一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法

一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法。具体包括TALENs靶序列的设计，TALENs植物双元表达载体的构建，转TALENs基因植株的获得，转基因突变体植株的检测与分析，不含外源DNA大粒突变体植株的获得等步骤。实验证明使用TALENs定点敲除技术能成功使水稻大粒基因GW2发生突变，并获得水稻籽粒显著增大的水稻高产材料，加速了水稻高产新品种的培育进程。
【专利说明】
一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法。【背景技术】
[0002]水稻是世界及我国重要粮食作物，提高水稻产量一直是水稻遗传育种的重要目标。水稻的产量性状是由多基因决定的复杂性状，主要受每株有效穗数、穗粒数和粒重3个因素共同调控。粒重的遗传力最高，在不同的环境和遗传背景中都能稳定的遗传，通常以千粒重表示。因此，对水稻粒重相关基因进行遗传改良是提高水稻产量的有效途径之一。
[0003]粒重由粒长、粒宽和粒厚决定，它们是由多个数量性状基因(QTL)控制的数量性状。利用分子标记技术已定位了粒重相关的QTL，并部分基因已被成功克隆。GW2基因是一个位于2号染色体上控制水稻粒宽和粒重的主效数量性状基因，包含8个外显子，编码一个 RING锌指结构的E3泛素连接酶，由425个氨基酸组成。大量的实验表明GW2可能参与降解促进颖花外壳细胞分裂的蛋白，当其功能缺失或降低时，将不能将泛素转移到靶蛋白上，从而加快细胞分裂，增加颖花外壳的宽度，同时也提高了灌浆速率，增加了粒重和产量。研究人员通过分子标记选择方法将大粒品种的GW2基因导入小粒品种中，培育而成的新株系与对照相比，尽管每穗粒数有所减少，但由于粒重的明显增加，依然能够显著的增加单株产量， 显示了该基因在高产水稻育种中具有重要的利用价值。
[0004]TALENs(类转录激活因子效应物核酸酶)技术是一种新型的序列特异核酸酶介导的基因定点修饰技术，由黄单胞杆菌转录激活类效应子TALE的DNA结合域和核酸内切酶Fok I的DNA切割域组成，前者负责识别靶DNA，后者负责切割DNAJALE蛋白含有一个串联重复结构域，由多个33?35个氨基酸重复模块组成，每个模块的氨基酸高度保守，仅在其第12和13 位相邻的两个氨基酸是可变的(通常称为重复可变双残基，RVD)，每个RVD能特异识别一种核苷酸，识别规律为NG识别T，NN识别G，NI识别A，HD识别C。当TALEN与DNA结合后，其切割域FokI与另一个相邻的、方向相反的切割域FokI形成二聚体切割DNA，产生DNA双链断裂(DSB)，其DNA断裂点在修复过程中可通过非同源末端连接(NHEJ)的不精确修复方式产生基因的定点突变，或通过同源重组(HR)精确的修复方式产生基因定点插入或替换。无论通过哪种修复方式，均可获得不同于野生型的DNA序列，因此TALENs技术可实现对靶标基因的修饰。目前，该技术已成功应用于动物、植物、微生物及人类等多种物种中。
[0005]利用TALENs技术在水稻中完成定点敲除水稻大粒基因GW2后，导入受体细胞的 TALEN表达盒可以通过自交或杂交从后代个体中去除外源DNA，从而获得水稻大粒基因GW2 突变而不带有转基因痕迹的水稻高产材料，大大缩短了育种进程。
【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种利用TALEN技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法。
[0007]一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法，包括以下步骤:1)TALENs靶序列的设计；2)TALENs植物表达载体的构建；3 )转TALENs基因植株的获得；4)转基因突变体植株的检测与分析；5 )不含外源DNA大粒突变体植株的获得。
[0008]步骤1)中TALENs靶序列设计原则为:左臂和右臂TALEN识别序列长度为12-19 bp， 左臂和右臂TALEN识别序列之间的间隔序列长度为12-21bp。
[0009]步骤2)具体为:根据左臂和右臂TALEN识别序列合成对应的TALE串联重复区，并分别克隆于含有启动子、TALE蛋白N-端、C-端和FokI切割编码序列的载体上，经酶切和测序获得含有左、右臂TALEN基因表达盒载体pTALEN-GW2L和pTALEN-GW2R;用酶切方法获得左臂、 右臂TALEN基因表达盒，装入同一个植物表达载体，获得含有左臂、右臂TALEN基因表达盒的植物双元表达载体。
[0010]步骤3)具体为:通过农杆菌介导法或基因枪法将植物双元表达载体导入水稻胚性愈伤组织中，经筛选、分化及生根获得转化再生植株;通过叶片浸泡潮霉素方法和PCR检测获得转基因阳性植株。[〇〇11 ]步骤4)具体为:以转基因阳性植株DNA为模板，通过PCR和测序鉴定突变体植株并分析突变体植株的粒型特征。
[0012]步骤5)是通过叶片浸泡潮霉素方法、PCR检测及粒型分析筛选不含外源DNA的大粒突变体植株。
[0013]所述的突变体为靶序列间碱基的缺失、插入或替换。[0〇14]具体步骤为:1) 分析基因序列特征，在其编码区分别设计左臂和右臂TALEN识别序列，并在拟改造的水稻受体材料中验证该识别序列的正确性；2)根据DNA碱基与TALE蛋白RVD区的对应关系，合成TALEN识别序列对应的TALE串联重复区，并克隆于含有TALE蛋白N-端、C-端和FokI切割编码序列的载体上，获得左臂TALEN基因表达盒TALEN-L和右臂TALEN基因表达盒TALEN-R，并装入植物表达载体中获得含有 TALEN-L和TALEN-R的植物双元表达载体；3)通过农杆菌介导法或基因枪法等将植物双元表达载体导入水稻胚性愈伤组织中，经筛选、分化及生根获得转化再生植株;通过叶片浸泡潮霉素方法和PCR检测获得转TALEN基因阳性植株；4)以转基因阳性植株DNA为模板，通过PCR和测序鉴定突变体植株并对其粒型特征进行分析。[〇〇15]5)突变体植株种植T1代，通过叶片浸泡潮霉素方法、PCR检测及粒型分析筛选不含外源DNA的大粒突变体植株。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:1.本发明所述利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法直接对水稻内源产量基因GW2进行定向改造，可实现水稻产量性状的定向遗传改良，克服了自然变异或传统人工诱变遗传改良的非定向缺陷。
[0017]2.本发明所述利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法在当代或下一代即可获得纯合突变个体，与需进行连续多代选择的传统杂交育种相比，大大缩短了育种进程。[〇〇18]3.本发明所述利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法将获得不含有外源DNA序列的水稻高产材料，与自然变异和人工诱变突变体无差异，可直接应用于生产上。【附图说明】[〇〇19]图1.测序峰图与比对结果，其中图1A为G3植株的测序峰图，图1B为G19植株的测序峰图，图1C为野生型、G3与G19的靶序列比对结果。
[0020]图2.突变体T1植株PCR扩增TALENs表达框特异片段的电泳图，其中图2A为G3突变体T1部分植株的检测结果，图2B为G19突变体T1部分植株的检测结果。
[0021]图3.G19突变体T1不含外源DNA植株的PCR基因分型结果。[〇〇22]图4.T1不含外源DNA突变体谷粒与明恢86谷粒(对照)比较，其中图A为粒宽比较， 图B为粒长比较。第一排为对照，第二排为G19的T1杂合突变体，第三、四排为两个不同的 G19T1纯合突变体，第五、六排为两个不同的G3T1纯合突变体。【具体实施方式】[〇〇23] 实施例1: TALENs靶序列的设计水稻GW2基因包含8个外显子，第一外显子为第1-201位，第二外显子为第1490-1541位， 第三外显子为第1627-1672,第四外显子为第1765-1846,第五外显子为第1925-2087位，第六外显子为第1925-2087位，第七外显子为第3979-4045位，第八外显子为第5318-5881位。以水稻明恢86基因组DNA为模板，PCR扩增并测序获得基因第一外显子序列，见SEQ ID N0.1。根据TALENs靶序列设计原则，在水稻明恢86 J盛因的第一外显子设计靶序列，序列为 GTACGAGCACAGGGACATcgaccagaagaagctccggAAGCTGAITCTCGAGGCC(位于 GW2 基因的 69-123)，两侧的大写字母分别为左臂TALEN模块识别序列(L)和右臂TALEN模块识别序列(R)， 中间小写字母为间隔序列。[〇〇24]实施例2: TALENs植物双元表达载体的构建根据设计的左右臂TALEN模块识别序列，按照上海斯丹赛生物技术有限公司提供的模块合成方法(FastTALE?TALEN试剂盒)，合成左右臂TALEN模块并分别构建于骨架载体 PTALEN-L20和pTALEN-R16(上海斯丹赛生物技术有限公司提供)中，经酶切和测序验证后， 获得构建正确的左臂(TALEN-GW2L)和右臂(TALEN-GW2R) TALEN基因表达盒。TALEN-GW2L由 Ubi启动子驱动表达，TALEN-GW2R由35S驱动表达。[〇〇25] 用Hindlll和Asc頂每从质粒中切取TALEN-GW2L基因表达盒，胶回收5K条带；用 SacI和Asc頂每从质粒中切取TALEN-GW2R基因表达盒，胶回收4K条带；用Hindlll和SacI酶切改造过的PCAMBIA1301植物表达载体，胶回收8.5K条带。将上述三个片段一步法连接获得含有TALEN-GW2L和TALEN-GW2R的植物双元表达载体pTALEN-GW2L-GW2R。[〇〇26]实施例3:转TALENs基因植株的获得把构建好的载体PTALEN-GW2L-GW2R通过电激法转化农杆菌LBA4404，酶切验证正确后转化籼稻明恢86胚性愈伤组织并获得转基因再生植株。步骤如下:1)水稻胚性愈伤组织的培养在水稻幼穗开花12-15天后，选取其幼嫩的种子，先去除颖壳，然后在75%的酒精溶液中洗涤0.5-1分钟进行消毒灭菌;然后进一步用10-30wt.%的次氯酸钠溶液继续浸泡15-30 分钟再次进行灭菌;随后，在超净台中用无菌水冲洗3-4遍，倒出在无菌纸上进行空气晾干； 最后，用镊子和解剖针于消毒灭菌后的幼嫩种子中挑取出幼胚部分，接种到诱导培养基上， 置于27°C的光照培养箱中进行避光培养10-15天;接下来，要切除幼胚的芽鞘等组织，只留下末端的细胞膨大体，重新转接到新的诱导培养基中，然后继续于27°C避光进行培养;以20 天为周期进行继代培养。[〇〇27]2)水稻胚性愈伤组织的农杆菌感染从继代培养3?6次的胚性愈伤组织中挑取自然分散、颜色鲜黄、直径大小约为2?3 mm 的颗粒状愈伤，置于诱导培养基(NB培养基+ 2，4 - D 2 mg L_SpH 5.8-5.9)上，于27°〇 暗培养3天；将农杆菌划线于YEB固体培养基上，28°C暗培养2天后用AAM液体培养基悬浮，并将浓度调为1?1.5 OD600，静置1?2小时后倒入上述胚性愈伤，略微摇动后静置30min;倒出农杆菌悬浮液，将胚性愈伤平铺在无菌滤纸上，吹干后置于含有100 yM乙酰丁香酮的NB培养基上，27°C暗培养3 d;挑取上述愈伤于三角瓶中，倒入无菌水以同一方向摇动数次;冲洗3~5次直至水中不再残留丝状菌体，滤干加入含250 mg/L羧苄青霉素的无菌水，静置1 h后滤干并均匀分散于无菌滤纸上吹干，备用的；3)水稻抗性愈伤的筛选与植株的再生将农杆菌感染好的胚性愈伤组织转移至添加了250 mg/L羧苄青霉素和30 mg/L潮霉素的筛选培养基(NB培养基+ 2,4 - D 2 mg L—1 +羧苄青霉素250 mg L—1 + hygromycin 30 mg I/1;pH 5.8-5.9)上，27°C避光培养;两周后将愈伤转移至新的筛选培养基上，将长出鲜黄色的抗性愈伤置于新的筛选培养基(NB培养基+ 2,4 - D 2 mg I/1 + hygromycin 50 mg I/1;pH 5.8-5.9)上，7 d后挑取没有变黑的抗性愈伤，置于分化培养基(NB培养基+ KT 10 mg L—NAA 0.4 mg L—SpH 5.8-5.9))上，当绿色幼芽长出后移到1/2 MS培养基再生成完整水稻植株。[〇〇28]4)转基因阳性植株的检测TALEN表达载体中含有如t选择标记基因，对所有转化植株首先利用叶片浸泡潮霉素液方法进行转基因阳性克隆筛选。在叶片浸泡潮霉素液中，叶片不出现褐斑为转基因植株，出现褐斑则为非转基因植株。提取上述鉴定转基因阳性植株DNA，在TALEN表达框内设计一对特异引物F0K-F(5’ TGACCGAGTTCAAGTTCC 3，)和N0S-R(3:5’ TTGCGGGACTCTAATCA 3’)，经 PCR进一步鉴定转基因阳性植株。[〇〇29]实施例4:突变体的检测与分析在TALEN靶序列两侧设计一对PCR引物GW2F(5 ’ GGGAGTGGTGAGGGTTT 3 ’)和GW2R(5 ’ CGCAATCCACGCCCTACT 3 ’)，以上述检测为阳性转基因植株DNA为模板，扩增目的片段并送往公司测序。测序结果与野生型序列(SEQ ID N0.1)比较，获得6个突变体。G3和G19是其中两个突变体，G3为GW2基因第一外显子缺失90 bp的纯合突变体，G19为GW2基因第一外显子缺失32 bp的杂合突变体。G3第一外显子突变序列参见SEQ ID N0.2，G19第一外显子突变序列参见SEQ ID N0.3。对G3和G19突变体T0种子粒型进行观察，发现相对于野生型明恢86种子， G3纯合突变体种子的粒长和粒宽发生明显增加，G19杂合突变体种子的粒长发生显著增加。
[0030]实施例5:不含外源DNA序列大粒突变体植株的获得T0代收获的G3纯合突变体和G19杂合突变体种子经萌发后种植T1代，通过叶片浸泡潮霉素和PCR检测分离到不含外源DNA序列的G3和G19突变体T1代植株。由于G19为杂合突变体，其后代会出现分离，用PCR引物GW2F1 (5 ’ GTGGAGGAGAGGTACACGAGG 3 ’)和GW2R1 (5 ’ CGGCGCCCATGTAGCACG 3 ’)，对所获得的不含外源DNA序列的G19后代植株进行检测，获得杂合突变植株5株，纯合突变植株3株。[〇〇31] 分析不含外源DNA序列的gw2突变体T1种子粒型特征，相对于野生型明恢86种子， G3和G19后代的纯合突变植株种子粒长和粒宽均有明显增加，G19后代的杂合突变植株的粒长有明显增加、粒宽没有显著变化。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种利用TALENs技术定点突变GW2基因创制水稻高产材料的方法，其特征在于，所述 方法包括以下步骤:l)TALENs靶序列的设计；2)TALENs植物表达载体的构建；3)转TALENs基因植株的获得；4)转基因突变体植株的检测与分析；5)不含外源DNA大粒突变体植株的获得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中TALENs靶序列设计原则为:左臂 和右臂TALEN识别序列长度为12-19bp，左臂和右臂TALEN识别序列之间的间隔序列长度为 12-21bp〇3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为:根据左臂和右臂TALEN识别 序列合成对应的TALE串联重复区，并分别克隆于含有启动子、TALE蛋白N-端、C-端和FokI切 割编码序列的载体上，经酶切和测序获得含有左、右臂TALEN基因表达盒载体pTALEN-GW2L 和PTALEN-GW2R;用酶切方法获得左臂、右臂TALEN基因表达盒，装入同一个植物表达载体， 获得含有左臂、右臂TALEN基因表达盒的植物双元表达载体。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为:通过农杆菌介导法或基因 枪法将植物双元表达载体导入水稻胚性愈伤组织中，经筛选、分化及生根获得转化再生植 株;通过叶片浸泡潮霉素方法和PCR检测获得转基因阳性植株。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为:以转基因阳性植株DNA为模 板，通过PCR和测序鉴定突变体植株并分析突变体植株的粒型特征。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)是通过叶片浸泡潮霉素方法、PCR检 测及粒型分析筛选不含外源DNA的大粒突变体植株。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的突变体为靶序列间碱基的缺失、 插入或替换。
【文档编号】A01H5/00GK105969796SQ201610459047
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】周淑芬, 王 锋, 施惠芳, 刘华清, 杨绍华, 陈睿
【申请人】福建省农业科学院生物技术研究所