抗草甘膦基因筛选方法、epsps突变基因和缺陷型菌株及应用

抗草甘膦基因筛选方法、epsps突变基因和缺陷型菌株及应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用，该筛选方法可对与草甘膦感受相关的基因，包括植物基因进行克隆，多方位加速诱变，高通量抗草甘膦性能筛选，从而快速进化出能高度抗草甘膦的基因。该筛选方法利用细菌生长繁殖快、易培养的特点，能够快速使植物和其他来源的基因进化成为具有草甘膦抗性的突变基因。
【专利说明】
抗草甘麟基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基 因和缺陷型菌株及应用。
【背景技术】
[0002] Glyphosate是由美国孟山都公司研发，是一种叶面喷施，广效，非选择性的系统性 草甘膦。其主要成分草甘膦发挥作用的途径是抑制植物体内莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽 草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)活性，使受害植株不能持续合成必需氨基酸进而影响植物正常 生长乃至死亡。
[0003] Glyphosate是一种广谱的草甘膦除草剂，对几乎所有植物都有杀伤性，现市场上 最常用的抗草甘膦基因为CP4基因，是孟山都公司从农杆菌中分离出的对草甘膦强抗性的 基因。植物可以通过转基因的方式获得这种抗性。因为能抗草甘膦的农作物为农业和环境 带来明显效益，含CP4基因的玉米、大豆品种在过去20年得到了大面积推广。但生产应用中 仍然不断需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的抗草甘膦作物品种。
[0004] 用基因编辑技术创造非转基因抗草甘膦植物最好要有能抗草甘膦的植物EPSPS基 因。以CP4为代表的的微生物EPSPS基因虽能提供草甘膦抗性，即使将这类基因用基因修饰 的方法转入植物，但因为来自不同物种，仍有转基因之嫌，难以得到社会普通大众的认同， 公众对这里转基因作物的认识有偏见，某种程度阻碍转基因技术的发展和普及。因此，打造 能高抗草甘膦的植物EPSPS基因是非转基因抗草甘膦农作物的一个关键。
[0005] 从理论上讲，植物本身的EPSPS基因可以用化学、辐射或其他方法进行诱变，在一 定的草甘膦压力下筛选具有抗性的植株。事实上，在多年大量使用草甘膦的情况下，一些杂 草已经进化了对草甘膦的抗性;其中多数为EPSPS基因的改变。但这些改变多为基因拷贝数 的增加，而且抗性不是很高，难于用在农作物上。农作物本身EPSPS基因也有突变产生草甘 膦抗性的例子，但抗性不如CP4。为创造能高抗草甘膦的非转基因农作物，继续诱变、筛选农 作物或其他植物EPSPS基因抗性基因势在必行。
[0006] 但是，现有的从农作物或其他植物中筛选具有草甘膦抗性的突变基因的方法需要 先对植株进行诱变处理得到大量的突变体植物，再对这些突变体植株进行抗性筛选，得到 具有草甘膦抗性的突变植株，通过对抗性植株的基因组检测分析，最后得到具有草甘膦抗 性的突变基因。由于植物生长的周期长，种植大量的突变体植株不仅耗费的时间长且需要 的土地面积也非常庞大。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供一种具有草甘膦抗性的突变基因的筛选方法，此筛选方法 能够快速地筛选得到来自植物的外源基因的突变基因，该筛选方法筛选得到的突变基因具 有草甘膦抗性。
[0008] 本发明的再一目在于提供一种突变基因，该突变基因由上述筛选方法筛选得到， 其具有草甘膦抗性。
[0009] 本发明的又一目在于提供上述突变基因的应用，以使得转化该突变基因的植物具 有草甘膦抗性。
[0010] 本发明的又一目在于提供一种用于筛选具有草甘膦抗性的突变基因的模型菌，此 模型菌不能表达EPSPS，也不具有裂解草甘膦的功能。
[0011] 本发明的又一目在于提供上述模型菌在测试植物来源的EPSPS基因的功能中的应 用。
[0012] 本发明的又一目在于提供上述模型菌在测试植物来源的EPSPS基因对草甘膦的抗 性中的应用。
[0013] 本发明的又一目在于提供上述模型菌在测试植物来源的突变体EPSPS基因对草甘 膦抗性中的应用。
[0014] 本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0015] -种抗草甘膦基因筛选方法，其包括：
[0016] 采用基因敲除技术敲除源菌株的干扰基因，得到缺陷型菌株，源菌株来自大肠杆 菌DH5a、TOP 10以及BL21中的一种，干扰基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，缺陷型菌株 为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株；
[0017] 先将外源EPSPS基因导入缺陷型菌株中，再经诱变处理后，得到含有外源EPSPS突 变基因的第一突变菌，外源EPSPS基因来自目的植物；
[0018] 或者先将外源EPSPS基因经突变处理，得到外源EPSPS突变基因，再将外源EPSPS突 变基因导入缺陷型菌株，得到第二突变菌；
[0019] 将第一突变菌或第二突变菌置于含有草甘膦的筛选培养基上进行筛选培养，得到 具有草甘膦抗性的单克隆抗性菌；
[0020] 对单克隆抗性菌进行测序验证，得到具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因。
[0021 ]本发明提供的抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用的有 益效果是：相对于现有的从植物中筛选具有草甘膦抗性的突变基因的筛选方法，本发明的 筛选方法通过构建EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株，再以该EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株为 宿主菌，将来自目的植物的外源EPSPS基因导入到该缺陷型菌株中，得到含有外源EPSPS突 变基因的突变菌即外源EPSPS基因突变体库，再从该外源EPSPS基因突变体库中筛选出具有 草甘膦抗性的EPSPS突变基因。由于细菌的繁殖速度快，体积小，因此，本发明的筛选方法克 服了现有筛选方法中存在的周期长、占地面积大的问题，使得本发明的筛选方法在定向筛 选出具有草甘膦抗性的EPSPS基因的周期短，占地面积非常小，周期短操作简单等特点。且 本发明的筛选方法以EPSPS和C-P Lyase缺陷型的菌株作为宿主菌，有效地排出了宿主菌本 身的EPSPS基因和C-P Lyase基因的突变而产生草甘膦抗性的情况，使得筛选出的结果更可 具科学性，更可靠。
【附图说明】
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。
[0023]图1为本发明实施例的pADV5载体结构图；
[0024]图2为本发明实施例的pKD46载体结构图；
[0025]图3为本发明实施例1的水稻EPSPS突变基因与野生型水稻EPSPS基因的序列比较 分析结果；
[0026]图4为本发明实施例2的大豆EPSPS突变基因与野生型大豆EPSPS基因的序列比较 分析结果。
【具体实施方式】
[0027] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产 品。
[0028] 下面对本发明的抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用进 行具体说明。
[0029] -种抗草甘膦基因筛选方法，其包括：
[0030] 步骤S1:构建缺陷型菌株
[0031] 采用基因敲除技术敲除源菌株的干扰基因，得到缺陷型菌株，源菌株来自大肠杆 菌DH5a、TOP 10以及BL21中的一种，干扰基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，缺陷型菌株 为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株。
[0032] 也就是说，EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株为大肠杆菌DH5a、T0P10以及BL21中的一 种经敲除EPSPS基因和C-P Lyase基因后得到的缺陷型菌株。该EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌 株的特点是:无法在不含氨基酸或蛋白的基础培养基也可称之为限制性培养基中生长，但 在导入外源EPSPS基因后能在只含糖的基础培养基上生长。
[0033]敲除源菌株也就是敲除野生型大肠杆菌的EPSPS基因和C-P Lyase基因的作用如 以下说明。
[0034]由于大肠杆菌的内源的EPSPS基因能够表达EPSPS5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成 酶(EPSPS)，且C-P Lyase基因也能够表达裂解C-P键的C-P裂解酶，该C-P裂解酶能够裂解草 甘膦。因此，如果以野生型的大肠杆菌作为宿主菌，在后续的诱变处理步骤中，宿主菌内源 的EPSPS基因和C-P Lyase基因也可能发生突变，产生具有抗草甘膦内源的EPSPS突变基因 和裂解能力加强的C-P Lyase突变基因，赋予宿主菌草甘膦抗性，导致无法明确筛选得到单 克隆抗性菌具有的草甘膦抗性是外源EPSP突变基因赋予的还是其内源的EPSPS突变基因的 和C-P Lyase突变基因赋予的。因此，在以大肠杆菌作为宿主菌时，需要敲除其内源的EPSPS 基因和C-P Lyase基因，确保其最终得到的单克隆抗性菌的草甘膦抗性是由外源EPSPS突变 基因赋予的，使得筛选的结果更科学、更合理、更可靠。
[0035]当然，敲除大肠杆菌的EPSPS基因和C-P Lyase基因的基因敲除技术很多，如例如 FRT法、pCas系统、利用pKD46系统或利用同源PCR片段直接敲除法等。在大肠杆菌基因组序 列信息清楚的情况下，采用上述方法均能够较容易地敲除其基因组上的EPSPS基因和C-P Lyase基因。
[0036] 步骤S2:构建外源EPSPS基因突变体库
[0037] 一种构建策略是，以缺陷型菌株作为宿主菌，先将外源EPSPS基因导入缺陷型菌株 中，再经诱变处理后，得到含有外源EPSPS突变基因的第一突变菌。其中，较佳地，诱变处理 为化学诱变处理或辐射诱变处理。化学诱变处理例如采用EMS或DES等化学诱变剂对第一突 变菌进行诱变处理，以使外源EPSPS基因随着宿主菌的增殖发生突变。
[0038]另一种构建策略是，先将外源EPSPS基因经突变处理，得到外源EPSPS突变基因，再 将外源EPSPS突变基因导入缺陷型菌株，得到第二突变菌。其中，突变处理是以外源EPSPS基 因为模板采用错配PCR法或DNA Shuff 1 ing法进行PCR得到的PCR产物即为外源EPSPS突变基 因。
[0039]需要说明的是，其中第一突变菌或第二突变菌均含有外源EPSPS突变基因，第一突 变菌或第二突变菌均为外源EPSPS基因突变体库。
[0040] 其中，术语"第一"、"第二"仅用于区分描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对 重要性。
[0041] 上述步骤所用的外源EPSPS基因来自目的植物，目的植物为水稻、大豆、小麦、玉 米、大麦、高粱、烟草、棉花、甘薯、杨树、马铃薯、白菜、甘蓝或青椒。在实际的筛选过程中，可 根据实际需求选择。
[0042] 步骤S3:抗性筛选
[0043]将在步骤S2中得到外源EPSPS基因突变体库第一突变菌或第二突变菌置于含有草 甘膦的筛选培养基上进行筛选培养，得到具有草甘膦抗性的单克隆抗性菌。需要说明的是， 该单克隆抗性菌也就是在筛选培养基上长出的菌落，也可以称之为阳性转化子。当然，阳性 转化子的数量的情况有多种，例如有一个阳性转化子或多个阳性转化子。
[0044]其中，筛选培养基为含有不同草甘膦浓度的M9基础培养基。
[0045] 步骤S4:测序验证
[0046]取在步骤S3中得到的单克隆抗性菌进行测序验证，得到具有草甘膦抗性的EPSPS 突变基因。
[0047] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0048] 实施例1
[0049] 本实施例以目的植物为水稻(Oryza sativa)、外源EPSPS基因为水稻EPSPS基因 (其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）、以采用同源PCR片段直接敲除法敲除野生型的大肠杆 菌DH5a中的EPSPS基因和C-P Lyase基因得到的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株为宿主菌为 例，来对本发明的筛选方法进行更详细的说明，本实施例所用引物名称及其核苷酸序列见 表1。
[0050] 第一步，采用同源PCR片段直接敲除大肠杆菌DH5a中的EPSPS基因和和C-P Lyase 基因。
[0051 ] 1.敲除大肠杆菌DH5a的c-p Lyase基因
[0052] (1)同源PCR片段扩增
[0053]用正向引物CPF2、反向引物CP5HA3(见表1)，以野生型的大肠杆菌DH5a为模板进行 PCR，胶回收，获得PCR产物，命名为CP5HA片段，长度为525bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.13 所示。
[0054]表1.本实施例所用引物及其核苷酸序列
[0057]用正向引物以CP3HA5为、反向引物CPR2，以大肠杆菌DH5a为模板进行PCR，胶回收， 获得PCR产物，命名CP3HA片段，长度为503bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.14所示。
[0058]用正向引物SPEC5，反向引物SPEC3，以含有如SEQIDN0.2所示的核苷酸序列的载 体(该载体命名为PCPSG7)为模板进行PCR，胶回收，获得PCR片段，命名为SPEC片段，长度为 900bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.15所示。
[0059] 用CPF2和CPR2为引物，以CP5HA片段，SPEC片段和CP3HA片段为模板进行PCR(在同 一反应体系中进行），胶回收，获得PCR产物，命名为CP5HA-SPEC-CP3HA片段，长度为1849bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示。其中，第1位~第525位为大肠杆菌PhnA基因 5末端及其 上游序列，第526位~第1346位的核苷酸序列为Spectinomycin抗性基因及其启动子，第 1347位~第1849位为大肠杆菌PhnH基因 3末端及其下游序列。
[0060] (2)热击转化
[0061 ]按常规方法制备得到大肠杆菌DH5a感受态细胞。将lOOyL大肠杆菌DH5a感受态细 胞与5yL CP5HA-SPEC-CP3HA片段轻柔混合，置于冰上10min，42°C热击90s，立即转入冰上 2min〇
[0062] 迅速加入lmL LB液体培养基(含50yg/mL的Spec(spectinomycin、奇放线菌素））， 在37°C培养lhr后涂布于LB固体培养基(含50yg/mL的Spec)上，在37°C过夜培养。
[0063]培养后的大肠杆菌DH5a利用正向引物SPE35和反向引物CPR0检测后，该菌株命名 为EDC，EDC为敲除C-P Lyase基因的大肠杆菌DH5a。
[0064] 2.敲除EDC(敲除C-P Lyase基因的大肠杆菌DH5a)的EPSPS基因
[0065] (1)同源PCR片段扩增
[0066]以野生型的大肠杆菌DH5a为模板，用正向引物EE5-1K和反向引物ES5HA3，进行 PCR，胶回收，获得PCR产物，命名为ES5HA片段，长度为1194bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。
[0067]以大肠杆菌DH5a为模板，用正向引物ES3HA5和反向引物EE3-1K进行PCR，胶回收， 获得PCR产物，命名为ES3HA片段，长度为1168bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.18所示。
[0068]用正向引物GM5L和反向GM3L，以含有如SEQIDN0.3所示的核苷酸序列的载体(该 载体命名为PCPSG5)为模板进行PCR，胶回收，获得PCR产物，命名为GM片段，长度为1050bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示。
[0069] 以EE5-1K和EE3-1K为引物，ES5HA片段，GM片段和ES3HA片段为模板进行PCR，胶回 收，获得PCR产物，命名为ES5HA-GM-ES3HA片段，长度为3322bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。其中，第1位~第1194位为大肠杆菌EPSPS基因上游序列，第1195位~第2154位 的核苷酸序列为庆大霉素抗性基因及其启动子，第2155位~第3322位为大肠杆菌EPSPS基 因下游序列。
[0070] (2)热击转化
[0071] 按常规方法制备得到EDC感受态细胞。将lOOyLEDC感受态细胞与5yL ES5HA-GM-ES3HA片段轻柔混合，置于冰上10min，42°C热击90s，立即转入冰上2min;迅速加入lmL LB液 体培养基，在37 °C培养lhr后涂布于含有Spec (50μg/ml)和Gm( 50μg/ml)的LB固体培养基(含 50μg/ml Spec和50μg/ml的Gm)上，在37°C过夜培养。
[0072] 以正向引物EE5-1K和GM3L、反向引物EE3-1K和ECES35U检测培养后的菌株，并将该 菌株命名为EDCE。EDCE为敲除EPSPS基因和C-P Lyase基因后的大肠杆菌DH5a，也就是EPSPS 和C-P Lyase缺陷型菌株。
[0073]当然，也可其他常规的敲击敲除方法例如采用pCas系统敲除大肠杆菌DH5a中的 EPSPS基因和C-P Lyase基因，或采用pKD46系统敲除大肠杆菌DH5a中的EPSPS基因和和C-P Lyase基因。
[0074]第二步，以在第一步步骤中得到的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作为宿主菌，将 来自水稻的EPSPS基因导入该宿主菌中，得到突变菌即水稻EPSPS基因突变体库。具体操作 如下。
[0075] 1.利用错配PCR法构建EPSP基因突变体库
[0076]采用常规方法将水稻EPSPS基因的mRNA反转录成cDNA并克隆到pADV5载体(其结构 如图1所示）。
[0077]用正向引物PV325和反向引物PV323,以连接有水稻EPSPS基因的pADV5载体模板进 行第一轮错配PCR，该PCR反应体系包括：25.3yL的H20、4yL的易错PCR MIX、4yL的易错PCR dNTP、4yL的MnCl2、0 · 8yL的PV325、0 · 8yL的PV323、0 · lyL的Taq酶、2yL的模板。该PCR反应程 序：95°C，30秒；60°C，30秒；72°C，2分钟；40个循环PCR产物经1 %琼脂糖电泳，然后切胶回 收，得到第一轮PCR产物。
[0078]以上述第一轮PCR产物为模板，用正向引物2M1H、反向引物2M1T，进行第二轮PCR。 PCR体系为：31 ·9yL的H20、2·5yL的DMS0、5yL的lOxPCR buffer、5yL的dNTP、4yL的MgCl2、0·5μ L的2M1H、0 · 5yL的2M1T、0 · lyL的Taq酶、0 · 5yL的模板。该PCR反应程序：95 °C，30秒；60°C，30 秒;72 °C，2分钟;60个循环
[0079] 对获得的PCR产物进行1%琼脂糖电泳，与目的条带大小（1.5kb)-致的条带进行 胶回收纯化，对纯化后产物进行Pacl和Sbfl双酶切，然后连接到经同样双酶切后的新的 PADV5载体上，获得连接产物。此步骤得到连接产物为携带有水稻EPSPS突变基因的pADV5载 体。
[0080] 当然，也可以采用DNA Shuffling法获得携带有水稻EPSPS突变基因的PADV5载体， 其具体操作如下。
[0081 ] DNA Shuffling法获得携带有水稻EPSPS基因的基因突变体的PADV5载体:①以水 稻EPSPS基因序列进行PCR扩增，扩增产物用1 %琼脂糖电泳，然后胶回收纯化;②对回收产 物用DNase酶进行消化，消化完后跑1.2%琼脂糖电泳，切下100bp、200bp或300bp大小的片 段做胶回收纯化;③以第②步中的胶回收产物3yL做模板，进行gene shuffling第一轮PCR， 此轮PCR中不加任何引物，扩增60个循环;④取10yL第3步PCR产物跑电泳，观察是否有连续 范围的大片段，如符合预期，余下PCR产物则作为模板进行下一轮PCR;⑤取第③步的PCR产 物0.5yL做模板，进行下一轮PCR，此轮PCR引物为设计好带有酶切位点的引物，扩增60个循 环;⑥取第⑤步PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，切下大于500bp的单一条带做胶回收纯化； ⑦用限制性内切酶双酶切第⑥步的胶回收产物，双酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的 片段，用液氮冷冻后挤胶水，然后与同样双酶切后的PADV5载体连接。得到多个携带有水稻 EPSPS基因的基因突变体的pADV5载体。
[0082] (2)转化EDCE(敲除EPSPS基因和C-P Lyase基因后的大肠杆菌DH5c〇
[0083] 按常规方法制备EDCE感受态细胞。将上述连接产物（携带水稻EPSPS突变基因的 PADV5载体)加入到50yL EDCE感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min;42°C热激90s，冰浴 2min后加入LB液体培养基500yL; 37 °C低速（150r/min)振荡培养90min。
[0084] 携带有水稻EPSPS突变基因的pADV5载体转化到EDCE中，即得到突变菌，也就是水 稻EPSPS基因突变体库。该水稻EPSPS基因突变体库含有水稻EPSPS突变基因的数量也非常 多。其中，每一个突变菌就相当于一个水稻EPSPS基因突变体植株。因此，若筛选相同数量级 的水稻EPSPS突变基因，相对于现有的筛选方法，本发明的筛选方法不用经过水稻的培养周 期和所占用的土地面积，其所用时间和效率以及操作过程都非常快捷、简单，尤其是占地面 积非常小，仅在培养基上就可完成筛选工作。
[0085]第三步，将上述突变菌接种至筛选培养基上进行抗性筛选。
[0086]将上述得到的多个突变菌分别接种于多个含有不同草甘膦浓度的筛选培养基上 (筛选培养基相互之间含有的草甘膦浓度有所差别，其含草甘膦的浓度分别是10mM、20mM、 50mM等具有浓度梯度差别的草甘膦，当然草甘膦的浓度可以根据实际情况设定），于3rc、 过夜培养。其中，筛选培养基是以M9为基础培养基，再添加一定浓度的抗生素 Spec (5卩6〇1:;[1101115^;[11、奇放线菌素）、6611(6611丨31115^;[11、庆大霉素）、41]^)(41]^)；[0;[11;[11、氨节青霉 素）以及不同浓度的草甘膦得到的培养基。M9培养基的成分如下：Na 2HP04 13~14g/L、 KH2PO45 · 7~6 · 3g/L、NaCl 0 · 9~1 · lg/L、NH4Cl 1 · 8~2 · 2g/L、葡萄糖37~43g/L、MgS04 · 7H2O 48~52g/L、CaCh 21 ~23g/L。
[0087] 第四步，测序验证。
[0088]挑选、分离在筛选培养基上长出的单克隆抗性菌，检测其草甘膦抗性，并测序验 证，得到具有草甘膦抗性的水稻EPSPS突变基因的序列。以其中一个水稻EPSPS突变基因进 行说明，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，由1365个碱基组成。将该水稻EPSPS突变基因 (命名为OsEM基因），与野生型的水稻EPSPS基因（命名为OsE基因）的核苷酸序列（如SEQ ID NO. 1所示)及其编码的氨基酸序列进行比较，结果如图3所示。该水稻EPSPS突变基因自5'端 至3'端的第209位碱基由"C"突变为"G"，第240位碱基由"T"突变为"C"，第346位和第347位 连续两个碱基"CT"突变为"TC"，第396位碱基"T"突变为"C"，第453为碱基"A"突变为"G"，第 606位碱基"C"突变为"T"，第831位碱基"A"突变为"G" ；其中，只有第209位碱基由"C"突变为 "G"，导致其编码的氨基酸残基序列自氨基端至羧基端第70位由丙氨酸残基突变为甘氨酸 残基，以及第346位和第347位连续两个碱基"CT"突变为"TC"，导致其编码的氨基酸残基序 列第116位由亮氨酸残基突变为丝氨酸残基，其余的碱基突变未导致其编码的氨基酸残基 发生改变。
[0089]水稻EPSPS突变基因的草甘膦抗性检测，分别以转化有OsEM基因（实验组)和OsE基 因（对照组）的大肠杆菌(EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株)接种与含有OmM、lmM、5mM、10mM、 2〇11^、5〇11^、1〇11^浓度草甘膦的培养基中，观察大肠杆菌的生长状况（用生长饱和指数来表 示，饱和指数=0，没有生长;饱和指数=1，少量生长;饱和指数=2，生长至半饱和;饱和指 数=3,旺盛生长，但还有生长余地;饱和指数=4,快速生长，细菌在培养基中已达最高（饱 和)浓度或者说生长已经达到极限）。结果如表2所示。
[0090] 表2.转化OsEM基因和OsE基因的大肠杆菌在含不同浓度草甘膦培养基中的生长饱 和指数
[0091]
[0092]由表2可知，在含OmM草甘膦的培养基上实验组（含OsEM基因）和对照组（含OsE基 因）均能正常生长(饱和指数均为4);在含11^、51111、1〇111]\1、2〇111]\1、5〇111]\1草甘膦的培养基上，对 照组不能生长(饱和指数为0)，而实验组能正常生长(饱和指数为4);在含500mM草甘膦的培 养基上，实验组和对照组均不能正常生长(饱和指数为0)。由此表明，本实施例筛选得到水 稻EPSPS突变基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示）能够赋予EPSPS和C-P Lyase缺陷型 的大肠杆菌草甘膦抗性，使大肠杆菌在高达50mM草甘膦的培养基中生长。
[0093]采用本发明本实施例提供的抗草甘膦基因筛选方法所筛选得到的具有草甘膦抗 性的突变基因例如水稻EPSPS突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 4所示，其具有抗50mM 草甘膦的抗性。
[0094]直接采用本发明本实施例提供的抗草甘膦基因筛选方法所筛选得到的具有草甘 膦抗性的突变基因例如水稻EPSPS突变基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 4所示)转化水稻 或大豆或其他植物，以使转化的植物具有了草甘膦抗性。当然，可采用基因工程领域常用的 转化方法例如农杆菌介导法、基因枪法、原生质体介导法、电击法或整体水平的转化方法等 转化水稻或大豆或其他植物，以使转化的植物具有草甘膦抗性。
[0095] 实施例2
[0096]本实施例以目的植物为大豆(Glycine max)，外源基因为大豆EPSPS基因（其核苷 酸序列如SEQ ID如.5所示）、以采用同源?1?1'方法直接敲除法敲除野生型的大肠杆菌0耶(1 中的EPSPS基因和C-P Lyase基因得到的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株为宿主菌为例，来对 本发明的筛选方法进行说明，本实施例所用引物名称及其核苷酸序列见表3。
[0097] 第一步，敲除大肠杆菌DH5a的C-P Lyase基因。
[0098] 利用FRT的方法敲除大肠杆菌DH5a菌株中的EPSPS基因和C-P Lyase基因，分两步 敲除，先敲除C-P Lyase基因，后敲除EPSPS基因。
[0099] 1.含pKD46质粒的大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备
[0100]取〇.5yL的pKD46质粒(其结构如图2所示），转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在LB培 养基平板(含Amp 100)上筛选出阳性菌落；
[0101 ]挑阳性单克隆菌落，接种于小量M9-sucrose液体培养基(含鹿糖），于转速180rpm、 30 °C下、培养过夜；
[0102]培养结束后，按1:10的比例接种于大量M9-Sucr〇se液体培养基(含蔗糖+100yg/mL Amp+10mM L-阿拉伯糖）中，于30°C培养至菌液的0D600至0.7左右；
[0103] 将上述菌液于冰上冷却20min，于4°C、4000rpm下离心收集菌体；用40mL预冷的 10%&八)甘油重悬，重复洗涤3次后弃上清，用40(^1^预冷的10%的甘油重悬并分装成10(^ L/管，得到具有Amp抗性的DH5a。
[0104] 2.敲除大肠杆菌DH5a的C-P Lyase基因
[0105] 用正向引物C-P Lyase_P15、反向引物C-P Lyase_P13(见表3)，以大肠杆菌DH5a基 因组为模板进行PCR扩增，得到P1片段，P1片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；
[0106] 用正向引物C-P Lyase_P25、反向引物C-P Lyase_P23,大肠杆菌DH5a基因组为模 板进行PCR扩增，得到P2片段，P2片段的核苷酸序列如SEQIDN0.7所示；
[0107] 用1 %的琼脂糖电泳纯化P1和P2，得到纯化的PCR产物，按比例加入含有Gen抗性片 段的质粒做成混合池，以此为模板，用正向引物C-P Lyase_P15和反向引物C-P Lyase_P23 为进行PCR扩增，得到PRC片段，长度为1586bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
[0108] 将50yL大肠杆菌DH5a感受态细胞（具有Amp抗性的DH5a)与30yL纯化后的PRC片段 轻柔混合，置于0.1 cm预冷的电击杯中，用BiO-Rad电转仪在1.8kV进行电击；
[0109] 迅速加入lmL含10mM阿拉伯糖的M9_sucrose液体培养基，在30°C培养lh后涂布于 LB固体培养基(含100yg/mL的Amp和30yg/mL的Gen)上筛选出同时抗Amp和Gen的重组菌株， 在30 °C过夜培养；
[0110] 培养结束后，用正向引物c-p Lyase_5UTR和反向引物c-p Lyase_Gen3筛选含Gen 基因的阳性克隆，验证Gen基因的存在；
[0111] 将阳性克隆接种于LB+Amp液体培养基，30°C过夜培养（12hr)，然后转接至新鲜的 LB液体培养基，继续30 °C培养12hr;
[0112] 将培养液稀释至适当浓度，涂布LB平板，用正向引物C-P Lyase_5UTR和反向引物 Lyase_3DSR引物筛选无 Gen基因的克隆；
[0113] 挑单克隆测序，保存菌种，命名为DH46AC-P Lyase JMeAC-P Lyase为敲除C-P Lyase基因的大肠杆菌DH5。
[0114]表3.本实施例所用引物名称及其核苷酸序列
[0116] 3.敲除DH46AC-P Lyase的（敲除C-P Lyase基因的大肠杆菌DH5c〇EPSPS基因
[0117] (1)DH46AC_P Lyase感受态细胞的制备
[0118] 取保存的DH46AC-P Lyase，在LB+Amp平板上划线，30°C过夜培养;挑阳性单克隆 菌落，接种于小量M9-sucrose液体培养基，于转速180rpm、30°C、培养过夜；
[0119] 培养结束后按1:10的比例接种于大量M9液体培养基(含蔗糖+100yg/mL Amp+10mM L_阿拉伯糖）中，于30°C培养至菌液的0D600为0.7;
[0120] 将上述菌液（含DH46AC-P Lyase)冰上冷却20min，于4°C、4000rpm下离心收集菌 体；用40mL预冷的10 % (v/v)甘油重悬，重复洗涤3次后弃上清，用400yL预冷的10 %的甘油 重悬并分装成1〇〇此/管。
[0121] (2)同源PCR片段扩增
[0122] 用正向引物EcEPSPS_P35、反向引物EcEPSPS_P33以DH46AC-P Lyase菌株基因组 DNA为模板扩增，得到产物P3片段，P3片段的核苷酸序列如SEQIDN0.8所示；
[0123] 用正向引物EcEPSPS_P45、反向引物EcEPSPS_P43,以DH46AC-P Lyase基因组DNA 为模板扩增，得到产物P4片段，P4片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
[0124] 用1%的琼脂糖电泳纯化P3片段和P4片段，按比例加入含有Gen抗性片段的质粒做 成混合池，以此为模板，用EcEPSPS_P35和EcEPSPS_P43为引物进行扩增，得到产物PRE片段， 长度为1607bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.22所示。
[0125] (3)热击转化
[0126] 将50yL DH46AC-P Lyase感受态细胞与35yL纯化后的PRE片段轻柔混合，置于 0. lcm预冷的电击杯中，用Bio-Rad电转仪在1.8kV进行电击；
[0127] 迅速加入lmL含10mM阿拉伯糖的M9_sucrose液体培养基，在37°C培养lhr后涂布于 LB固体培养基上筛选重组菌株，在30°C过夜培养;次日，用EcEPSPS_P35和EcEPSPS_P43引物 筛选含Gen基因的阳性克隆验证Gen基因的存在。
[0128] 将阳性克隆接种于LB液体培养基，37°C过夜培养（12hr)，然后转接至新鲜的LB液 体培养基，继续37 °C培养12hr;
[0129] 将培养液稀释至适当浓度，涂布LB平板，用正向引物EcES25和反向引物正向引物 EcES23筛选无 GM基因的克隆；
[0130] 挑单克隆测序，保存菌种，命名为 DH5aAPhnFGHAEPSPS，DH5aAPhnFGHAEPSPS 为 敲除c-p Lyase基因和EPSPS基因的大肠杆菌DH5a，也就是EPSPS和c-p Lyase缺陷型菌株。
[0131] 需要说明的是，DH5aAPhnFGHAEPSPS是不带抗生素基因的缺陷型菌株。大肠杆菌 DH5a的大部分PhnF、全部PhnG和部分PhnH与降解草甘膦为代表的膦酸酯类物质有关的基因 被敲除。FRT DNA片段的5末端连接的上游序列以及其3末端连接的下游序列的核酸片段的 核酸序列片段如SEQ ID 11所示。其中，第1位~第318位为大肠杆菌PhnF基因5末端及其上 游序列，第319位~第347位的核苷酸序列为FRT片段，第348位~第1021位为大肠杆菌PhnH 基因3末端及其下游序列。此外，DH5aAPhnFGHAEPSPS中的EPSPS基因的大部分被FRT片段 替换，如SEQ ID12所示，其中，第1位~第357位为大肠杆菌EPSPS基因5末端序列，第358位~ 第386位为FRT片段，第387位~第818位为大肠杆菌EPSPS基因3末端序列。
[0132] 第二步，以在该实施例第一步步骤中得到EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作为宿主 菌，将来自大豆的大豆EPSPS基因导入该宿主菌中，得到突变菌即大豆EPSPS基因突变体库。
[0133] 采用常规方法，将大豆EPSPS基因克隆到pADV5载体，再将pADV5载体转化DH5aA PhnFGHAEPSPS 宿主菌。
[0134] 转化后的DH5aAPhnFGHAEPSPS接种至MA液体培养基（M9基础培养基+100yg/mL Amp)中，在37 °C、300r/min条件下培养过夜；
[0135] 将生长至浑浊的菌液，采用辐射诱变处理例如紫外下照射2-5min，以使大豆EPSPS 基因突变得到相应的大豆EPSPS突变基因，即得到突变菌即大豆EPSPS基因突变体库。当然， 此步骤也可采用化学诱变处理即往MA培养基中加入化学诱变剂例如EMS或DES等，以使大豆 EPSPS基因发生突变。
[0136] 第三步，筛选培养。
[0137] 取5yL上述含有突变菌的菌液加入到筛选培养基中，继续在300r/min、37°C下培养 过夜。
[0138] 第四步，测序验证。
[0139] 挑选、分离在筛选培养基上长出的单克隆抗性菌，检测其草甘膦抗性，并测序验 证，得到具有草甘膦抗性的大豆EPSPS突变基因的序列。
[0140] 以其中一个大豆EPSPS突变基因进行说明，其核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示，由 1368个碱基组成。将该大豆EPSPS突变基因（命名为GmEM基因），与野生型的大豆EPSPS基因 (命名为GmE基因）的核苷酸序列（如SEQ ID N0.5所示)及其编码的氨基酸序列进行比较，结 果如图4所示。该大豆EPSPS突变基因自5'端至3'端的第6位至第8位之间插入了碱基"G"以 及第45位与第46位之间缺失了碱基"A"，导致第7位至第44位的碱基发生了移码突变，相应 的该区段所编码的氨基酸残基序列自氨基酸至羧基端第3位至第15位也发生了突变(如图4 所示）；此外，第629位碱基由"A"突变为"T"，导致氨基酸残基序列的第210位氨基酸残基由 谷氨酸残基突变为缬氨酸残基;第1110位碱基由"A"突变为"G"，第1125位碱基由"T"突变为 Τ'，该两个位点的碱基突变均未导致其相应编码的氨基酸残基发生突变。
[0141] 大豆EPSPS突变基因的草甘膦抗性检测，分别以转化有GmEM基因（实验组)和GmE基 因（对照组）的大肠杆菌(EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株)接种与含有OmM、lmM、5mM、10mM、 20mM、50mM、10mM浓度草甘膦的培养基中，观察大肠杆菌的生长状况。结果如表4所示。
[0142 ]表4.转化GmEM基因和GmE基因的大肠杆菌在含不同浓度草甘膦培养基中的生长饱 和指数
[0143]
[0144] 由表4可知，在含OmM草甘膦的培养基中，实验组(含GmEM基因）和对照组(含GmE基 因）均能正常生长(饱和指数为4);但在含111^、511^、1〇11^、2〇11^、草甘膦浓度的培养基上，对 照组不能正常生长，而实验组能正常生长(饱和指数为4);在含50mM草甘膦的培养基上，对 照组不能正常生长，而实验组能旺盛地生长(饱和指数为3);在含100mM草甘膦的培养基上， 实验组和对照组均不能正常生长（饱和指数都为0)。由此表明，本实施例筛选得到大豆 EPSPS突变基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示)能够赋予EPSPS和C-P Lyase缺陷型的 大肠杆菌草甘膦抗性，使大肠杆菌在高达50mM草甘膦的培养基中生长。
[0145] 采用本发明本实施例提供的具有草甘膦抗性的突变基因的筛选方法所筛选得到 的具有草甘膦抗性的大豆EPSPS突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 10所示，其具有抗 50mM草甘膦的抗性。
[0146] 直接采用本发明本实施例提供的具有草甘膦抗性的突变基因的筛选方法所筛选 得到的具有草甘膦抗性大豆EPSPS突变基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 10所示），转化大 豆或水稻或其他植物，以使转化的植物具有了草甘膦抗性。
[0147] 实施例3
[0148] 本实施例提供了一种缺陷型菌株，具体地，该缺陷型菌株为EPSPS和C-P Lyase缺 陷型菌株。该EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株由采用基因敲除技术敲除大肠杆菌DH5a、T0P10 以及BL21中的任意一种大肠杆菌的EPSPS基因和C-P Lyase基因得到。具体地，本实施例所 用的基因敲除方法如实施例1或实施例2中所用基因敲除方法相同。
[0149] 本实施例提供的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株可在测试来自目的植物的EPSPS基 因的功能中进行应用。具体地，以本实施例的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作为宿主菌，将 目的植物的EPSPS基因导入到该宿主菌中，然后将宿主菌置于不含氨基酸或蛋白的基础培 养基也就是限制性培养基中培养，如果观察到限制性培养基上有正常的菌落生产则表明该 来自目的植物的EPSPS基因具有能够表达EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）的功 能，且EPSPS具有正常的生物活性。
[0150] 本实施例提供的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株还可在测试来自目的植物的EPSPS 基因对草甘膦的抗性中进行应用。具体地，以本实施例的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作 为宿主菌，将目的植物的EPSPS基因导入到该宿主菌中，然后将宿主菌置于含有不同草甘膦 浓度的M9培养基上进行培养，例如在含有10mM、20mM、50mM草甘膦的M9培养基上进行培生 长，以测试该来自目的植物的EPSPS基因的草甘膦抗性。
[0151]本实施例提供的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株可在筛选具有草甘膦抗性的来自 目的植物的EPSPS突变基因中进行应用。具体的使用方法可参见实施例1或实施例2提供的 筛选具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因的方法。
[0152] 综上，本发明实施例提供的的筛选方法通过构建EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株， 再以该EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株为宿主菌，将来自目的植物的外源EPSPS基因导入到 该缺陷型菌株中，得到含有外源EPSPS突变基因的突变菌即外源EPSPS基因突变体库，再从 该外源EPSPS基因突变体库中筛选出具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因。由于大肠杆菌的繁 殖速度快，体积小，因此，本发明的筛选方法克服了现有筛选方法中存在的周期长、占地面 积大的问题，使得本发明的筛选方法在定向筛选出具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因的操 作上具有周期短，占地面积非常小，周期短操作简单等特点。且本发明的筛选方法以EPSPS 和C-P Lyase缺陷型的大肠杆菌作为宿主菌，有效地排出了宿主菌本身的EPSPS基因和C-P Lyase基因的突变而产生草甘膦抗性的情况，使得筛选出的结果更可具科学性，更可靠。筛 选出来自植物的EPSPS基因的基因突变体，能够大大地提高筛选速度和时间，通常只需1~2 周时间即可完成筛选工作，得到具有草甘膦抗性的突变基因，减少筛选工作的成本。此外， 本发明提供的筛选方法所得到具有草甘膦抗性的突变基因能够再用于转化相应的植物品 种，克服目前的大部分只能转来自微生物的抗性基因到农作物中的瓶颈现象，有助于消除 公众对转基因植物认识上的偏见，进而促进转基因技术的发展和推广。此外，本发明提供的 EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株能够可在测试植物的EPSPS基因的功能中进行应用，也可以 在测试植物的EPSPS基因对草甘膦的抗性中进行应用，其应用方便，结果更科学更可靠。
[0153] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，其包括： 采用基因敲除技术敲除源菌株的干扰基因，得到缺陷型菌株，所述源菌株来自大肠杆 菌DH5a、TOP 10以及BL21中的一种，所述干扰基因包括EPSPS基因和c-p Lyase基因，所述缺 陷型菌株为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株;先将外源EPSPS基因导入所述缺陷型菌株中，再 经诱变处理后，得到含有外源EPSPS突变基因的第一突变菌，所述外源EPSPS基因来自目的 植物； 或者先将所述外源EPSPS基因经突变处理，得到外源EPSPS突变基因，再将所述外源 EPSPS突变基因导入所述缺陷型菌株，得到第二突变菌； 将所述第一突变菌或所述第二突变菌置于含有草甘膦的筛选培养基上进行筛选培养， 得到具有草甘膦抗性的单克隆抗性菌； 对所述单克隆抗性菌进行测序验证，得到具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因。2. 根据权利要求1所述的抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，所述诱变处理为化学诱 变处理或辐射诱变处理。3. 根据权利要求1所述的抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，所述突变处理是以所述 外源EPSPS基因为模板，采用错配PCR法或DNA Shuffling法进行PCR得到所述外源EPSPS突 变基因。4. 根据权利要求1所述的抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，所述目的植物为水稻、 大豆、小麦、玉米、大麦、高粱、烟草、棉花、甘薯、杨树、马铃薯、白菜、甘蓝或青椒。5. -种根据权利要求1~4任一项所述的抗草甘膦基因筛选方法所筛选得到的具有草 甘膦抗性的EPSPS突变基因。6. 根据权利要求5所述的EPSPS突变基因在转化植物以使植物具有所述草甘膦抗性的 应用。7. -种缺陷型菌株，其特征在于，所述缺陷型菌株由源菌株经采用基因敲除技术敲除 干扰基因后得到，所述干扰基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，所述源菌株选自大肠杆 菌DH5a、T0P10以及BL21中的一种，所述缺陷型菌株为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株。8. 根据权利要求7所述的缺陷型菌株在测试来自目的植物的EPSPS基因的功能中的应 用。9. 根据权利要求7所述的缺陷型菌株在测试来自目的植物的EPSPS基因对草甘膦的抗 性中的应用。10. 根据权利要求7所述的缺陷型菌株在筛选具有草甘膦抗性的来自目的植物的EPSPS 突变基因中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK105969782SQ201610325692
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】王博雅, 卢远根, 胥南飞
【申请人】四川天豫兴禾生物科技有限公司