一种酶的固定化方法及应用

一种酶的固定化方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种简便的方法用于重组酶的固定化，该方法利用重组蛋白的组氨酸标签与金属离子亲和层析树脂专一性结合的特点，从而将酶固定于树脂上，制备固定化酶。以羰基还原酶固定化酶连续生产手性醇，大幅度提高了时空产率。
【专利说明】
一种酶的固定化方法及应用
技术领域
[0001]本发明属于酶固定化技术领域，具体涉及一种简便的方法用于具有组氨酸标签的重组酶的固定化，并提供了羰基还原酶固定化酶应用于生物催化生产手性醇的方法。
【背景技术】
[0002]生物催化过程具有典型的优势，如反应效率高、立体选择性高以及反应条件温和、有机溶剂用量少，对环境友好等，已经成为当前绿色生物制造的一大潮流，并越来越广泛地应用于化学品生产。然而，天然酶往往存在一些不足，如稳定性较差，生物催化反应后与产物等形成难以分离的混合体系，这些缺点不利于酶在工业上的应用。另外，酶成本高也是制约其应用的关键因素之一。利用酶的固定化技术可以重复利用酶，降低酶成本，增加酶的稳定性，产物易分离，因而广泛应用于食品工业、精细化学品工业、医药、废水处理等领域。
[0003]在酶的固定化研究中，合适的固定化载体是首要考虑的因素。除了传统的固定化载体，近年来发展了基于金属离子层析技术的固定化方法。该方法通过在固体材料上连接金属离子作为配体，与蛋白质的一些特异氨基酸如组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等产生亲和作用，从而将酶固定于载体上。目前应用于酶固定化的这些载体均是实验室自己制备，工艺较为复杂，重复性难以保证，应用范围有限。
[0004]随着重组蛋白纯化技术的发展，商品化的金属离子层析树脂也快速发展，其特异性、蛋白载量、耐受还原剂能力、稳定性、重复利用和再生能力等都得到了巨大改善。目前商品化的頂AC载体主要是N1-NTA和N1-1DA两种，前者是以琼脂糖或者其他基质共价连接NTA基团，NTA基团与Ni形成四价螯合物，并留下Ni两价用于与其他基团结合。同样作用的还有IDA基团(亚氨基二乙酸)，但NTA相对比较耐还原剂，因此使用较多。
[0005]以商品化镍离子亲和层析树脂直接用于具有组氨酸标签重组酶的固定化更加简便，易获得，重复性高，低成本和高效。该固定化方法可将重组蛋白的粗酶液直接与固定化材料结合，无须纯化酶，且固定化材料可以反复再生利用，节约成本。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种固定化酶的方法及应用，具体来说，利用重组酶蛋白具有组氨酸标签的特点，与金属亲和层析树脂结合，从而将酶固定于树脂上，制备固定化酶。同时，本发明还提供了羰基还原酶固定化酶在生物催化中的应用。
[0007]本发明的技术方案详述如下:
[0008]以具有组氨酸标签的重组酶酶液与金属离子亲和层析树脂混合，使酶与树脂充分结合，弃去酶液，得到固定化酶。
[0009]所述具有组氨酸标签的重组酶包括在N-端，或者在C-端，或者在这两端均有组氨酸的酶，组氨酸的数量为6?1个。
[0010]所述具有组氨酸标签的重组酶可以与金属离子亲和层析树脂专一性结合，因此本发明采用纯酶或者粗酶液能达到同样的效果。
[0011]所述的金属离子亲和层析树脂为:Ni2+、Co2+、Cu2+等金属离子与琼脂糖交联而成的亲和树脂，可以与具有组氨酸标签的酶共价结合，优选N1-NTA或者N1-1DA。
[0012]所述的结合条件优选为4?25°C，50?100rpm，0.5?5h。
[0013]本发明还提供了羰基还原酶ChKRED20固定化酶在生物催化中的应用。
[0014]羰基还原酶ChKRED20固定化酶的生物催化体系为:
[0015]缓冲液、异丙醇、NAD+、固定化酶和底物。
[0016]缓冲液为磷酸钾缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。磷酸钾(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾)缓冲液 100mM，pH 7.0?8.0c3Tris-HCl缓冲液为25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0。
[0017]异丙醇浓度10%?80% (v/v)。
[0018]NAD+浓度0.2 ?0.5g/l。
[0019]固定化酶酶量，指含有的目标酶(羰基还原酶0110^020)纯酶量，浓度1?1(^/1。
[0020]底物溶解于异丙醇中，优选终浓度10?400g/l。
[0021]优选反应条件为30?50°C。
[0022]本发明的有益效果:
[0023](I)以金属离子亲和层析树脂直接用于具有组氨酸标签重组酶的固定化更加简便，低成本和高效。该固定化方法可将重组蛋白的粗酶液直接与固定化材料结合，无须纯化酶。与传统固定化方法相比，该方法所用的固定化材料可以反复再生利用，节约成本。且金属离子层析树脂可以直接购买、易获得，重复性好，易于推广使用。
[0024](2)本发明首次以商品化N1-NTA或N1-1DA为载体用于羰基还原酶的固定化，并连续反应制备手性醇，大幅度提尚了时空广率。
【附图说明】
[0025]附图为固定床连续反应装置示意图
【具体实施方式】
[0026]以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
[0027 ] 实施例1羰基还原酶ChKRED20固定化酶的制备
[0028]羰基还原酶ChKRED20(NCBI登录号:KC342020)重组菌的构建方法、异源表达、酶纯化等为本领域常规方法。在该酶基因的两端分别加入酶切位点为EcoR I和Sal I，连入同样双酶切后的pET 28a( + )载体片段，得到重组质粒pET 28a_ChKRED20，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌。该基因在大肠杆菌中异源表达后的酶在N-端具有6个组氨酸，构成了组氨酸标签，可以与金属亲和树脂结合。
[0029]羰基还原酶ChKRED20的诱导表达:挑取重组菌单克隆至LB(含卡那霉素50yg/ml)培养基中，37°C、200rpm，培养16h作为种子液，再以1%的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37 °C、200rpm，培养3h，加入IPTG诱导(终浓度为0.2mM)，30 °C继续培养至24h。离心(8000印111，4°(:，101^11)收集菌体，生理盐水洗涤(0.8%，《八)洗涤2次，离心，获得湿菌体。
[0030]将上述获得的湿菌体重悬于缓冲液中(1mM Tris，300mM NaCl，1mM咪唑，pH8.0)，经高压均质机破碎后，冷冻离心(12000rpm，4°C，20min)，得到的上清液即为粗酶液。粗酶液以镍亲和层析树脂纯化，得到纯酶。蛋白纯化过程为本领域的一般方法。
[0031]纯化蛋白所用的缓冲液如下。
[0032]结合液:10mMTris,300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)
[0033]漂洗液:10mMTris,300mM NaCl，20mM咪唑(ρΗ8.0)
[0034]洗脱液:10mMTris，300mM NaCl，250mM咪唑(ρΗ8.0)
[0035]将洗脱得到的ChKRED20酶液进行2次透析，第一次透析缓冲液为:25mM Tris，50mMNaCl，2mM DTT ,ImM EDTA，pH8.0，4°C，lOOrpm，12h。第二次透析的缓冲液为 25mM Tris，50mMNaCl，pH8.0，4°C，100rpm，12h。
[0036]将透析后得到的纯酶液(浓度4.25mg/ml)50ml与用缓冲液平衡的5mlN1-NTA树脂(Genscript，南京金斯瑞生物科技有限公司)混合，4°C，10rpm结合3h。树脂的平衡的缓冲液组分为:1mM Tris，300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)。之后弃去酶液，得到固定化酶。测定酶液中残余酶浓度为0.85mg/ml，因此计算出结合的酶量为17Omg。
[0037]上述固定化酶用20ml异丙醇溶液平衡固定化酶30min，异丙醇浓度为20%，v/v，配置于缓冲液中，缓冲液为25mM Tris、50mM NaCl，pH 8.0。
[0038]由于羰基还原酶ChKRED20具有6个组氨酸标签，可以N1-NTA专一性结合，因此本发明采用粗酶液与N1-NTA树脂结合可以达到同样的效果。
[0039]实施例2羰基还原酶ChKRED20固定化酶与纯酶生物催化效率的比较
[0040](I)纯酶的反应体系:磷酸钾缓冲液中(10mM，pH 7.0)包含以下组分，1 % (v/v)异丙醇，0.2g/l NAD+，2g/l ChKRED20纯酶以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，浓度100g/lo4(TC，200rpmo
[0041](2)固定化酶的反应体系:固定化酶的制备方法同实施例1。固定化酶2g/l(该浓度指的是固定化酶中含有的目标酶量)，其余条件同纯酶反应体系。
[0042]反应初期的催化效率两者无明显差别(反应时间Ih，转化率45%左右)，随着时间的延长，固定化酶的催化效率比纯酶高。反应时间为14h时，固定化酶的转化率为98 %，而纯酶的转化率只有94%。因此，固定化酶可以忍受较高浓度的底物，其在生物催化体系中的失活速度更慢，从而表现出在相同时间内更高的转化率。
[0043]以上生物催化反应得到的产物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0044]实施例3羰基还原酶ChKRED20固定化酶催化不同浓度的底物
[0045]固定化酶制备时以粗酶液代替纯酶液，其余同实施例1。
[0046]反应体系:磷酸钾缓冲液中(100mM，pH7.0)，10% (v/v)异丙醇，0.2g/l NAD+，5g/I ChKRED20固定化酶(含有的目标酶量)，以及底物2-氯-1 - (3，4-二氟苯基)乙酮。反应条件为 40°C，200rpm。
[0047]底物浓度为50g/l，完全转化(转化率>99%)需要的时间为6h;浓度为100g/l，完全转化需要的时间为1h;底物浓度为150g/l，完全转化的时间为24h。时空产率(Space timeyield)在底物浓度为100g/l最高，为10g/(l.h)。当底物浓度继续增加到200g/l，24h内转化率为92%。
[0048]以上生物催化反应得到的产物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0049]实施例4羰基还原酶ChKRED20固定化酶单批次生物催化
[0050]固定化酶的制备方法同实施例1。
[0051 ] (I)底物为3，5双三氟甲基苯乙酮
[0052]反应体系:磷酸钾缓冲液中(100mM，pH 7.0)，40% (v/v)异丙醇，0.2g/l NADMg/I ChKRED20固定化酶(含有的目标酶量)，以及底物3，5双三氟甲基苯乙酮，浓度400g/l。反应条件:30 °C，200rpm，24h。
[0053]将单次反应结束后的固定化酶回收，再次用于下一轮生物催化反应。前4轮反应的转化率>95%，第5轮反应的转化率为94% ;第6轮反应的转化率为92%。
[0054]上述生物催化反应得到产物为(R)-3，5_双三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%。
[0055](2)底物为2-氯-1-(3，4_ 二氟苯基)乙酮
[0056]反应体系:磷酸钾缓冲液中(100mM，pH7.0)，10% (v/v)异丙醇，0.2g/l of NAD+，5g/l ChKRED20固定化酶(含有的目标酶量)，以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，浓度150g/l。反应条件:40°C，200rpm，24h。
[0057]将单次反应结束后的固定化酶回收，再次用于下一轮生物催化反应。在前4批次反应中，反应时间为1h就能达到转化率99%以上；固定化酶重复利用8批次，其活力仍能保持90%以上，展示了良好的催化能力和稳定性，具有连续生物催化的潜力。
[0058]以上生物催化反应得到的产物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0059]实施例5羰基还原酶ChKRED20以N1-1DA载体制备固定化酶
[0060]羰基还原酶ChKRED20酶的制备方法同实施例1。将得到的纯酶液(浓度4.25mg/ml)50ml与用缓冲液平衡的5ml N1-1DA树脂(品牌为BBI)混合，4°C，10rpm结合3h。树脂的平衡的缓冲液组分为:1mM Tris,300mM NaCl，1mM咪唑(pH8.0)。之后弃去酶液，得到固定化酶。测定酶液中残余酶浓度为0.73mg/ml，因此计算出结合的酶量为176mg。
[0061]反应体系为:磷酸钾缓冲液中(100mM，pH 7.0)，40% (v/v)异丙醇，0.2g/l NAD+，固定化酶2g/l (含有的目标酶量)，以及底物3，5双三氟甲基苯乙酮，浓度10(^/1。30°(:，200rpm。反应时间15h，转化率99.8%，得到产物为(R)-3，5-双三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%0
[0062]实施例6具有8个组氨酸标签的羰基还原酶ChKRED20固定化酶生物催化
[0063]利用定点突变的方法在羰基还原酶ChKRED20的N-端6个组氨酸之后再突变2个氨基酸为组氨酸，得到8个组氨酸标签的酶ChKRED20-His 8。
[0064]羰基还原酶ChKRED20_His8异源表达、固定化酶的制备方法同实施例1。反应体系为:磷酸钾缓冲液中(10mM，pH 7.0)，10 % (v/v)异丙醇，0.2g/l NAD+，固定化酶2g/l (含有的目标酶量)，以及底物2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，浓度lOOg/ljOt:，200rpm，24h。反应时间18h，转化率99%，得到产物(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇，ee值>99%。
[0065]实施例7羰基还原酶ChKRED20固定化酶填充床反应器连续生物催化
[0066]填充床反应器的示意图如附图所示，固定化酶置于反应器底部，底物反应液通过栗从上端进入，产物混合物从下端流出。该装置通过夹套控温，使床层维持恒定的温度。
[0067]底物反应液为:高浓度底物(溶解于异丙醇中，占总反应液体积的70%)，NAD+(0.2g/1)，缓冲液(Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0)。反应体系中加入NiS〇4、DTT等，可以提高填充床反应器反应体系的稳定性。
[0068]填充床连续反应中，缓冲液均为Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0，以下实施例相同。
[0069]产物混合物为:高浓度产物(溶解于异丙醇)，NAD+，缓冲液以及生成的丙酮和未完全转化的少量底物。
[0070](I)底物为3，5_双三氟甲基苯乙酮，浓度为100g/l，填充床固定化酶酶量160mg(含有的目标酶量)，固定化酶体积4.5ml，反应温度40°C。反应液组分为底物溶解于异丙醇中(占70 %体积)，NAD+ (0.2g/1)，缓冲液(占30 %体积)。
[0071]时空产率(Space Time Yield，STY)又称时空收率或时空得率。指在给定反应条件下，单位时间内，单位体积(或质量)催化剂能获得某一产物量。它是衡量催化剂活性大小及反应器装置生产能力的标志之一。
[0072]时空产率=产物量/(床层体积*时间)。
[0073]流速为0.5ml/min时，转化率99.7%,计算的时空产率为664g/( 1.h)。流速为
0.8ml/min时，转化率99.3%，计算的时空产率为1059g/(l.h)。流速为0.9ml/min时，转化率95 %，计算的时空产率为1140g/(l.h)o时空效率为自由酶生物催化的100倍。
[0074]以流速为0.8ml/min进行填充床生物催化反应，连续反应72h，转化率保持>99%。
[0075]以上生物催化反应得到的产物为(R)-3，5_双三氟甲基苯乙醇，ee值〉99.9%。
[0076](2)底物为2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙酮，浓度5(^/1，填充床固定化酶酶量16011^(含有的目标酶量)，固定化酶体积4.5ml，反应温度40°C。反应液组分为:底物溶解于异丙醇中(占70 %体积)，NAD+ (0.2g/1)，缓冲液(占30 %体积)。
[0077]流速为0.08ml/min时，转化率99.1%,计算的时空产率为53g/( 1.h)。流速为
0.09ml/min时，转化率99.1 %，计算的时空产率为60g/(l.h)。流速为0.10ml/min时，转化率90%，计算的时空产率为60g/(l.h)。时空产率为自由酶生物催化的5倍以上。
[0078]以流速为0.09ml/min进行填充床生物催化反应，连续反应24h，转化率>98%。
[0079]以上生物催化反应得到的产物(S)-2_氯-1-(3，4_二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
[0080](3)底物为4-氯乙酰乙酸乙酯，浓度320g/l，填充床固定化酶酶量160mg(含有的目标酶量)，固定化酶体积4.5ml，反应温度40 0C。
[0081]&.反应液组分为:底物溶解于异丙醇中(占70%体积)，嫩0+(0.28/1)，缓冲液(占30%体积)。
[0082]流速为0.6ml/min时，转化率99%，ee值>99%，计算的时空产率为2534g/(l.h)。
[0083]b.反应液组分为:底物溶解于异丙醇中(占70%体积)，NAD+(0.2g/l)，5mM NiSO4，2mM DTT，缓冲液(占30 %体积)。
[0084]流速为0.6ml/min时，转化率99%，ee值>99%，计算的时空产率为2534g/(l.h)。时空产率为自由酶催化的8倍左右。
[0085]以上生物催化反应得到的产物(S)-4_氯-3-轻基丁酸乙酯，ee值〉99%。
[0086]实施例8突变体M135固定化酶填充床反应器连续生物催化
[0087]突变体酶为羰基还原酶ChKRED20耐热性突变体M135(Appl Microb1lB1technol.2016.100(8): 3567-3575)。固定化酶的制备方法同实施例1。
[0088]底物为2-氯-l-(3，4-二氟苯基)乙酮，浓度50g/l，填充床固定化酶酶量130mg(含有的目标酶量)，固定化酶体积4ml，反应温度50°C。反应液组分为:底物溶解于异丙醇中(占70 % 体积)，NAD+ (0.2g/l)，缓冲液(占 30 %体积)。缓冲液为Tris 25mM，NaCl 50mM，pH8.0。
[0089]流速为0.12ml/min时，转化率99%，计算的时空产率为90g/(l.h)。连续反应30h，转化率保持>98%。
[0090]以上生物催化反应得到的产物(S)-2_氯-1-(3，4_ 二氟苯基)乙醇，ee值〉99%。
【主权项】
1.一种酶的固定化方法，其特征是利用重组酶蛋白具有组氨酸标签的特点，与金属亲和层析树脂专一性结合，从而将酶固定于树脂上，制备固定化酶。2.权利要求1所述的酶的固定化方法在羰基还原酶固定化酶生产手性醇中的应用。3.权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是固定化酶的制备步骤为:重组酶酶液与金属离子亲和层析树脂混合，使酶与树脂充分接触后进行结合，弃去酶液，得到固定化酶。4.权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是具有组氨酸标签的重组酶包括在N-端，或者在C-端，或者在这两端均有组氨酸的酶，组氨酸的数量为6?10个。5.权利要求1所述的酶的固定化方法，其特征是金属离子亲和层析树脂为:Ni2+、Co2+、Cu2+等金属离子与琼脂糖交联而成的亲和树脂，可以与具有组氨酸标签的酶共价结合。6.权利要求1和3所述的结合条件为4?25°C，50?100rpm，0.5?5h。7.权利要求3所述的酶的固定化方法，其特征是重组酶酶液为纯酶或者粗酶液。8.权利要求5所述的金属离子亲和层析树脂为N1-NTA或者N1-1DA。
【文档编号】C12N11/04GK105969757SQ201610395274
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】吴中柳, 刘艳
【申请人】中国科学院成都生物研究所