一种在家蚕丝腺中表达重组i型类人胶原蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，利用家蚕后部丝腺生产具有广泛用途和经济价值的Ⅰ型类人胶原蛋白。该方法获得的重组I型类人胶原蛋白能够在家蚕丝腺中稳定表达，并在后代延续。
【专利说明】
一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域和家蚕领域，特别涉及基因工程领域，通过基因重组的办法在家蚕丝腺中获得了重组I型类人胶原蛋白表达。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是哺乳动物结缔组织关键的结构蛋白质，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。胶原蛋白凭借其强度和稳定性，以及与活体组织的兼容性，作为生物材料被广泛应用于多种医疗领域和美容保健等方面。纤维状胶原蛋白主要分为I，II，ΙΙΙ，ν，ΧΙ五类，不同类型胶原蛋白在组织细胞及生理功能等有明显差异。I型胶原蛋白是最主要和最先被鉴定的纤维状胶原蛋白，是结缔组织与骨骼的主要蛋白质，对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号起重要作用。
[0003]目前，胶原蛋白的主要来源是动物皮肤，而这种来源含有高致病风险，同时也可能会引起过敏性反应。随着对胶原蛋白需求的日益增加，原先从屠宰动物体的皮革、骨骼中提取胶原的方式已经不能满足日益增长的胶原蛋白的需求，而且还可能有致病之虞。因此，急需要一种能够代替此来源，并大量生产胶原蛋白的新方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，公开一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，利用家蚕后部丝腺生产具有广泛用途和经济价值的I型类人胶原蛋白。该方法获得的重组I型类人胶原蛋白能够在家蚕丝腺中稳定表达，并在后代延续。
本发明的技术方案如下:
一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，包括:
1)构建转基因载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP;
2)将转基因质粒pBFL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2?5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10?15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化；
3)G1代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。
[0005]优选的，构建转基因载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP包括:
1)扩增克隆HCool-1cDNA；
2)构建pMD-FL-HCoo1-1 -pA载体；
3)构建pBFLHCool-1- A3EGFP载体；
4)构建pMD-FL-BmP4Ha-pA 载体；
5)构建目标载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP。
[0006]优选的，况oo>I cDNA序列如序列I所示； 同样优选的，1W-1 cDNA序列翻译的蛋白序列如序列2所示；
更为优选的，-L启动子序列如序列3所示；
再优选的，郝a cDNA序列如序列4所示；
本发明还包括一个优选的技术方案，经显微注射后的蚕卵在培养箱中培育孵化条件为25 °C、90% 湿度。
[0007]更进一步的，G1代幼虫由所述的显微注射后的蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化，经约Ild左右孵化，孵化出的幼虫GO代用桑叶饲养至结茧，羽化后与正常的蚕蛾交配，由雌蛾产生Gl代蚕卵，单独孵化为Gl代幼虫。
[0008]本发明方法与现有技术相比，具有以下有益效果:通过将VCooJ-1cDNA和家蚕脯氨酰4-羟化酶α-亚基cDNA同时转入早期胚胎并通过丝素轻链(ΛΚ)启动子在后部丝腺表达，获得具有完整生物学功能的I型类人胶原蛋白，并揭示在家蚕中稳定遗传表达I型类人胶原蛋白的方法。
【附图说明】
[0009]图1:显微注射不意图；
图2:1型类人胶原蛋白转基因家蚕阳性个体EGFP标记的荧光检测图，其中A图是在体视显微镜下对照图，检测无荧光;B图为显微注射后的幼虫在体视显微镜下存在荧光现象;C图为5龄4天幼虫在小动物活体成像系统的荧光现象，其中C图左侧两条家蚕幼虫为对照，右侧两条家蚕幼虫是经过显微注射转基因质粒的蚕卵经培养的幼虫，能明显观察到绿色荧光现象，确认幼虫阳性EGFP荧光。
【具体实施方式】
[0010]本发明家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，包括:
1)构建转基因载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP;
2)将转基因质粒pBFL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2?5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10?15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化；
3)G1代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。
[0011]为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下:
实施例一:转基因载体pBFLHCoo 1-1 -FLBmP4Ha-A3EGFP的构建
I.扩增及克隆见OOhI cDNA:1型类人胶原蛋白(HCool-1)cDNA的人工设计与RT-PCR扩增参考人类I型胶原蛋白基因序列(GenBank Access1n N0.Z74615)及能促进细胞信号传导、基质金属蛋白酶的生成和细胞胶原蛋白相互作用等发挥重要生理功能的特征序列，设计引物:HCool-1-V: 5 ’ -CCCCCGGGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGG-3 ’，HCool-1- R: 5 ’ -CGGGGTACCCTAGCGTTCACCTGGTAGGCCAAC-3’，(分别设计I和I限制性内切酶位点)；以I型类人胶原蛋白(HCool-1)cDNA克隆作为RT-PCR扩增模板，扩增见片段，回收目的片段并与PMD-20T载体连接，筛选出阳性克隆并测序，DNAStar 5.0分析软件分析测序结果，确证扩增序列。家蚕脯氨酰4-羟化酶α-亚基如cDNA的扩增参考家蚕(GenBankAccess1n N0.AY099068)设计弓I 物尸4"a-F:5’_CCCATATGATGGAAACAGTAAGAGCGATAGCT-3，B m P 4 Ha - R: 5 ’ -
限制性内切酶位点)；
回收目的片段并与PMD-20T载体连接，筛选出阳性克隆并测序，DNAStar 5.0分析软件分析测序结果，经序列比对分析，确证扩增序列，详见序列1，该序列与I型类人胶原蛋白(HCool-1)cDNA并不完全一样，其区别在于截取I型类人胶原蛋白(HC001-1)cDNA部分效应cDNA，使其使用与家蚕丝腺后部表达，其表达蛋白的氨基酸序列如序列2所示，其中GPQGIAGQRGVVGLP(P，Hyp)序列具有促进细胞信号传导、基质金属蛋白酶的生成，具有高度活跃的成纤维细胞结合性等功能，GER三肽序列具有参与细胞附着、血小板聚集，GER对于血管生成也是必须的。
[0012]2.构建pMD-FL-HCool-1-pA载体:将已克隆到pMD-20T载体的#Coo>I cDNA用
I和命/3 I双切酶，回收片段连接到通过同样酶切的含/iA-L启动子序列和polyA加尾信号序列的中间载体pMD-FL-pA中，构建成pMD-FL-HCool-1-pA载体，含/if L启动子序列如序列3所示，该序列为家蚕后部丝腺表达重组I型类人胶原蛋白基因5 ’端调控序列；
3.构建pB FLHCool-1- A3EGFP载体:将pMD-FL-HCool-1-pA载体用及?oRI和份/κΙΙΠ双切酶，回收含/M-L启动子和polyA序列的优bW-1片段，连接到通过同样酶切的pBA3EGFP载体，构建成PB FLHCool-1- A3EGFP载体。
[0013]4.构建pMD-FL-BmP4Ha-pA载体:用M/eMPfe mH I 双切酶已含有他 P4Ha cDNA克隆的PMD-20T载体，回收片段连接到通过同样酶切的中间载体pMD-FL-pA中，构建成pMD-FL-BmP4Ha-pA载体，他cDNA序列如序列4所示，该序列为家蚕后部丝腺表达重组I型类人胶原蛋白基因3’端调控序列；
5.构建目标载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP:将pMD-FL_BmP4Ha-pA载体用Sa cl和双切酶，回收含/?/7-L启动子和polyA序列的BmP4Ha片段，连接到通过同样酶切的pBFLHCool-1-A3EGFP载体，构建成目标pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP载体。
[0014]实施例二:产后2h家蚕蚕卵显微注射，剂量1nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分别抽提转基因载体和辅助质粒pHA3PIG质粒DNA，其原理是做ggyfec转座子介导的家蚕早期胚胎显微注射法(Tamura，2000年)，能获得稳定遗传的转基因家蚕。本发明根据特有的转基因质粒PB FL-HCoo 1-1 -pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP，将转基因质粒pB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为I: I，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射的方法注射入产后2h的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，以防止细菌和真菌感染。经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化。
[0015]实施例三:产后2h家蚕蚕卵显微注射，剂量15nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分别抽提转基因载体和辅助质粒pHA3PIG质粒DNA，具体是将转基因质粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射的方法注射入产后2h的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，以防止细菌和真菌感染。经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化。
[0016]实施例四:产后3h家蚕蚕卵显微注射，剂量1nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分别抽提转基因载体和辅助质粒pHA3PIG质粒DNA，具体是将转基因质粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射的方法注射入产后3h的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，以防止细菌和真菌感染。经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化。
[0017]实施例五:产后3h家蚕蚕卵显微注射，剂量15nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分别抽提转基因载体和辅助质粒pHA3PIG质粒DNA，具体是将转基因质粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射的方法注射入产后3h的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射15nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，以防止细菌和真菌感染。经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化。
[0018]实施例六:产后5h家蚕蚕卵显微注射，剂量1nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分别抽提转基因载体和辅助质粒pHA3PIG质粒DNA，具体是将转基因质粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射的方法注射入产后5h的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，以防止细菌和真菌感染。经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化。
[0019]实施例七:产后5h家蚕蚕卵显微注射，剂量15nL
利用QIAGEN的Plasimd Midi Kit分别抽提转基因载体和辅助质粒pHA3PIG质粒DNA，具体是将转基因质粒PB FL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为1:1，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射的方法注射入产后5h的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射15nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，以防止细菌和真菌感染。经甲醛蒸气再次消毒后，蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化。
[0020]实施例八:荧光检测
将实施例二至实施例七中获得的蚕卵放在25 °C、90%湿度的培养箱中培育孵化，蚕卵经约Ild左右孵化。孵化出的幼虫GO代用桑叶饲养至结茧，羽化后与正常的蚕蛾交配，每一个雌蛾的Gl代蚕卵分别单独孵化，将Gl代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜(Olympus)下筛选阳性个体，5龄4天幼虫进一步使用小动物活体成像系统(IVIS spectrum,Calipur PerkinElmer)确认阳性EGFP荧光。上述实施例二至实施例七中获得的蚕卵均在体视显微镜和小动物活体成像系统观察到EGFP荧光，如图2所示:1型类人胶原蛋白转基因家蚕阳性个体EGFP标记的荧光检测图，其中A图是在体视显微镜下对照图，检测无荧光;B图为显微注射后的幼虫在体视显微镜下存在荧光现象;C图为5龄4天幼虫在小动物活体成像系统的荧光现象，其中C图左侧两条家蚕幼虫为对照，右侧两条家蚕幼虫是经过显微注射转基因质粒的蚕卵经培养的幼虫，能明显观察到绿色荧光现象，确认幼虫阳性EGFP荧光。。确定转基因阳性的Gl代同蛾区的雌雄蚕蛾交配产卵为G2代(按SHCP系列命名)。将G2代蚕卵按25°C、85%湿度培养箱中培育，每一个雌蛾的蚕卵也单独孵化，再在同一区中挑选出转基因阳性的雌雄蚕蛾自交产卵，产生G3代。
[0021]利用/7基因技术构建家蚕丝腺生物反应器生产胶原蛋白是一种安全、高效的生产重组类人胶原蛋白的方法。I型类人胶原蛋白不仅是确立组织细胞形状的结构蛋白，也对维持细胞的完整性及传递细胞外信号起重要作用。胶原蛋白分子由一个GXY三联子不间断序列构成的中心三螺旋结构域，在I型胶原蛋白中，X和Y可以是任何残基，但X主要是脯氨酸，Y主要是羟脯氨酸，占了总三肽数量的44%，在三螺旋域G-X-Y重复序列Y-处，脯氨酸残基的4-羟基化修饰是在生理条件下形成热稳定三螺旋胶原蛋白分子的关键步骤，也是胶原蛋白生物合成后完整发挥活性功能所必需的翻译后修饰。本发明通过将//CoW-1cDNA和家蚕脯氨酰4-羟化酶α-亚基cDNA同时转入早期胚胎并通过丝素轻链(fib~L)启动子在后部丝腺表达，获得具有完整生物学功能的I型类人胶原蛋白JHCool-1)，为后期大量工业化获得I型类人胶原蛋白(HCool-1)做好了准备，具有非常重要的经济价值。
[0022]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:包括: (1).构建转基因载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP; (2).将转基因质粒pBFL-HCool-1-pA-FL-BmP4Ha-pA-A3EGFP和pHA3PIG质粒以浓度比为I: I，总DNA浓度为400 ng/yL的比例混合，通过显微注射将转基因质粒注射入产后2?5 h以内的家蚕蚕卵中，每粒蚕卵注射10?15 nL，注射后立即用无毒胶水封闭注射孔，经甲醛蒸气再次消毒后，经显微注射后的蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化； (3).Gl代的幼虫或蛹置于体视荧光显微镜下筛选阳性个体，5龄4天幼虫使用小动物活体成像系统确认幼虫阳性EGFP荧光。2.如权利要求1所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的构建转基因载体pBFLHCoo 1-1-FLBmP4Ha-A3EGFP包括: (1).扩增克隆cDNA； (2).构建pMD-FL-HCool-1-pA载体； (3).构建pBFLHCool-1- A3EGFP载体； (4).构建pMD-FL-BmP4Ha-pA 载体； (5).构建目标载体pBFLHCool-1-FLBmP4Ha-A3EGFP。3.如权利要求2所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的况oW-1 cDNA序列如序列I所示。4.如权利要求2所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的cDNA序列翻译的蛋白序列如序列2所示。5.如权利要求2所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的/M-L启动子序列如序列3所示。6.如权利要求2所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的咖cDNA序列如序列4所示。7.如权利要求2所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的经显微注射后的蚕卵在培养箱中培育孵化条件为25°C、90%湿度。8.如权利要求2所述的在家蚕丝腺中表达重组I型类人胶原蛋白的方法，其特征在于:所述的Gl代幼虫由所述的显微注射后的蚕卵放在25°C、90%湿度的培养箱中培育孵化，经约Ild左右孵化，孵化出的幼虫GO代用桑叶饲养至结茧，羽化后与正常的蚕蛾交配，由雌蛾产生Gl代蚕卵，单独孵化为Gl代幼虫。
【文档编号】A01K67/04GK105969800SQ201610289773
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】徐豫松, 王华兵, 占鹏飞
【申请人】浙江大学