一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物表达载体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体,其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T?DNA右边界元件序列?35S启动子元件序列?第一酶切位点?NPR1的泛素?26s蛋白酶体降解元件基因序列?第一接头序列?荧光序列?第二接头序列?细胞核定位蛋白(NLS)序列?终止子序列?35S启动子序列?T?DNA左边界序列，其中，该质粒载体所表达的融合蛋白能够特异被SA所以降解。通过该质粒载体在植物体中的表达，可以实时监测植物体内的SA的水平。
【专利说明】
-种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植勸表达载体及 其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中一种用于反映活体植物内的水杨酸水平及其变化的 植物表达载体。
【背景技术】
[0002] 水杨酸（salicylic acid, SA)是植物体内普遍存在的一种简单的小分子酿类化 合物，化学名称为"邻羟基苯甲酸'是肉桂酸的衍生物。SA最早发现于柳树的叶和树皮中， 1838年Raffaele Piria·这种有效组分命名为水杨酸。鉴于SA由植物自身合成,含量较 低，于韧皮部运输,且在植物生热、开花、侧芽萌发、性别分化等生长发育过程中起着重要的 调节作用，被确认为一种植物激素。
[0003] SA在植物体内的存在形式主要有游离态和结合态两种形式，结合态SA是游离SA 与葡萄糖结合形成无活性的水杨酸-2-0-β -葡萄苷（SAGh存在于细胞内部，能防止大量 游离SA对植物细胞可能产生的毒害作用。特定情况下，SAG能释放到细胞间隙，转化为游 离SA,游离SA进入细胞^诱导防卫反应的发生。
[0004] 陆续的研究表明，SA不仅可以调节植物的某些生长发育过程,还是激活植物 过敏反应(hypersensitive response, HR)和系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)的重要内源信号分子，与植物抗盐性、抗旱性、抗热性和重金属胁迫等有 相关。此外，SA在农业上甚用于保鲜花奔、延缓果实成.熟而提_好果率。SA与桓物抗胁迫 的关系一直是研究的热点，目前已经明确SA可作为植物抗病反应所需的信号分子来激活 植物防御保护机制，在植物信号传导和抗逆反应中起着关键作用。
[0005] 目前，国内报道测定SA的方法有紫外分光光度法、离子色谱法、色谱-质谱连用 法,主要对于废水、食品、医药中SA的含量进行测定，鲜有对植物样品的提取测定。国外文 献主要采用高效液相色谱法（HPLC)对植物样品中的SA水平迸行分析，测定受HPLC流动 相、检测器等诸多因素的影响，更重要的是无法对活体植物内的SA进行实时监测。
[0006] 实时监测活体植物中水杨酸的水平是深入研究其作用和抗病机理的必要前提。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述的技术问题,本发明的目的是提供一种实时反映楂物体内水杨酸水 平的方法及其专用检测植物体内SA的融合蛋白以及表达载体。
[0008] -方面，本发明提供一种融合蛋白，该蛋白包括NPR1的泛素--26s蛋白酶体降解元 件的基因所编码的蛋白和荧光素基因所编码的蛋白。或者该融合蛋白为NPR1的泛素-26s 蛋白酶体降解元件的基因和荧光素基因所编码，所表达。该融合蛋白可以专一，特异地被SA 降解，相反，SA不会单独降解荧光素基因所编码的蛋白或者NPR1的泛素-26s蛋白酶体降 解元件所编码的蛋白，即NPRi的泛素基因所编码的蛋白或者荧光素基因所编码的蛋白均 不会受SA诱导降解。
[0009] 在一些优选的方式中，该融合蛋白是通过质粒载体转入到表达载体来表达的。优 选的，所述的质粒载体的结构双左到右顺次包括：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件 序列-第一酶切位点-目的基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核 定位蛋白（NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。
[0010] 另一方面，本发明一种质粒载体，其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时 检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序 列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-目的基因序列-第一接头序列-荧光序列-第 二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列T-DNA左边界序 列。
[0011] 再一方面，本发明提供的检测植物体内水杨酸水平的方法，将含有来源于番茄的 SA响应蛋白NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基因片段构建到入的植物表达载体中， 形成可以表达SA诱导降解的Vem】s YFP _合蛋白的载体，重组载体转入表达载体中（例如 农杆菌）；将该农杆菌浸润植物；48小时候采用荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反 应介导融合蛋白表达，通过荧光共聚焦显微镜可以检测楦物水杨酸的水平。所述的植物表 达载体从右到左包括如下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位 点-目的基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS)序 夕丨J -终止子序列-35S后动子序列-T-DNA左边界序夕fj。
[0012] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的T-DNA左边界元件序列为 Seq ID No:7 所示。
[0013] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的THDM右边界元件序列为 Seq ID Mo :8 所示。
[0014] 在1:述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的35S启动子元件序列为Seq ID No:9 所不。
[0015] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的第一接头序列为Seq ID No: 10所示·
[0016] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，荧光蛋白序列为Seq ID No:ll所 示。
[οοπ] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，第二接头序列为Seq Π ) N〇:12所 不。
[0018] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，细胞核定位蛋白（NLS)序列为Seq ID No: 13 所示。
[0019] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，Bar序列为Seq ID No: 14所示。
[0020] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，终止子序列为Seq :Π ) No: 15所示。
[0021] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的第一酶切位点为Agel酶切 位点；第二酶切位点为Spel酶切位点。
[0022] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元 件的基因为Seq ID No:5所示。所述NPR1降解元件的氨基酸序列Seq ]D No:6所示》
[0023] 本发明提供制备检测植物体内水杨酸水平的表达载体的构建方法，该方法包括如 下步骤：
[0024] 1)番茄中获得NPK1降解元件的编码基因序列，以番茄cDNA为模板，以引物对 IK B-Fl/IKB-R1 所述的引物对进行 PCR 扩增，]:KB-F1/IKB-R1 为 Seq ID No:l，Seq ID No:2 所示；扩增的PCR产物纯化后经测序获得全序列，长度120bp(Seq ID No:5)。
[0025] 2)、步骤！中获得的NPR1降解元件的编码基因为模板，以引物对IKB·-F2/IKB-R2 扩增；引物对]KB-F2(带有Age丨酶切位点NPR丨泛素26s蛋白酶体降解元件?Γ -端扩增 正向引物/IK B-F1 (带有Spel酶切位点NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件:r -端扩增反 向引物）为 Seq ID No:3,Seq ID No:3 所示；
[0026] 3)、采用Spel和Agel将步骤2中纯化的扩增目的片段进行酶切，并与经Spel和 Age:[双酶切的Pjp743载体进行连接，连接的系统和步骤如下：采用10 μ L体系反应，其中 lOXLiga se Buffer luL，Spel 和 Agel 双酶切线性化克隆载体 pjp743 120ng，NPR1 泛 素-26s蛋白酶体降解元件片段120ng，Ligase 0. 4μ 1，最后用ddH20调整体糸至10 μ L，轻 轻混匀各组分；置于1.6Γ反应30miR ;反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min ; 然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出1个具有NPR1泛 素-26s蛋白酶体降解元件基因序列的克隆；提取包含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件 质粒的克隆；通过电击法将其导入到农杆菌菌株GV3101,成可以表达SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的（GV3I01)菌株。
[0027] 有益效果
[0028] 将含有NPR1降解元件的表达载体导入植物，可以通过在共聚焦显微镜T观察GFP 的表达量，从而检测植物体内水杨酸的水平。当楦物体内无 SA积累，在细胞核可见强烈的 绿色荧光；当植物体内有SA积累，细胞核内的黄色焚光猝灭。与传统的紫外分光光度法、离 子色谱法、液相色谱法等方法相比，所述表达载体检测植物体内水杨酸水平的方法操作简 单便捷,重复性好，可有效羯于水杨酸在楦物抗病防御反应的研究分析W以实时在活体楦 物上进行检测，而不用传统的提取处理过程，可以更真实的反应植物本身体内的SA的实时 动态。
【附图说明】
[0029] 图i含NPRi泛素-26s蛋白酶体降解元件元件的表达载体的构建示意图；其中 pjp748为含有目的基因的载体结构，pjP749为不含目的基因（目的基因突变体）的载体结 构示意图》
[0030] 图2含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的融合蛋白的表达后，本氏烟叶片内荧 光随着SA浓度不同的变化结果图（上方标注为共聚焦显微镜通道,右侧为SA浓度）。
[0031] 图3含有突变的NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的融合蛋白表后，本氏烟叶片 内灭光不随SA变化的邰分结果图（上力标汪为共衆焦Μ傲镜通道，右侧为SA浓度）。
【具体实施方式】
[0032] 本发明所提供的实施例均按照常规实验条件,其中所采用的引物序列如表1。
[0033] 表1NPR丨降解元件的编码基因序列扩增及载体构建引物
[0034]
[0035] 对于4中引物序列的说明：
[0036] Seq出NO。1信息：NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件5' -端扩增正向引物； [0037] Seq ID N0. 2信息：NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件:T -端扩增反向引物；
[0038] Seq ID N0. 3信息；带有Agel酶切位点NPR1泛素 -26s蛋白酶体降解元件5"-端 扩增正向引物；
[0039] Seq ID N0. 4信息：带有Spel酶切位点NPR1泛素 -26s蛋白酶体降解元件3'-端 扩增反向引物；
[0040] Seq ID N0. !6信息：带有Agel酶切位点突变的NPR1泛素 -26s蛋白酶体降解元 件5'…端扩增正向引物。
[0041] 实施例1 APRl泛素 -26s蛋白酶体降解元件的克降和测定
[0042] 以引物对 IKB-FI (Seq ID No: i) /IKB-Ri (Seq ID No: 2)和扩增番茄 NPRi 基 因泛素-26s降解元件序列，PCR扩増体系为：9 μ L DEPC水、25 μ L2 X PCR Buffer for KOI) FX Neo,10uL,2mM dNTPs、上下游引物（（ΙΟμΜ each)各 1.5yL、2iiL cDNA 模板、 luL K0D FX Neo聚合酶。总反应体系为50uL。各片段的反应条件为：94°C2min; 94? 15s，60°C 30s，68? 45s, 35个循环；68°C 10min。扩增的PCR产物纯化后经测序获得 全序列，长度 120bp(Seq ID No:5)。
[0043] 实施例2 :NPR1泛素 -26s蛋白酶体降解元件YFP融合蛋白及其突变载体的构建和 测定
[0044] 根据实施例1获得的全序列，设计引物对IKB-F2/IKB-R2。以实施例1中DNA为 模板，以引物对IKB-F2/IKB-R2扩増。采羯Spel和Agel将纯化的扩增目的片段酶切，并 与经Spe丨:和Age]:双酶切的pjp743载体进行连接，采用1()μ L体系反应，其中10XLi_ga.se Buffer 1 μ L, Spel和Agel双酶切线性化克隆载体pjp743 120ng, NPR1泛素 -26s蛋白酶 体降解元件片段i20ng,Ligase 0, 1,最后用ddH20调整体系至10μ L,轻轻混匀各组分。 置于〗_6°C反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min,最终获得转化质 粒载体，结构如图1所示的载体主要结构（组成载体的主要结构单元的序列见附图和基因 序列表）。然后将连接产物转入大肠杆菌Machl (购自全式金公司），挑选具有全长插入的克 隆，测序筛选出1个具有正确NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件基因序列的克隆。提取包 含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件质粒，将该策略构建的载体命名为pjp748(图i)。通 过电击法将其导入到农杆菌菌株GV3101,形成nj以表达SA诱导降解的Venus YFP融合蛋曰 的（GV3101)菌株。该NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的氨基酸序列为SEQ, NO :6所示。
[0045] 采取以上同样方法，设封'NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件突变引物mIKB-F2。以 实SEQ, N0 :17所示的DNA为模板（突变体DM),以引物对mIK:B-.F2/IKB-.R2扩增（表i)。 采用Spel和Age]:将纯化的扩增目的片段酶切，并与经Spel和Agel双酶切的pjp743载体 进行连接，采用1〇μ L体系反应，其中lOXLigase Buffer 1 μ L，Spel和Agel双酶切线性 化克隆载体pjp743120ng, NPRi泛素-26s蛋白酶体降解元件突变it段i20ng(SEQ，NO :i7 所示），Ligase 0. 4μ 1，最后用ddH20调整体系至轻轻混匀各组分。置于〗_6°C反应 30η?η。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5η?η，最终获得转化质粒载体,结构如 图1所示的载体主要结构（组成载体的主要结构单元的序列见附图和基因序列表）。然后 将连接产物转入大肠杆菌Machl (购自全式金公司），挑选具有全长插入的克隆，测序筛选 出?个哭变NPR〖泛素-26s蛋白酶体降解兀件基因序列的兒隆，提取该克隆旗粒，将该策略 构建的载体命名为pjp749 (图1)。通过电击法将其导入到农杆菌菌株GV3101,形成可以表 达突变的SA响应元件的Venus YFP融合蛋白的（GV3101)菌株。该突变NPR1泛素-26s蛋 白酶体降解元件的氨基酸序列为SEQ, N0 :18所示。
[0046] 实施例4 应SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的瞬时表汰
[0047] 将实施例子3中构建的两种放粒载体pjp748及pjp749 (其中pjp749载体的结:揭 与pjp748结构相同，其插入的NPR1基因泛素-26s降解元件序列为突变体，对SA的作相不 响应，图i)分别电击转化导入农杆菌菌株GV3101 ( _业购买获得），经菌落PCR验证后，挑 取筚斑接种于含有Kan_(50mg/L)和Rif(50mg/L)抗性的LB培养基（基本成分是蛋白 脉、0 5%酵母提取物、1 %氣化销）中28 C过夜振杨?抟乔；然Jp 1 : 1〇〇 培养基中，生长至对数生长期（A6。。值约为0. 6-0, 8)，经6000r/inin离心5min役集菌体；用 含终浓度为iOml MgCl2, K)mM MES(pH 5. 6),200uM乙酰丁香調（Ace)的无菌水重悬浮，调 整菌液浓度至A600为1. 0 ;在室温下放置3小捋以上。
[0048] 用1ml注射器（无针头）吸取农杆菌菌液待用。选取4~6片真叶的本氏烟草，在 叶片背面缓慢将菌液（含有pjp748及pjp749质粒的农杆菌菌株GV3101)分别渗透注射到 组织间隙中。每个处理注射6~8株,将浸润好的楂株在暗处放置3~6小时后移到25°C 温室中培养（16小时光照/8小时黑暗交替）。
[0049] 实施例5 :融合蛋白对SA的反应
[0050] 每隔12小时对注射的实施例子4中的烟草叶片喷洒（2mL/g叶片）ddH20、10 μ M、 100 μ M、iml的SA溶液,48小时候采?荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反应。观察 表明，NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件YFP融合蛋白对10 μ M、!00 μ M、ImM SA表现出敏 感性，荧光强度明显降低，并随SA浓度增加呈减弱趋势：而NPR1泛素--26s蛋白酶体降解元 件突变体YFP融合蛋白对ddH 20、10 μ M、100 μ M、ImM SA均无明显反应（图2和图3)。这些 结果表明构建的NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件YFP融合蛋白具有响应SA生物学活性， 并能实时反应植物内SA水平，可以用来检测植物体内的SA实时变化水平。
[0051] 实施例6 ；：响应SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的表达以及运塌
[0052] 质粒载体：
[0053] 将pjp748 :实施例子4中的载体；
[0054] pjp749 :其中pjp749载体的结构与pjp748结构一样，除了插入的NPR1泛素 --26s 蛋白酶体降解元件基因片段为突变体，对SA的作用不响应，图1 ;
[0055] pjp750 :其中pjp750载体的结构与pjp748结构一样，但是只含有Seq ID No:5所 不的序列的基因，而炎光货白基因为突变体基因或者不含炎光货白基因；
[0056] p jp751 :其中p jp750载体的结构与p jp748结构一样，但是只含有Seq [D No: 11 (荧光蛋白）所示的序列的基因，但是不含有Seq ID No:5所示的序列的基因。
[0057] 分别将上述4中质粒载体电击转化导入农杆菌菌株GV3101 (商业购买获得），经 菌落PCR验证后，挑取单斑接种于含有Kan(5〇Eng/L)和Rif(50mg/L)抗性的LB培养基（基 本成分是：1 %蛋Η膝、〇. 5%酵母提取物、1 %氣化纳）中28 Cxi夜振场培养；然后1 :100转 接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生-氏期（A6。。值约为0, 6-0. 8)，经600()r/min离心 5min收集菌体；用含终浓度为lOmM MgCl2,10ml MES(pH 5. 6) ,200uM乙酰丁香酮（AS)的无 菌水重悬浮，调整菌液浓度至A,3(：。为1. 0 ;在室温下放置3小时以上。
[0058]用Imj注射器（无针头）分别吸取以上含有4种自立载体的农杆菌菌液待用。选 取4 ~ 6片真Π 十的本氏烟草，在叶片背面缓慢将菌液（含有p jp748、p jp749、p jp750、p jp751 质粒的农杆菌菌株GV3101)分别渗透注射到组织间隙中。每个处理注射6~8株，将浸润 好的植株在暗处放置3~6小时后移到25°C温室中培养（16小时光照/8小时黑暗交替）。 每隔12小时对注射的实施例子4中的烟草叶片喷洒100μ Μ的SA溶液，48小捋候采用荧光 共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反应。具体结果如Τ表1 :
[0059] 表1,不同融合蛋白体外与SA接触的结果（48小时）
[0060]
[0061] 从以上实验结果可以看出，只有NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件-荧光蛋白形 成的融合蛋白，才特异的表现出响应SA的特异降解。同捋，当只有NPR1泛素…26s蛋白酶 体降解元件时，不产生荧光，而只有荧光蛋白单独存在的情况下,荧光蛋白也并不降解。随 着接触反应的时间延长（3天以上），以上结果仍然不变。这似乎可以说明，只有当NPR1泛 素-26s蛋白酶体降解元件和荧光蛋白基因的融合蛋白，可以特异被SA所降解，其他则不 能。进一步说明/可以用本发明的融合蛋白来特异指示SA是否存在。
[0062]同时，我们用SA的类似物做同样的实验，或者类似的结果（【具体实施方式】和数据 略）。
【主权项】
1. 一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物质粒表达载体，其中,通过把该质粒 载体接种到植物体中，实时检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如 下结构：T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-NPR1的泛素-26s蛋 白酶体降解元件基因序列-第一接头序列-荧光蛋白序列-第二接头序列-细胞核定位蛋 白（NLS)序列…终止子序列-35S启动子序列…?Η)ΝΑ左边界序列，其中，该质粒载体所表达 的?Η合蛋Η能够特知被SA所以降解。2. 根据权利要求1所述的质粒载体，其中，所述的T-DNA左边界元件序列为Seq ID No :7所示;所述的T-DNA右边界元件序列为Seq ID No :8所示；所述的35S启动子元件序 列为Seq ID No:9所示；所述的第一接头序列为Seq ID No: U)所示；荧光蛋白序列为Seq ID No: 11所示；第二接头序列为Seq ro No: 12所示；细胞核定位蛋白（NLS)序列为Seq ID No: 13所示；Bar序列为Seq ID No: 15所示；第一酶切位点为Agel酶切位点；第二酶切位 点为Spel酶切位点；NPRi的泛素-26s蛋白酶体降解元件基因为Seq ID No:5所示。3. -种检测植物体内水杨酸水平的方法，将含有来源于番茄的SA响应蛋白NPR1的泛 素…26s蛋白酶体降解元件的基因灼段构建到入的植物表达载体中，形成可以表达SA诱导 降解的Venus YFP融合蛋白的载体，重组载体转入表达载体中（例如农杆菌）；将该农杆菌 浸润植物；48小时候采用荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反应介导融合蛋白表达， 通过荧光共聚焦显微镜可以检测植物水杨酸的水平。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的植物表达载体从右到左包括如下结构： T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-NPR1的泛素-26s蛋白酶体 降解元件基因序列-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS)序 列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述的T-DNA左边界元件序列为Seq :丨D No:7 所示；所述的T-DNA右边界元件序列为Seq ro No:8所示；所述的35S启动子元件序列为 Seq ID N〇:9所示；所述的第一接头序列为Seq Κ No: 10所示；荧光序列为Seq ID No: il 所不;第-接头序列为Seq ID No: 12所不；细胞核足位蛋白（NLS)序列为Seq Π ) No: 13所 示；Bar序列为Seq ro No: 15所示；第一酶切位点为Agel酶切位点；第二酶切位点为Spel 酶切位总；NPR1的泛素-26s蛋曰酶体降解元件基因为Seq ID Mo:5所示。
【文档编号】C12N15/82GK105969795SQ201610439637
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】赵晋平, 李赛赛, 燕飞, 程晔, 陈剑平
【申请人】浙江省农业科学院