靶向沉默FOXG1的shRNA的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默FOXG1的shRNA，首先是根据人源的FOXG1的CDS区序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到PLL3.7载体上，连接转化，挑取阳性克隆鉴定。鉴定正确后，将提取的质粒送去进行测序，测序比对正确之后转染细胞并进行FOXG1沉默效率的检测。设计合成了能够靶向人源FOXG1的19bp的shRNA，序列为GGACCAGACTGTAAGTGAA。
【专利说明】
靶向沉默F0XG1的shRNA
技术领域
[0001]本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默F0XG1的 shRNA〇
【背景技术】
[0002] F0XG1 又叫你 W，5rai/3 Facior 目前统一命名，在小鼠 中称为Foxgl，在人类中称为F0XG1，在其他中称为FoxGl，它是一个在进化上高度保守的转 录抑制因子，属于叉头框转录因子家族，主要表达在大脑中。F0XG1由DNA结合结构域和转录 调节区组成，该基因的转录抑制作用主要是通过其JBD结合结构域（JARIDIB-binding domain)和Groucho结合结构域(Groucho-binding domain)与其它转录共阻遏物结合，进而 调苄基因的转录。
[0003] 自发现以来，F0XG1在脑中的作用被广泛的研究，近年来的研究表明，在胚胎期， Foxgl在嘴侧神经管和端脑神经上皮的祖细胞中有表达;在成年期，Foxgl主要分布在由端 脑发育而来的大脑皮层、海马、嗅球和基底神经节。它能通过调节增殖分化来调节端脑的发 育以及端脑的神经生，它还能参与海马的神经发生以及视神经的发育。随着对F0XG1家族的 了解，F0XG1在肿瘤中的作用也逐渐被重视起来，在肿瘤中能调节增殖，来促进肿瘤的发生。 在人类胶质瘤中，F0XG1的高表达预示着肿瘤具有高的浸润能力和生长能力，这就暗示了在 医学上更加难以治愈，所以特异性的沉默F0XG1对于其在疾病中作用研究至关重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是合成特定的能够靶向沉默F0XG1的shRNA，并构建其表达载体。
[0005] 本发明中所需要构建的主要是F0XG1的沉默表达载体。核心沉默表达载体构建分 为两个大的步骤，首先是根据人源的F0XG1的CDS区序列设计出19bp的目的片段，合成的目 的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到PLL3.7载体上，连接转化，挑取阳性克 隆鉴定。鉴定正确后，将提取的质粒送去进行测序，测序比对正确之后转染细胞并进行 F0XG1沉默效率的检测。
[0006] 本发明中设计合成了能够靶向人源F0XG1的19bp的shRNA，序列为 GGACCAGACTGTAAGTGAA 能够特异性沉默F0XG1的表达载体的构建包括以下步骤： 第一步，序列设计 根据人源F0XG1基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别 F0XG1的沉默序列。
[0007] 第二步，对靶序列进行退火成双链以及对PLL3.7载体进行酶切 将核心载体PLL3.7进行双酶切后，利用胶回收试剂盒回收线性化载体，为下一步的实 验准备。
[0008] 将合成的靶序列利用退火buffer溶解之后，利用PCR仪进行退火，95°C/4min，72 C/10min，之后降温到4 C。
[0009] 第三步，将合成的靶序列以及核心载体进行连接 将上一步中的两个产物在T4连接酶的作用下进行连接，经转化、提取等步骤获得沉默 载体。
[0010] 第四步，沉默祀蛋白效率的检测 经转染细胞后提取蛋白，利用western blot等试验手段检测沉默效率。沉默F0XG1之 后，利用CCK8检测细胞的增殖，实验结果显示，沉默F0XG1之后能抑制细胞的增殖。
[0011] 本发明沉默F0XG1之后能抑制U87MG胶质瘤细胞的增殖，为更加深入的研究F0XG1 在肿瘤中的功能以及F0XG1在选择、制备治疗肿瘤药物提供了有效的手段。
[0012]
【附图说明】
[0013] 图1为PLL3.7载体双酶切凝胶电泳图； 图2为F0XG1 shRNA菌液PCR结果凝胶电泳图，框中为阳性结果； 图3为将阳性克隆进行质粒提取，之后进行双酶切验证，框中为阳性结果； 图4为外源检测FOXGlshRNA沉默效率图； 图5为沉默F0XG1之后影响细胞的增殖图。
[0014] 本发明中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默F0XG1，同时也为构建 FOXGl-shRNA提供关键的序列片段。F0XG1是转录因子，在神经发生以及肿瘤中都有很重要 的作用。经研究表明，F0XG1在肿瘤的生长以及肿瘤的进程中发挥一定的作用，构建成功的 载体，能够用来特异性的沉默F0XG1，沉默F0XG1能够降低肿瘤的转移潜能，所以能够为选 择、制备治疗肿瘤药物提供了理论基础。
【具体实施方式】
[0015] 实施例一：特异性沉默靶标蛋白F0XG1的表达载体构建 1、特异性沉默靶蛋白F0XG1的序列设计 (1)根据人源F0XG1基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计，设计的原 贝丨J: 19bp的特异性结合F0XG1的序列的GC含量为45%-55%，退火温度45°C-65°C，同时按照载 体的要求，第一个碱基必须为G。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选择特异性识别人 源F0XG1的序列。
[0016] (2)HpaI- GN18-TT-loop- 81NC-XhoI形式合成一段59bp序列，81NC为NG18的反向 互补，5 '端为Hpal酶切位点，3 '端为Xhol酶切位点。设计合成的特异性识别F0XG1的序列片 段为 GGACCAGACTGTAAGTGAA。
[0017] 2、特异性沉默靶蛋白F0XG1的序列的合成与储存 (1)将合成的两段Oligo利用退火buffer溶解至50 μΜ，各取100μ1混合。
[0018] (2)各取10μ1上述储存液，放在PCR管中，混匀放入PCR仪中，95 °C变性4min，72 °C 退火10min，之后可以放在4°C保存。
[0019] 3、F0XG1沉默载体的构建 (1)取lug PLL3.7载体，利用Hpal和Xhol进行双酶切，电泳，回收线性PLL3.7大片段【图 1】。
[0020] (2)连接和转化。将线性PLL3.7浓度稀释至160ng/l·!，将退火形成的DNA片段稀释成 合适的浓度，进行连接反应(Promega公司的T4 DNA连接酶）
16 °C过夜连接，将连接产物转化Stbl3感受态细胞，涂布在具有氨苄青霉素的LB平板 上。
[0021] (3)阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，试剂盒提取质粒，通过PCR以及 酶切鉴定阳性克隆【图2】【图3】。鉴定 3'，pLL3.7 test-R: 5 ' CCTGCTGGAATCTCGTGAA-3'。以U6启动子为测序引物，送长春库美基因 测序。
[0022] 实施例二： 沉默靶蛋白效率的检测 (1) 将control、F0XG1 shRNA分别与Flag-FOXGl表达载体通过PEI共同转染进入293T 细胞 (2) 提取细胞总蛋白，利用Western blot免疫印迹分析，转入F0XG1沉默载体后，F0XG1 表达量显著降低，α-Tubulin为内参【图4】。
[0023] 实施例三： 沉默F0XG1之后检测细胞的增殖，结果显示，沉默之后能抑制细胞的增殖。
[0024] 序列表 〈110>东北师范大学 〈120>靶向沉默F0XG1的shRNA <141> 2013-3-30 〈160>19 <210> 1 <211> 19 <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <221> misc_RNA 〈222> (1).··(19) 〈223> <400> 1 GGACCAGACTGTAAGTGAA 〇
【主权项】
1. 一种能够靶向人源F0XG1的序列，其特征是序列为： GGACCAGACTGTAAGTGAA 〇
【文档编号】C12N15/113GK105969771SQ201610361321
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】朱筱娟, 陈晶滢, 曹让娟, 何潇潇
【申请人】东北师范大学