并投入到临床应用。该细胞的培养方法是通过在无血清的悬浮细胞培养基 中，分别在不同培养时期加入CD3、IFN-y以及IL-2等细胞因子，以达到增强细胞杀伤性、促 进细胞体外增殖的目的。根据已有报道，通过该方法培养的杀伤细胞可在体外连续培养20d 左右，增殖约15代左右，是在短时间内大量获得杀伤性细胞的有效方法;例如CN101063108 还公开了一种高增殖力、高细胞毒活性CIK细胞的制备方法，CN105274053还公开了一种高 细胞毒活性的CIK细胞的制备方法，但是通过上述方法制备的猪CIK细胞的增殖力差，并且 细胞毒活性低;现有技术中，为了提高CIK细胞的增殖力或细胞毒活性，还公开了一些中药 提取物，例如CN102755512公开的由红参、麦冬和黄芪组成的用于提高CIK细胞增殖速率的 中药提取物，但是该提取物对提高猪CIK细胞的增殖效率不明显。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪CIK细胞的制备方法，通过该方法制备 的猪CIK细胞具有高的细胞增殖力和强的细胞毒活性。
[0006] 本发明具体技术方案如下：
[0007] 本发明一方面提供一种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0008] S1:采用浓度为1.110ng/L的Percoll密度梯度离心法分离猪血液内的外周血淋巴 细胞，收集外周血淋巴细胞层，用PBS洗涤2次，备用；
[0009] 32:向步骤31分离的外周血淋巴细胞中按终浓度加入10001]/11^的1?1丫和200-300ng/mL的完全培养基，置于培养箱中培养24h后，按终浓度补加50ng/mL的⑶3和1000u/mL 的IL-2;每2-3天添加完全培养基和IL-2,并保持完全培养基的终浓度为200-300ng/mL，IL-2的终浓度为1000u/mL，培养3-10天，制得CIK细胞。
[0010] 通过本发明提供的制备方法制备的CIK细胞具有很好的增殖力和很强的细胞毒活 性。
[0011]进一步的改进，完全培养基为1640培养液与胎牛血清组成的混合液、或KBM581无 血清培养液。
[0012] 进一步的改进，完全培养基为1640培养液与胎牛血清组成的混合液，其中每毫升 混合液中含有5%的胎牛血清。
[0013] 进一步的改进，上述制备方法还包括向完全培养基中加入培养溶质。
[0014] 进一步的改进，上述制备方法中加入的培养溶质包括提取混合物，
[0015] 所述提取混合物是由如下重量份数的成分组成：
[0016] 蒲公英提取物10-15半枝莲提取物5-7.5 [0017] 芡实提取物1.2-3.5金银花提取物15-20。
[0018] 进一步的改进，所述提取混合物的制备方法如下：
[0019] a.称取蒲公英、半枝莲、芡实和金银花，粉碎，加浓度为75 %的乙醇水溶液，回流提 取三次，第一次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的7倍，回流2小 时，第二次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的5倍，回流2小时，第 三次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的3倍，回流1小时，合并回 流液，过滤，滤液浓缩至稠膏；
[0020] b.向步骤a所得稠膏中加入2倍乙醇，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除 去馏分，再用浓度为30-60 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制 得提取混合物。
[0021] 进一步的改进，本发明的制备方法中进一步加入了提取混合物，该提取混合物能 够显著提高制备的CIK细胞的细胞毒活性。
[0022] 进一步的改进，上述制备方法中加入的培养溶质还包括重量份数为0.5-1.5份的 甲壳素、0.1-0.3份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4-0.7份的氧化铁、5-10份的多聚谷氨酸和1-3 份的阿拉伯胶。
[0023] 本发明的制备方法中进一步加入了甲壳素、聚甲基丙烯酸甲酯、氧化铁、多聚谷氨 酸和阿拉伯胶能够显著提高CIK细胞的细胞毒活性的靶向性，并且能够显著提高细胞活力。
[0024] 进一步的改进，上述制备方法中加入的培养溶质还包括重量份数为2-5份的磷酯 酰丝氨酸、1-2份的沙苑子提取物、5-10份的威灵仙提取物和1-3份的胆固醇棕榈酸酯。
[0025] 本发明通过在制备方法中加入磷酯酰丝氨酸、沙苑子提取物、威灵仙提取物和胆 固醇棕榈酸酯的混合物能够显著提高制备的CIK细胞的增殖力。
[0026] 本发明另一方面提供一种用于提高猪CIK细胞增殖力的组合物，该组合物是由如 下重量份数的成分组成：
[0027]磷酯酰丝氨酸2-5 沙苑子提取物1-2 [0028]威灵仙提取物5-10胆固醇棕榈酸酯1-3。
[0029] 本发明另一方面提供一种组合物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0030] 1)称取沙苑子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量为沙苑子重量的7倍，煎煮3 小时，第二次加入水的量为沙苑子重量的5倍，煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，向滤液中加入 乙醇，使乙醇的浓度达到53 %，静置，过滤，收集滤液，浓缩，喷雾干燥，制得沙苑子提取物；
[0031] 2)称取威灵仙粉碎，加浓度为50%的乙醇水溶液，回流提取两次，第一次加入乙醇 水溶液的量为威灵仙重量的7倍，回流2小时，第二次加入乙醇水溶液的量为为威灵仙重量 的5倍，回流2小时，合并回流液，过滤，滤液浓缩至稠膏；
[0032] 3)向步骤2)所得稠膏中加入2倍水，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除去 馏分，再用浓度为75-95 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制得 威灵仙子提取物；
[0033] 4)将沙苑子提取物、威灵仙提取物与磷酯酰丝氨酸和胆固醇棕榈酸酯混合均匀， 制得组合物。
[0034] 本发明另一方面还提供了沙苑子提取物的制备方法，其具体步骤如下：称取沙苑 子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量为沙苑子重量的7倍，煎煮3小时，第二次加入水的 量为沙苑子重量的5倍，煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，向滤液中加入乙醇，使乙醇的浓度达 到53 %，静置，过滤，收集滤液，浓缩，喷雾干燥，制得沙苑子提取物。
[0035] 本发明另一方面还提供了威灵仙提取物的制备方法，其具体步骤如下：
[0036] 1)称取威灵仙粉碎，加浓度为50%的乙醇水溶液，回流提取两次，第一次加入乙醇 水溶液的量为威灵仙重量的7倍，回流2小时，第二次加入乙醇水溶液的量为为威灵仙重量 的5倍，回流2小时，合并回流液，过滤，滤液浓缩至稠膏；
[0037] 2)向步骤1)所得稠膏中加入2倍水，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除去 馏分，再用浓度为75-95 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制得 威灵仙子提取物。
[0038]本发明的有益效果是：
[0039] 1.本发明提供的猪CIK细胞的制备方法能够快速获得大量具有肿瘤细胞杀伤活性 的猪CIK细胞群。
[0040] 2.通过对CIK细胞制备方法进行优化试验，建立了适用于猪CIK细胞的培养体系， 利用该培养体系培养猪外周血淋巴细胞5d后，可以使体系中淋巴细胞的总数增长近16倍， 利用该培养体系可以为体外细胞免疫试验提供大量的具有NK细胞表型的免疫细胞。
[0041 ] 3.利用流式细胞术分析猪CIK细胞在培养过程中的比例变化结果表明，培养5d后， 淋巴细胞中具有NK细胞表型（CD2+/CD87CD3J的细胞比例较最初分离的淋巴细胞提高 5.59倍;焚光定量?0?结果也表明，疆细胞相关的其它表面标志(0)2、0)3、0)8€[、31^与?1^1) 的表达也在培养第5天达到了顶峰，与流式细胞术结果一致。
[0042] 4.猪CIK细胞毒活性实验结果表明，诱导培养第5d的CIK细胞在效靶比为12:1时达 到对肿瘤细胞系（YAC-1)最佳的杀伤活性，杀伤率达到近80%;而最初分离的淋巴细胞对 YAC-1的杀伤率仅为56.86 %。
[0043]综上所述，本发明建立了一种猪CIK细胞体外培养体系，利用该培养体系可以在短 时间内获得大量具有NK细胞体外杀伤活性的猪CIK细胞，进而可以为体外抗肿瘤细胞免疫 研究和病原微生物引起的细胞免疫研究提供大量、优质的效应细胞，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0044] 图1猪CIK细胞形态图；
[0045] A-实施例1的方法培养3d，B-实施例2的方法培养3d;
[0046] 图2猪CIK细胞增殖活性图；
[0047] A-C分别为实施例1的方法分别培养ld、3d、5d用流式测得的细胞增殖结果；
[0048] D-F分别为实施例2的方法分别培养ld、3d、5d用流式测得的细胞增殖结果；
[0049] 图3猪CIK细胞培养过程比例变化图；
[0050] A-E分别为CIK诱导培养过程中不同时间（1(1、3(1、5(1、7(1、9(1)具有疆细胞表型（〇02 +/CD8+/⑶:Γ)的细胞比例变化情况；
[0051 ] F为⑶27⑶87⑶3-细胞数据统计结果；
[0052]图4猪外周血淋巴细胞表型图；
[0053]需要指出的是，本发明所提出的诱导培养方法就是指实施例1和实施例2的制备方 法。
【具体实施方式】 [0054] 实施例1
[0055] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0056] S1:采用浓度为1.110ng/L的Percoll密度梯度离心法分离猪血液内的 [0057]外周血淋巴细胞，收集外周血淋巴细胞层，用PBS洗涤2次，备用；
[0058] S2:向步骤S1分离的外周血淋巴细胞中按终浓度加入1000U/mL的IFN-γ和200ng/ mL的完全培养基，置于培养箱中培养24h后，按终浓度补加50ng/mL的⑶3和1000u/mL的IL-2;每2天添加完全培养基和IL-2,并保持完全培养基的终浓度为200-30ng/mL，IL-2的终浓 度为1000u/mL，培养5天，制得CIK细胞;所述完全培养基为1640培养液与胎牛血清组成的混 合液，每毫升混合液中含有5 %的胎牛血清。
[0059] 实施例2
[0060] 一种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[00611 S1:采用浓度为1.110ng/L的Percoll密度梯度离心法分离猪血液内的外周血淋巴 细胞，收集外周血淋巴细胞层，用PBS洗涤2次，备用；
[0062] S2:向步骤S1分离的外周血淋巴细胞中按终浓度加入1000U/mL的IFN-γ和300ng/ mL的完全培养基，置于培养箱中培养24h后，按终浓度补加50ng/mL的⑶3和1000u/mL的IL-2;每3天添加完全培养基和IL-2，并保持完全培养基的终浓度为300ng/mL，IL-2的终浓度为 1000u/mL，培养10天，制得CIK细胞，完全培养基为KBM581无血清培养液。
[0063] 实施例3
[0064] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例1不同的是，该方法还包括向完 全培养基中加入培养溶质，所述培养溶质包括提取混合物，该提取混合物是由如下重量份 数的成分组成：
[0065]蒲公英提取物10半枝莲提取物5 [0066]芡实提取物1.2 金银花提取物15。
[0067] 实施例4
[0068] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，提取混合物是由如 下重量份数的成分组成：
[0069]蒲公英提取物15半枝莲提取物7.5 [0070]芡实提取物3.5 金银花提取物20。
[0071] 实施例5
[0072] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，提取混合物是由如 下重量份数的成分组成：
[0073]蒲公英提取物12.5半枝莲提取物6 [0074]芡实提取物2 金银花提取物17.5;
[0075]该提取混合物的制备方法为：
[0076] a.称取蒲公英、半枝莲、芡实和金银花，粉碎，加浓度为75 %的乙醇水溶液，回流提 取三次，第一次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的7倍，回流2小 时，第二次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的5倍，回流2小时，第 三次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的3倍，回流1小时，合并回 流液，过滤，滤液浓缩至稠膏；
[0077] b.向步骤a所得稠膏中加入2倍乙醇，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除 去馏分，再用浓度为30 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制得提 取混合物。
[0078] 实施例6
[0079] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为0.5份的甲壳素、0.1份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4份的氧化铁、5份的多聚谷氨酸和 1份的阿拉伯胶。
[0080] 实施例7
[0081] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为1.5份的甲壳素、0.3份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.7份的氧化铁、10份的多聚谷氨酸 和3份的阿拉伯胶。
[0082] 实施例8
[0083] 一种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为2份的磷酯酰丝氨酸、1份的沙苑子提取物、5份的威灵仙提取物和1份的胆固醇棕 榈酸酯。
[0084] 实施例9
[0085] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例6不同的是，培养溶质还包括重 量份数为5份的磷酯酰丝氨酸、2份的沙苑子提取物、10份的威灵仙提取物和3份的胆固醇棕 榈酸酯。
[0086] 实施例10
[0087] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例7不同的是，培养溶质还包括重 量份数为3.5份的磷酯酰丝氨酸、1.5份的沙苑子提取物、7.5份的威灵仙提取物和2份的胆 固醇棕榈酸酯。
[0088] 实施例11
[0089] -种用于提高猪CIK细胞增殖力的组合物，该组合物是由如下重量份数的成分组 成：
[0090] 磷酯酰丝氨酸2 沙苑子提取物1 [0091]威灵仙提取物5 胆固醇棕榈酸酯1。
[0092] 实施例12
[0093] -种用于提高猪CIK细胞增殖力的组合物，该组合物是由如下重量份数的成分组 成：
[0094]磷酯酰丝氨酸5 沙苑子提取物2 [0095]威灵仙提取物10胆固醇棕榈酸酯3。
[0096] 实施例13
[0097] -种用于提高猪CIK细胞增殖力的组合物，该组合物是由如下重量份数的成分组 成：
[0098] 磷酯酰丝氨酸3.5 沙苑子提取物1.5
[0099]威灵仙提取物7.5 胆固醇棕榈酸酯2
[0100]该组合物的制备方法为：
[0101 ] 1)称取沙苑子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量为沙苑子重量的7倍，煎煮3 小时，第二次加入水的量为沙苑子重量的5倍，煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，向滤液中加入 乙醇，使乙醇的浓度达到53 %，静置，过滤，收集滤液，浓缩，喷雾干燥，制得沙苑子提取物；
[0102] 2)称取威灵仙粉碎，加浓度为50%的乙醇水溶液，回流提取两次，第一次加入乙醇 水溶液的量为威灵仙重量的7倍，回流2小时，第二次加入乙醇水溶液的量为为威灵仙重量 的5倍，回流2小时，合并回流液，过滤，滤液浓缩至稠膏；
[0103] 3)向步骤2)所得稠膏中加入2倍水，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除去 馏分，再用浓度为75-95 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制得 威灵仙子提取物；
[0104] 4)将沙苑子提取物、威灵仙提取物与磷酯酰丝氨酸和胆固醇棕榈酸酯混合均匀， 制得组合物。
[0105] 对照例1
[0106] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例1不同的是，该方法还包括向完 全培养基中加入培养溶质，所述培养溶质包括提取混合物，该提取混合物是由如下重量份 数的成分组成：
[0107] 蒲公英提取物10半枝莲提取物5芡实提取物1.2。
[0108] 对照例2
[0109] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例1不同的是，该方法还包括向完 全培养基中加入培养溶质，所述培养溶质包括提取混合物，该提取混合物是由如下重量份 数的成分组成：
[0110] 黄芪提取物10 半枝莲提取物5
[0111] 芡实提取物1.2 麦冬提取物15。
[0112] 对照例3
[0113] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为0.5份的甲壳素、0.1份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4份的氧化铁、5份的多聚谷氨酸和 1份的卡波姆。
[0114] 对照例4
[0115] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为0.1份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4份的氧化铁、5份的多聚谷氨酸和1份的阿拉伯胶。
[0116] 对照例5
[0117] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为2份的磷酯酰丝氨酸、5份的威灵仙提取物和1份的胆固醇棕榈酸酯。
[0118] 对照例6
[0119] -种猪CIK细胞的制备方法，该制备方法与实施例3不同的是，培养溶质还包括重 量份数为1份的沙苑子提取物和5份的威灵仙提取物和1份的棕榈酸钠。
[0120]试验例1细胞增殖活性检测
[0121] 将最初分离出的外周血淋巴细胞留取一部分，用croA-SE以1:1000的比例对细胞 进行染色。加入荧光指示剂后37°C孵育30min即可完成染色。之后用PBS将细胞悬浮清洗两 次，离心条件同之前步骤，最后分别按照实施例1和实施例2的方法进行制备。制备的细胞分 别在Id、3d、5d、7d、9d取适量细胞样品，通过流式细胞仪检测细胞增殖状况，每天观察细胞 形态，并对细胞的生长状况进行记录，绘制生长曲线如图1所示。
[0122] 从图1中可以看出实施例1和实施例2得到的细胞在前期制备过程中（l-6d)在形态 上差异不显著，但在制备的后期（7d以后）实施例2制备的细胞的凋亡速度和细胞碎片数量 明显较实施例1多。
[0123] 按照实施例1和实施例2的方法制备CIK细胞，并且分别在制备的第ld、3d、5d进行 细胞取样，并通过流式细胞仪检测细胞增殖情况，如图2所示。
[0124] 从图2中可以看出，实施例1和实施例2得到的结果基本一致，在制备第5d时均可见 明显的3个荧光峰，表明制备后细胞发生了 3次分裂，与最初分离的细胞数相比扩增了 16倍。
[0125] 试验例2细胞表型分析
[0126] 2.1流式细胞仪检测0)27〇)87〇)3_细胞比例
[0127] 从颈静脉采集巴马小型猪血液，加入到含有枸橼酸钠抗凝剂的离心管中。采用 Percol 1 (1.110ng/L)密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，收集淋巴细胞层，用PBS洗涤2 次，加入适量细胞培养液重悬，利用流式抗体⑶2、⑶3、⑶8对细胞进行标记，利用流式细胞 仪检测各种表面标志的表达情况，结果如图3所示。
[0128] 从图3中可以看出，新鲜分离的外周血淋巴细胞中，淋巴细胞约占总细胞含量的 26.4%，淋巴细胞中⑶2+细胞的比例约为41.54%、⑶3+细胞的比例约为26.89%、⑶8+细胞 的比例约为34.83%，CD2+/⑶87⑶3-细胞的比例约为7.82%。⑶27⑶87⑶3-细胞被认为是 猪NK细胞的典型表型，因此，本研究中测得的巴马猪NK细胞约占总淋巴细胞的7.82%。
[0129] 在猪外周血淋巴细胞诱导培养过程中，按照实施例1的方法进行制备，制备过程的 第1(1、3(1、5(1、7(1、9(1对细胞取样，按照比例1 :100加入流式抗体^2、^3、^8对细胞进行标 记，每次标记过程中都进行四组染色标记，分别为三种标签的单独标记及三种标签的共同 标记，标记方法如下：首先吸取适量细胞培养液，600g离心15min，弃上清后用适量PBS悬浮 清洗细胞，再次600g离心15min，之后用5 %BSA悬浮细胞，室温封闭lh，按上述条件离心，加 入适量PBS悬浮细胞，并根据需求加入不同抗体对细胞进行荧光标记，37°C孵育lh后，离心， 并用PBS清洗两次，最后再用适量PBS重悬细胞，过300目细胞筛后将样品转移至流式管中， 通过流式细胞仪检测表型为⑶2+/CD8+/⑶:Γ的比例变化情况，检测结果见图4。
[0130]从图4中可以看出，新鲜分离的淋巴细胞中具有NK细胞表型的细胞占7.81 %，实施 例1制备的第3d开始，CIK细胞比例明显上升，到第5d达到顶峰，其占总细胞43.63%，较最初 分离时相比细胞比例提升了5.59倍，继续之后细胞比例趋于平稳，在第7d之后NK细胞比例 略有下降。
[0131] 结论：
[0132] 本研究首先测定了新鲜分离的猪外周血淋巴细胞中NK细胞(CD2+/CD8+/CD3-)的 比例，通过流式细胞仪检测的结果显示，当巴马猪外周血淋巴细胞刚被分离出时，NK细胞约 占总淋巴细胞的7.82 %。
[0133] 接下来，本研究比较了实施例1和实施例2制备效果，结果显示"1640培养液+5% FBS"和"KBM581无血清培养液"两种培养体系在培养7d内，在增殖活性和细胞表型上差异不 显著，但是在7d之后，"1640培养液+ 5 %FBS"的培养体系培养的细胞状况要明显好于 "KBM581无血清培养液"体系的细胞，通过镜下观察细胞数量以及细胞形态均一程度便可较 明显的体现出来。
[0134] 最后，通过对所分离培养的NK细胞每天进行的检测结果发现，利用我们建立的细 胞诱导培养的方法可以使猪外周血淋巴细胞中具有NK细胞表型的细胞数量在第5d时达到 巅峰，占总淋巴细胞的43.63%，较最初分离时NK细胞比例提升了5.59倍，而淋巴细胞总体 数量也增长近16倍，因此，可利用此方法为体外细胞免疫试验提供足够量的NK细胞表型的 细胞。NK细胞是固有免疫应答中一类十分重要的淋巴细胞，可通过选择性识别、杀伤低表达 MHCI类分子的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长和转移，有效地清除肿瘤进而在机体抗肿瘤 免疫和炎症反应中发挥关键性作用。静止NK细胞具有一定的杀伤活性，若NK细胞的有效活 化，可显著增强其对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究尝试了一种体外显著提高猪NK细胞的诱 导培养方法，可以为抗肿瘤免疫及其机制研究提供足够量的效应细胞，也可以为病原微生 物引起的体外细胞免疫和免疫逃逸研究提供良好的研究思路。
[0135] 试验例3扩增倍数试验
[0136] 按照实施例1、实施例8和对照例5-6方法制备CIK细胞，并且分别在制备的第5d进 行细胞取样，进行细胞计数(台盼蓝染色法），计算CIK细胞的扩增倍数，结果见表1。
[0137] 表1实验组和对照组的扩增倍数
[0139] 从表中可以看出，本发明实施例8的制备方法可显著提高CIK细胞的扩增倍数，由 此得出，在本发明在完全培养基中加入由磷酯酰丝氨酸、沙苑子提取物、威灵仙提取物和胆 固醇棕榈酸酯组成的混合物可显著提高干细胞的扩增倍数，但当以上成分发生变化，或者 省略某一成分后，扩增倍数显著降低。
[0140] 试验例4细胞活力检测
[0141] 以实施例1、6、制备的CIK细胞为实验1-2组，以对照例3-4制备的CIK细胞为对照1-2组。各实验组和对照组的CIK细胞分别在12h、24h、48h和96h小时进入试验程序，调整CIK细 胞的密度均为lX10 6cells/mL。按细胞悬液:0.4%台盼蓝= 3:lv:v充分混匀，取20yL细胞 悬液加入细胞计数板中，用台盼蓝拒染法检测细胞活力，结果如表2所示。
[0142] 表2实验组和对照组细胞活力结果
[0144] 注："一"表示没有活性。
[0145] 由表2可知，实验2组制备的CIK细胞要实验1组和对照1-2组的CIK细胞活力高，可 保证CIK细胞放置96h后，细胞活力人保持在65%以上；由此得出，本发明提供的制备方法 中，在完全培养基中加入甲壳素、聚甲基丙烯酸甲酯、氧化铁、多聚谷氨酸和阿拉伯胶可将 CIK细胞的活性保持在96h内。当其中一个成分发生变化或减少，CIK细胞的活力显著降低。
[0146] 试验例5细胞毒活性的测定
[0147] 取对数生长期的低分化胃腺癌细胞株(BGC-823)细胞作为靶细胞，并重悬靶细胞 浓度为1 X 1 〇5/mL、5 X 104/mL、2.5 X 104/mL，每孔1 OOyL铺于96孔平底板中，置于37 °C、C〇2体 积浓度为5%的环境中培养，靶细胞培养24h后将实验1-2组和对照1-2组的CIK细胞重悬为1 X 106/mL加入96孔板中，使每孔内效应细胞与靶细胞的比例分别为10:1、20:1和40:1，各浓 度设4个复孔，并设未与肿瘤靶细胞反应的各组CIK细胞为效应细胞空白对照，未与CIK反应 的各浓度BGC-823为靶细胞的空白对照。培养48h后，每孔加入浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT) 20yL，继续培养4h，翻板弃去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMS0)溶液100yL，于570nm处测定 吸光度A值，计算杀伤率。
[0148] 其中，实验1组采用实施例1的方法进行培养，实验2组采用实施例3的方法进行培 养，对照1组采用对照例1的方法进行培养，对照2组采用对照例2的方法进行培养，各组CIK 细胞的细胞毒活性(杀伤率)如表3所示。
[0149] 表3实验组和对照组细胞杀伤率结果
[0151] 从表3中可以看出，CIK细胞不同效靶比(E:T)，实施例3的方法制备的第CIK细胞对 BGC-823的特异性杀伤率均显著高于的实验1组和对照1-2组，表明本发明在完全培养基中 加入由蒲公英、半枝莲、芡实和金银花组成的提取混合物可显著提高CIK细胞对肿瘤细胞的 细胞毒活性。
[0152] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤： S1:采用浓度为1.110ng/L的Percoll密度梯度离心法分离猪血液内的外周血淋巴细 胞，收集外周血淋巴细胞层，用PBS洗涤2次，备用； S2:向步骤S1分离的外周血淋巴细胞中按终浓度加入1000U/mL的IFN-γ和200-300ng/ mL的完全培养基，置于培养箱中培养24h后，按终浓度补加50ng/mL的⑶3和1000u/mL的IL-2;每2-3天添加完全培养基和IL-2，并保持完全培养基的终浓度为200-300ng/mL，IL-2的终 浓度为l〇〇〇u/mL，培养3-10天，制得CIK细胞。2. 如权利要求1所述的猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基为1640培 养液与胎牛血清组成的混合液、或KBM581无血清培养液。3. 如权利要求2所述的猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基为1640培 养液与胎牛血清组成的混合液，其中每毫升混合液中含有5 %的胎牛血清。4. 如权利要求2所述的猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括向完 全培养基中加入培养溶质。5. 如权利要求4所述猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述培养溶质包括提取混合 物，所述提取混合物是由如下重量份数的成分组成： 蒲公英提取物10-15 半枝莲提取物5-7.5 芡实提取物1.2-3.5 金银花提取物15-20。6. 如权利要求5所述的猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述提取混合物的制备方 法如下： a. 称取蒲公英、半枝莲、芡实和金银花，粉碎，加浓度为75 %的乙醇水溶液，回流提取三 次，第一次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的7倍，回流2小时，第 二次加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的5倍，回流2小时，第三次 加入乙醇水溶液的量为蒲公英、半枝莲、芡实和金银花总量的3倍，回流1小时，合并回流液， 过滤，滤液浓缩至稠膏； b. 向步骤a所得稠膏中加入2倍乙醇，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除去馏 分，再用浓度为30-60 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制得提 取混合物。7. 如权利要求4所述的猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述培养溶质还包括重量 份数为0.5-1.5份的甲壳素、0.1-0.3份的聚甲基丙烯酸甲酯、0.4-0.7份的氧化铁、5-10份 的多聚谷氨酸和1-3份的阿拉伯胶。8. 如权利要求4所述的猪CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述培养溶质还包括重量 份数为2-5份的磷酯酰丝氨酸、1-2份的沙苑子提取物、5-10份的威灵仙提取物和1-3份的胆 固醇棕榈酸酯。9. 一种用于提高猪CIK细胞增殖力的组合物，其特征在于，所述组合物是由如下重量份 数的成分组成： 磷酯酰丝氨酸2-5 沙苑子提取物1-2 威灵仙提取物5-10 胆固醇棕榈酸酯1-3。10. -种权利要求9所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步 骤： 1) 称取沙苑子粉碎，加水煎煮2次，第一次加入水的量为沙苑子重量的7倍，煎煮3小时， 第二次加入水的量为沙苑子重量的5倍，煎煮2小时，合并煎煮液，过滤，向滤液中加入乙醇， 使乙醇的浓度达到53%，静置，过滤，收集滤液，浓缩，喷雾干燥，制得沙苑子提取物； 2) 称取威灵仙粉碎，加浓度为50%的乙醇水溶液，回流提取两次，第一次加入乙醇水溶 液的量为威灵仙重量的7倍，回流2小时，第二次加入乙醇水溶液的量为为威灵仙重量的5 倍，回流2小时，合并回流液，过滤，滤液浓缩至稠膏； 3) 向步骤2)所得稠膏中加入2倍水，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，以水洗脱，除去馏 分，再用浓度为75-95 %的乙醇水溶液洗脱10个柱体积，收集馏分，浓缩，喷雾干燥，制得威 灵仙子提取物； 4) 将沙苑子提取物、威灵仙提取物与磷酯酰丝氨酸和胆固醇棕榈酸酯混合均匀，制得 组合物。
【文档编号】C12N5/0783GK105969730SQ201610590244
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月25日
【发明人】陆涛峰, 陈洪岩, 韩凌霞, 高彩霞
【申请人】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所