一种神经细胞保护方法
【专利摘要】本发明公开了一种神经细胞保护方法，属于生物医学工程领域。一种神经细胞保护方法，通过等离子体处理培养的神经细胞，研究发现采用小剂量短时间处理细胞后，可以起到有效的细胞保护作用。本发明首次提出了“等离子体的细胞保护”概念，并在体外首次证明了低剂量的等离子体处理能够有效的保护H2O2损伤的神经细胞，不仅为神经细胞损伤修复和退行性疾病的预防和治疗研究提供了新的思路和方法，而且其价格更为低廉，操作更为简单，具有进一步开展动物在体研究和临床研究的意义，同时具有广泛的临床应用前景。
【专利说明】
一种神经细胞保护方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种神经细胞保护方法，属于生物医学工程领域。
【背景技术】
[0002]脑血管疾病是危害人类生命与健康的常见病和多发病，是目前我国第一致死和致残疾病，存活者中50%_70%病人遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重的负担。越来越多的资料证明，脑内特定部位神经元发生不可逆退变和丢失是引起神经系统疾病的重要原因。其诱发机制已有多种假说，如神经递质失衡学说，线粒体功能障碍学说、兴奋性神经毒性学说、异常蛋白聚积学说、基因突变、炎症过程、免疫异常及细胞凋亡学说等。在这些假说中，氧化应激及活性氧(reactive oxygen species，R0S)在细胞内产生和清除异常，与其他几种机制都有着直接或间接的关系，对神经元的损伤起着重要的调控作用。当ROS的生成增加或清除减少，或对氧化修饰的大分子修复减少时，氧化应激就会发生。ROS在细胞信号传导中扮演了重要角色，参与多种生理和病理过程。
[0003]过氧化氢(H2O2)是体内代谢的产物，同时也是一种主要的ROS来源，在诱导神经元细胞的损伤乃至死亡中起了关键作用。H2O2造成的细胞氧化损伤已成为研究神经细胞氧化损伤的重要方法之一。SH-SY5Y细胞是来源于1970年建立的神经母细胞瘤患者的转移骨瘤灶细胞SK-N-SH经三次克隆后的亚系(SK-N-SH4SH-SY4SH-SY5—SH-SY5Y)。该细胞显示中等水平的多巴胺-β_羟基酶活性，细胞分化程度较低，细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似，并具有明显的轴突。SH-SY5Y细胞对H2O2诱导氧化应激具有高度敏感性，H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型被广泛应用于氧化应激诱导的神经细胞变性凋亡的研究。所以本研究采用人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞作为体外神经元模型。
[0004]近年来，低温等离子体技术在生物医学领域的应用成为一个新兴的研究热点。等离子体是被激发电离的气体，由大量自由电子和离子及少量未电离的气体分子和原子组成，且在整体上表现为近似于电中性。在实验室中，等离子体通过高压高频电离气体产生，其温度可被控制在室温(低温)，含有大量的02—、Ν0—及Ν3—等活性离子，其应用主要集中在肿瘤细胞凋亡和创伤修复方面。关于等离子体对神经细胞的保护作用，至今未有报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种采用等离子体技术处理细胞的神经细胞保护方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]—种神经细胞保护方法，用等离子体对神经细胞进行0.5-5秒处理，处理时使用纯He气体，电源为10-20kV，20-50kHz，正弦交流电源，等离子体的喷嘴距离细胞培养板底面的距离为20_60mm。
[0008]所述神经细胞保护方法，优选用等离子体对神经细胞进行0.5-5秒处理，处理时使用纯He气体，电源为13-15kV，20-40kHz，正弦交流电源，等离子体的喷嘴距离细胞培养板底面的距离为30_50mm。
[0009]所述神经细胞保护方法，最优选用等离子体对神经细胞进行0.5-5秒处理，处理时使用纯He气体，电源为13.4-13.6kV，30kHz，交流电压电压信号，等离子体的喷嘴距离细胞培养板底面的距离为40mm。
[0010]本发明通过等离子体处理培养的神经细胞，研究发现采用小剂量短时间处理细胞后，可以起到有效的细胞保护作用。处理的剂量取决于处理时间、等离子体强度和喷嘴与细胞之间的距离。这些条件可以根据实际操作情况在一定范围内进行调整，比如等离子体强度增大时，处理时间可以略微缩短;喷嘴距细胞的距离缩短时，等离子体强度可以降低等。
[0011]所述神经细胞包括但不限于SH-SY5Y细胞、HT-22细胞，PC-12细胞株以及原代神经元细胞。
[0012]所述等离子体为低温等离子体。等离子体被视为除固态、液态、气态之外物质的第四态，它由原子或分子电离后的非束缚态电子和粒子聚集而成，宏观上呈电中性。在宇宙中有90%以上的物质都是以等离子体的状态存在的，如地球周围的电离层、太阳、星云、极光，人们日常生活中常见的日光灯、等离子体电视、婴儿尿布表面的防水涂层等。在等离子体中，等离子体的温度取决于离子温度Ti。等离子体按温度分类:Ti > 104K时称为高温等离子体，Ti < 104K时则称为低温等离子体。而低温等离子体又分为热等离子体(Ti > 103K)和冷等离子体(Ti < 103K)，前者电子温度和离子温度相差很小而且接近中性粒子温度，也称为平衡等离子体，如电弧等离子体;后者电子温度比离子温度高很多，也称为非平衡或非热等离子体，如辉光放电、电晕放电和介质阻挡放电等离子体。等离子体通常处于高度非热力学平衡状态。
[0013]本发明研究使用的低温等离子体由北京理工大学提供，为同轴共面DBD放电装置，参见Lijuan Liu等人在2014年发表的文章“Electrical characteristics and format1nmechanism of atmospheric pressure plasma jet(大气压等离子体射流的电学特性和形成机制)”，Applied Physics Letters 104,244108(2014) ;do1: 10.1063/1.4884939，文章链接为http://dx.do1.0rg/10.1063/1.4884939。在本发明中将介质管的尺寸更换为内径为1_，外径2_，两个电极由宽度为3mm的金属铝箔缠绕而成，左边的电极为功率电极，驱动电源为频率为f = 30kHz的交流电信号，右边的电极为接地电极，高纯氦从介质管左端以固定流量流入。除此以外，其他能够提供本发明参数条件的低温等离子体装置均可以实现本发明目的。
[0014]本发明所述神经细胞保护是指减轻氧化应激导致的神经细胞损伤及活性降低。
[0015]所述神经细胞损伤是由H2O2造成的细胞氧化损伤导致的细胞损伤及活性降低。
[0016]本发明研究发现，低温等离子体用于神经细胞保护的用途。尤指将低温等离子体用于保护氧化应激导致的神经细胞损伤的用途。
[0017]本发明首次发现了等离子体对神经细胞的保护作用，该发现与现有技术中用等离子体处理细胞从而引发细胞凋亡的应用完全相反。本研究发现对于神经细胞保护研究具有特殊意义，为神经细胞损伤修复和退行性疾病的预防和治疗研究提供了新的思路和方法。
[0018]本发明的优点是:本发明首次提出了“等离子体的细胞保护”概念，并在体外首次证明了低剂量的等离子体处理能够有效的保护H2O2损伤的神经细胞，不仅为神经细胞损伤修复和退行性疾病的预防和治疗研究提供了新的思路和方法，而且其价格更为低廉，操作更为简单，具有进一步开展动物在体研究和临床研究的意义，同时具有广泛的临床应用前景。
[0019]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步说明，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容进行的本领域等同替换，均属于本发明保护范围。
【附图说明】
[0020]图1是实施例1的等离子体处理神经细胞后的细胞存活率图。
[0021 ]图2是实施例1的等离子体处理神经细胞后的细胞形态图。
【具体实施方式】
[0022]实施例1:等离子体的神经细胞保护实验
[0023]一、实验材料
[0024]1、SH_SY5Y细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
[0025]2、1640培养基和FBS(Fetal Bovine Serum)购于Gibco公司。
[0026]3、等离子体装置:北京理工大学提供，为同轴共面DBD放电装置，介质管内径为1_，外径2mm,两个电极由宽度为3mm的金属招箔缠绕而成，左边的电极为功率电极，驱动电源为频率为f = 30kHz的交流电信号，右边的电极为接地电极，高纯氦从介质管左端以固定流量流入。
[0027]4、CCK_8细胞增殖与活性检测试剂盒:购于同仁化学研究所(CK04)。
[0028]二、实验方法
[0029]1、实验细胞的准备:
[0030](1)SH-SY5Y 细胞培养，培养条件:1640 培养基，15%FBS(Fetal Bovine Serum)，5% CO2培养箱37 °C培养。
[0031](2)取对数期SH-SY5Y细胞，胰酶消化后调整细胞悬液浓度至为2*105个/ml左右的加入96孔培养板中，每孔100μ1，37 °C、5 % CO2条件继续培养。
[0032]2、等离子体处理:
[0033](I)使用纯He气体，实验电源为13.6Kv，30ΚΗζ，正弦交流电源，等离子体的喷嘴距96孔细胞板底面的距离为40mm。
[0034](2)将96孔板进行等离子处理，按时间梯度分0.5S，IS，2S，5S，I OS，每个时间梯度处理3孔细胞。同时取I组细胞为对照组，仅进行氦气气流处理。
[0035](3)处理后将96孔板中的培养液吸出，细胞更换新鲜培养基继续培养。
[0036]3、出02损伤及00(-8检测:
[0037](I)培养18小时后，将96孔细胞板各孔细胞中的培养基更换为含有终浓度200μΜH2O2的培养基，处理Ih细胞。
[0038](2)每孔加入10μ1的CCK-8试剂。
[0039 ] (3) 37 cC、5 % CO2培养箱孵育 2_4h。
[0040] (4)酶标仪测定450nm处的OD值。
[0041 ] (5)计算各孔的细胞存活率。
[0042]4、细胞图片拍摄
[0043]将培养到18小时的各个分组的细胞，用蔡斯Ax1Observer Al倒置显微镜进行拍摄，放大倍数为10倍。
[0044]三、实验结果及分析
[0045]参照图1和图2所示，随着等离子体处理时间的增长，在0.5-5秒阶段，出02损伤的细胞存活率逐渐升高，细胞状态得到明显的改善。表明等离子体处理减轻了 H2O2造成的细胞氧化损伤导致的细胞损伤及活性降低，对细胞有显著的保护作用。
[0046]处理时间达到1s时，细胞可能已经受到了损伤，从而加剧了 H2O2的损伤程度。
【主权项】
1.一种神经细胞保护方法，其特征在于:用等离子体对神经细胞进行0.5-5秒处理，处理时使用纯He气体，电源为10-20kV，20-50kHz，正弦交流电源，等离子体的喷嘴距离细胞培养板底面的距离为20-60mm。2.根据权利要求1所述的一种神经细胞保护方法，其特征在于:用等离子体对神经细胞进行0.5-5秒处理，处理时使用纯He气体，电源为13-15kV，20-40kHz，正弦交流电源，等离子体的喷嘴距离细胞培养板底面的距离为30-50mm。3.根据权利要求2所述的一种神经细胞保护方法，其特征在于:用等离子体对神经细胞进行0.5-5秒处理，处理时使用纯He气体，电源为13.6kV, 30kHz，正弦交流电源，等离子体的喷嘴距离细胞培养板底面的距离为40mm。4.根据权利要求1所述的一种神经细胞保护方法，其特征在于:所述神经细胞为SH-SY5Y细胞、HT-22细胞，PC-12细胞株以及原代神经元细胞。5.根据权利要求4所述的一种神经细胞保护方法，其特征在于:所述神经细胞为SH-SY5Y细胞。6.根据权利要求1至5中任何一项所述的一种神经细胞保护方法，其特征在于:所述等离子体为低温等离子体。7.根据权利要求6所述的一种神经细胞保护方法，其特征在于:所述神经细胞保护是指减轻氧化应激导致的神经细胞损伤及活性降低。8.根据权利要求7所述一种神经细胞保护方法，其特征在于:所述神经细胞损伤及活性降低是由H2O2造成的细胞氧化损伤导致的细胞损伤及活性降低。9.低温等离子体用于神经细胞保护的用途。10.低温等离子体用于减轻氧化应激导致的神经细胞损伤的用途。
【文档编号】A61P25/00GK105969732SQ201511009739
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年12月29日
【发明人】闫旭, 欧阳吉庭, 袁芳, 乔雅隽
【申请人】北京市神经外科研究所, 北京理工大学