根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法
【专利摘要】本发明公开了一种根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠秆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸荠秆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子，从而建立了荸荠秆枯病菌高效的遗传转化体系。该法操作简单、转化效率高且稳定性好，以此构建荸荠秆枯病菌突变体库，由农杆菌介导介导荸荠秆枯病菌的遗传转化获得的转化子可为筛选弱致病性和致病性缺陷的荸荠秆枯病菌菌株提供了丰富的筛选菌源，同时为克隆荸荠秆枯病菌致病性相关基因，深入研究荸荠秆枯病菌致病机理奠定基础。
【专利说明】
根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的荸荠杆枯 病菌的遗传转化方法。
【背景技术】
[0002] 荸养(Eleocharis dulcis)属莎草科(Cyperaceae)荸养属(Eleocharis)，是多年 生草本植物，又名地栗、乌芋、马莽、红慈姑、马蹄等。原产于我国南方和印度，在我国有逾 2000年的栽培历史。目前，荸荠广泛栽培于我国长江流域及其以南各省，广西则以合浦、桂 林、贺州等地区广泛种植;在美国、朝鲜、越南、澳大利亚、日本等国亦有栽培。据不完全统 计，1998年我国荸荠栽培面积约为3.5万hm 2，年产75万t左右;2011年广西荸荠种植面积达2 万hm2,总产量达60万t，面积和产量占全国的一半以上，荸荠产业收入达18亿元以上，主要 供国内市场鲜销，仅部分加工成罐头或冷藏，经我国香港或台湾转销东南亚和欧美各国，并 且出口量逐年增加，如美国1983~1987年4年间进口数量几乎增加了2.5倍。
[0003] 荸荠球茎营养丰富，汁多味甜，自古以来就有"地下雪梨"的美誉，北方人更将其视 为"江南人参"。荸荠富含多种营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、胡萝卜素、维 生素8132、(：、尼克酸和各种矿物质。荸荠既可生吃，亦可熟食，还可制成各种罐头、饮料。荸 荠的地上茎杆和地下球茎均可入药，具有很好的医疗保健效果，如抗肿瘤作用、抗菌作用、 治疗呼吸道疾病、利肠通便和利尿排淋作用、治疗糖尿病、清肺化痰。荸荠球茎表皮中含有 丰富的棕色素，提取后可用做食品添加剂。另外，荸荠植株可以吸收湿地中放射性物质铀， 对湿地铀污染有一定的净化作用。荸荠因其独特的营养价值和药用功效，现今已成为大众 喜爱的季节性蔬菜。
[0004] 但是，荸荠在栽培过程中常受病害侵扰，其中以杆枯病(俗称"荸荠痕"）发生最为 严重。该病主要为害叶鞘、叶状茎、花器等部位，严重影响荸荠的产量和品质。该病病原为荸 养柱盘孢菌Cylindrosporium eleocharidis Lentz，属半知菌类黑盘孢目柱盘孢属。近几 年来，随着荸养种植面积的扩大和连作，荸荠杆枯病也呈逐年上升趋势。发病年一般病杆率 20 %~50 %，重病田块可达100 % ;球茎损失在45 %以上，以至有的田块颗粒无收。尽管政府 部门已对杆枯病予以高度重视，广大的科技人员也付出大量的心血研究控制措施，但由于 致病机理尚不清楚，远不能达到有效地遏制该病蔓延和传播的要求。为了更好地防治该病， 对该病菌的致病分子机理进行深入研究具有重要意义。分离和鉴定荸荠杆枯病菌致病相关 基因是关键所在，而建立真菌遗传转化技术创造致病性缺陷突变体则是分离和鉴定致病性 相关基因的一种有效途径。
[0005] 目前，丝状真菌遗传转化技术已成为植物病原真菌分子遗传和基因功能研究的重 要手段。由农杆菌介导的真菌遗传转化技术(ATMT)已经成功应用于U.maydis、Pseudozyma antarctica、U.hordei、S. scitamineum等黑粉菌及其它丝状真菌中。农杆菌介导的真菌转 化相比其它几种真菌转化方法(PEG-MT、REMI、基因枪等)具有以下的优点：1)转化受体可以 是多种类型，既可以是原生质体，又可以是菌丝、分生孢子，甚至蘑菇的菌丝体组织。因此， 相比PEG-MT和REMI，利用ATMT转化可以省略原生质体制备的繁琐步骤，省力又省时。2)成本 低，转化不需要复杂的仪器，任何实验室只要具有微生物培养的基本实验条件，都可以进行 这种转化。3)转化效率较高，据报道同时用PEG和ATMT对Venturia inaequalis转化后发现， ATMT的转化效率要比PEG-MT的高出10倍。4)随机插入的T-DNA多为单拷贝。5)获得的转化子 稳定，由ATMT得到的转化子，在没有选择压力的培养基上培养几代后也不会丧失抗生素抗 性。迄今，未见荸荠杆枯病菌遗传转化体系相关报道，因此，建立荸荠杆枯病菌的遗传转化 体系，应用于荸荠杆枯病菌致病相关基因的研究将有助于解析荸荠杆枯病菌的致病机制， 对推动荸养杆枯病菌分子生物学研究意义重大。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、转化效率高、稳定性好的根癌农 杆菌介导的荸荠杆枯病菌的遗传转化方法，该法获得的转化子可为筛选弱致病性和致病性 缺陷性突变体提供丰富的筛选菌源。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:根癌农杆菌介导的荸荠杆枯病 菌的遗传转化方法，以荸荠杆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农 杆菌与荸荠杆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。
[0008] 荸荠杆枯病菌分生孢子按以下操作制备:在马铃薯-葡萄糖-琼脂培(PDA)养基上 将荸#杆枯病菌培养15-20天后，用灭菌的去离子水将荸#杆枯病菌的分生孢子刮下，然后 用无菌擦镜纸过滤去除菌丝，得到的荸荠杆枯病菌分生孢子滤液用去离子水调整到浓度为 10 5-108孢子/毫升，获得荸荠杆枯病菌分生孢子悬浮液备用。
[0009] 含有双元载体的根癌农杆菌按以下操作准备:利用携带绿色荧光蛋白基因 eGFP和 潮霉素抗性筛选基因 hpth的质粒pEV为转化载体，通过电击转化将质粒pEV载体转入农杆菌 感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养液中，28°C，200rpm， 培养过夜，用頂液体培养液将菌液稀释〇D 6(x)至0.15左右，28°C下预诱导培养6h，使菌液OD600 调至为0.5备用。
[0010] MM液体培养液为基本培养基，其配方为：1.45g KH2P〇4,2.05g K2HP〇4,0.5g NH4N03,0.01g CaCl2,0.3g(NH4)S〇4,2g Glucose，0.01g FeS〇4,5ml Z-buffer，加双蒸水定 容至 1000mL，pH6.7-7.0;诱导培养基（induce mediaJM)配方为：lg Glucose，7.808g MES， 1.45g KH2P〇4,0.5g NH4N03,0.6g MgS〇4.7H20,0.01g CaCl2,0.3g NaCl，0.5g(NH4)S〇4，HCl 调pH值到5.6，双蒸水定容至1000mL。
[0011] 共培养按以下操作进行:分别取荸养杆枯病菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液各 l〇〇yL混合后涂板于含AS的覆盖有纤维素滤膜的頂固体培养基上，24°C下共培养48h-72h; 頂固体培养基由每升诱导培养基(IM)加25克琼脂构成。
[0012] 抗生素筛选按以下操作进行：转移纤维素滤膜至含有潮霉素 B和头孢噻肟钠的 PDA，28°C下培养8-12d;将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有潮霉素 B的PDA上进行二次 筛选，第二次筛选获得的抗潮霉素 B的荸荠杆枯病菌即为转化子。
[0013] 为研究荸荠杆枯病菌的致病机制，发明人建立了一种根癌农杆菌介导的荸荠杆枯 病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠杆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元 载体的根癌农杆菌与荸荠杆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化 子，从而建立了荸荠杆枯病菌高效的遗传转化体系。该法操作简单、转化效率高且稳定性 好，以此构建荸荠杆枯病菌突变体库，由农杆菌介导介导荸荠杆枯病菌的遗传转化获得的 转化子可为筛选弱致病性和致病性缺陷的荸荠杆枯病菌菌株提供了丰富的筛选菌源，同时 为克隆荸荠杆枯病菌致病性相关基因，深入研究荸荠杆枯病菌致病机理奠定基础。
【附图说明】
[0014]图1是荸荠杆枯病菌菌落和分生孢子，图中：A荸荠杆枯病菌菌落，B荸荠杆枯病菌 分生孢子。
[0015]图2是双元载体结构示意图。
[0016] 图3是荸荠杆枯病菌荧光鉴定结果他，图中：A是在绿色荧光滤镜下的荸荠杆枯病 菌菌落，B是在明场下的荸荠杆枯病菌菌落。
[0017] 图4是荸荠杆枯病菌转化子PCR鉴定图，图中:M是marker 2k，1-13是荸荠杆枯病菌 转化子，14是荸荠杆枯病菌野生型，15是无菌水阴性对照，16是质粒pEV。
[0018] 图5是荸养杆枯病菌转化子southern blot图，图中：Marker :marker lkb，1-11:荸 养杆枯病菌转化子
【具体实施方式】
[0019] 实施例1荸荠杆枯病菌T-DNA插入转化子的获得
[0020] 1>荸荠杆枯病菌分生孢子的制备(一切操作在无菌条件下进行）
[0021] 在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)上将荸荠杆枯病菌（图1A)培养15-20天后，用 灭菌的去离子水将荸荠杆枯病菌的分生孢子刮下，然后用无菌擦镜纸过滤去除菌丝，得到 的荸荠杆枯病菌分生孢子滤液用去离子水调整到浓度为1〇 5-1〇8孢子/毫升，获得荸荠杆枯 病菌分生孢子(图1B)悬浮液备用。
[0022] 2>含载体农杆菌的准备
[0023]利用携带绿色荧光蛋白基因 eGFP和潮霉素抗性筛选基因 hp th (图2)的质粒pEV为 转化载体，通过电击转化将质粒pEV载体转入农杆菌感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌 农杆菌菌体至5mL的MM液体培养液中（状观霉素100yg/mL和利福平50yg/mL)，28 °C，200rpm， 培养过夜，用IM液体培养液将菌液稀释0D6QQ至0.15左右，28 °C下预诱导培养6h，28 °C， 200rpm，使菌液0D6qq调至为0.5左右备用。
[0024] 其中，MM液体培养液为基本培养基(minimal media，MM)，其配方为：1.45g KH2P〇4， 2.05g K2HP〇4,0.5g NH4N03,0.01g CaCl2,0.3g(NH4)S〇4,2g Glucose，0.01g FeS〇4,5ml Z-buffer (每种成分各0 · 01 % CuS〇4*5H20，ZnS〇4*7H20，MnS〇4*H20，H 3B03和NaMb04*2H20)，加双 蒸水定容至 1000mL，pH6 · 7-7 · 0;
[0025] 诱导培养基（induce media，IM)配方为：lg Glucose，7 · 808g MES，1 ·45g KH2PO4， 0.5g NH4N03,0.6g MgS〇4.7H20,0.01g CaCl2,0.3g NaCl，0.5g(NH4)S〇4，HCl调pH值到5.6， 双蒸水定容至l〇〇〇mL。
[0026] 3> 转化
[0027] 分别取荸荠杆枯病菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液各100yL混合后涂板于含AS (200μ mol/L)的覆盖有纤维素滤膜的頂固体培养基（由每升诱导培养基（頂)加25克琼脂构 成)上，24°C下共培养48h-72h(黑暗条件下）；转移纤维素滤膜至含有潮霉素 B(200yg/mL)和 头孢噻肟钠(300yg/mL)的PDA，28°C下培养8-12d;将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有 潮霉素 B(100yg/mL，）的TOA上进行二次筛选，第二次筛选获得的抗潮霉素 B的荸荠杆枯病菌 即为转化子。
[0028]实施例2荸荠杆枯病菌转化子的鉴定 [0029] 1>荧光显微镜鉴定
[0030] 将荸荠杆枯病菌转化子菌落置于荧光显微镜下观察荧光。荸荠杆枯病菌野生型没 有检测到荧光，经农杆菌转化后的转化子在荧光显微镜紫外激发光下发绿光，证明农杆菌 的绿色荧光蛋白GFP已经成功转到荸荠杆枯病菌中并得以表达(图3)。
[0031] 2)PCR 验证
[0032]以双元载体pEV上的潮霉素基因（hpth(SEQ · ID · No · 1))为模板设计引物hpth-F: GCGTGGAGAAGTTCCTCATCGAGA(SEQ.ID.No.2)/hpth-R：GAGCCTTGGGCTTCCAGCAA (SEQ. ID.No.3)对转化子进行PCR扩增，以初步验证是否得到真正有插入的突变体。
[0033] ?0?反应液组成（25以1^体系）：25.(^1^反应体系中，加入2.5以1^10\?0?81^6广2.0 yL 2.5ymol/L dNTP、1.0yL 5μ mol/L正向引物hpth-F、1.0yL 5μ mol/L反向引物hpth-R， 1.0U Taq DNA聚合酶和l.OyL DNA，用ddH20补至25.0μΙ^Ρ0Κ扩增反应程序：95°C预变性 2min，然后94°C变性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸lmin，进行30个循环；最后72°C延伸 10min〇
[0034] 结果表明，所有测试的转化子及质粒pEV均能扩增出预期的约758bp大小的片段， 而未经转化的野生型菌株和无菌水对照则扩增不到任何条带，说明转化子含有T-DNA插入 片段(图4)。
[0035] 3)southern blot验证
[0036]为进一步验证荸养杆枯病菌转化子T-DNA插入和拷贝数，对荸养杆枯病菌转化子 进行southern blot。对荸#杆枯病菌转化子DNA采用EcoR I内切酶进行酶切，然后进行 0.8%琼脂糖凝胶电泳。将电泳凝胶转入尼龙膜(Roche，Cat.No. 11 417 240 001)，以引物 hpth-F/hpth-R扩增得潮霉素基因 hpth片段为探针，PCR反映体系同2)，随后的分子杂交采 用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche，Cat.No. 11 636 090 910)，显色反应采用DIG Nucleic Acid Detection Kit(Roche，Cat.No. 11 175 041 910)进行，具体步骤参考产品 使用说明书。
[0037]结果表明，所有测试的11个荸荠杆枯病菌转化子均能检测到杂交信号，且杂交信 号表现丰富带型；除了2个转化子为双拷贝外，其他转化子均为单拷贝，说明T-DNA在转化子 中为随机插入，且80%以上为单拷贝（图5)。
【主权项】
1. 一种根癌农杆菌介导的荸荠杆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠杆枯病菌 分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸#杆枯病菌分生孢子混合后 共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。2. 根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的荸荠杆枯病菌的遗传转化方法，其特征在 于所述荸荠杆枯病菌分生孢子按以下操作制备:在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)上将 荸#杆枯病菌培养15-20天后，用灭菌的去离子水将荸#杆枯病菌的分生孢子刮下，然后用 无菌擦镜纸过滤去除菌丝，得到的荸荠杆枯病菌分生孢子滤液用去离子水调整到浓度为 10 5-108孢子/毫升，获得荸荠杆枯病菌分生孢子悬浮液备用。3. 根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的荸荠杆枯病菌的遗传转化方法，其特征在 于所述含有双元载体的根癌农杆菌按以下操作准备:利用携带绿色荧光蛋白基因 eGFP和潮 霉素抗性筛选基因 hpth的质粒pEV为转化载体，通过电击转化将质粒pEV载体转入农杆菌感 受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养液中，28°C，200rpm，培 养过夜，用頂液体培养液将菌液稀释〇D 6Q()至0.15左右，28 °C下预诱导培养6h，使菌液OD6〇〇调 至为0.5备用。4. 根据权利要求3所述的根癌农杆菌介导的荸荠杆枯病菌的遗传转化方法，其特征在 于所述MM液体培养液为基本培养基，其配方为：1.45g KH2P〇4,2.05g K2HP〇4,0.5g NH4N03， O.Olg CaCl2,0.3g(NH4)S〇4,2g Glucose，0.01g FeS〇4,5ml Z-buffer，加双蒸水定容至 1000mL，pH6 · 7-7 · 0;所述诱导培养基（induce media，頂)配方为：lgGlucose，7 · 808g MES， 1.45g KH2P〇4,0.5g NH4N03,0.6g MgS〇4.7H20,0.01g CaCl2,0.3g NaCl，0.5g(NH4)S〇4，HCl 调pH值到5.6，双蒸水定容至1000mL。5. 根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的荸荠杆枯病菌的遗传转化方法，其特征在 于所述共培养按以下操作进行:分别取所述荸#杆枯病菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液 各100yL混合后涂板于含AS的覆盖有纤维素滤膜的IM固体培养基上，24°C下共培养48h-72h;所述頂固体培养基由每升诱导培养基(IM)加25克琼脂构成。6. 根据权利要求5所述的根癌农杆菌介导的荸养杆枯病菌的遗传转化方法，其特征在 于所述抗生素筛选按以下操作进行:转移纤维素滤膜至含有潮霉素 B和头孢噻肟钠的PDA， 28°C下培养8-12d;将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有潮霉素 B的TOA上进行二次筛选， 第二次筛选获得的抗潮霉素 B的荸荠杆枯病菌即为转化子。
【文档编号】C12N15/84GK105969799SQ201610538815
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】颜梅新, 江文, 欧昆鹏, 桂杰, 董伟清, 高美萍, 何芳练, 张尚文
【申请人】广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所