家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。获得包含丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、His 6序列、DDDDK、丝素轻链蛋白信号肽基因、丝素轻链基因polyA、家蚕肌动蛋白基因A3启动子、EGFP基因和SV40的3’序列，然后再构建质粒，第一表达框包括A3启动子、EGFP基因和SV40的3’序列，第二表达框包括丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、His 6序列、DDDDK和丝素轻链基因polyA，且含有ApaI和NheI两个酶切位点。本发明质粒减少了构建转基因家蚕donor质粒的构建工作量，提高了家蚕生物反应器工作效率，提高了外源蛋白的表达量。
【专利说明】
家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法 和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及了一种质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及了一种家蚕后部丝腺生 物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中 分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载 体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb,可以实 现多基因的共表达。
[0003] piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各 国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子（Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(SerlPromoter)表 达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。
[0004] 由于piggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所 以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因 、polyA 等结构，费时费力，工作效率低下。
[0005] 另一方面，纵观十几年来国内外家蚕生物反应器的研究结果，转基因家蚕丝腺生 物反应器的外源蛋白表达效率都很低，不管是丝胶启动子驱动表达的外源基因，还是丝素 启动子驱动表达的外源基因，极大多数实验的表达量都没有在茧层量的1 %左右，远远没有 达到科学家们期望的象表达蚕丝蛋白那样的高效表达水平。
【发明内容】
[0006] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种家蚕后部丝腺生 物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用，具体是利用常规构建质粒的生物技术 方法构建一种除目的基因外的、拥有包含其它所有必需元件的高效通用型质粒。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0008] -、一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒：
[0009] 所述的质粒为卩1^(3[厶346卩？-3￥40]-[卩1^692卩1'01]1〇七61-188冰熟-卩1'〇1]1〇七61-卩1^?-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座 子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。
[0010] 一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Pr〇m 〇ter- EGFP-SV40,另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA、丝素蛋白 轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框， 艮PFibroin L chain Promoter_18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK_Fibroin L chain PolyA。
[0011] 所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的Apal和Nhel的两个酶切位点，两个酶切位点 用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。
[0012] 二、一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法： [0013]1)将3\卩3、〇81^(1、3￥40小1^ 692、6卩?和3￥40的多个功能基因相依次连接获得包含 3 XP3-DsRed-SV40-FL 692-GFP-SV40功能元件的piggyBac质粒piggy-7801;
[0014] 2)以piggyBac质粒piggy-7801为模板，piggyBac质粒piggy-7801 的碱基序列如 SEQ ID N0.1，以如SEQ ID N0.2的ggtacctttagtggtctgttatgtgaccaatcg序列 1 和如SEQ ID 勵.3的8381:1：(^1^338〇8〇3七31^883〇31：(^(31:1:1:1：(3序列2为引物，采用？0?扩增获得丝素轻链基 因启动子，该启动子5 '端带有EcoRI和Af III两个酶切位点，3 '端带有ΚρηΙ酶切位点，片段长 度为700bp，该启动子的碱基序列如SEQ ID Ν0.4;
[0015] 3)用EcoRI和ΚρηΙ双酶切pUC19质粒得到包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段， 连接包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段和步骤2)获得的丝素轻链基因启动子，得到包 含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因的piggyBac质粒piggy-3378;
[0016] 4)用BamHI和Xbal双酶切包含丝素轻链蛋白信号肽和六聚组氨酸的piggyBac质粒 piggy-2767，piggyBac质粒piggy-2767的碱基序列如SEQ ID N0.5,得到长度为80bp包含 FLSP-his的片段，FLSP-his的碱基序列如SEQ ID N0.6;
[0017] 5)用BamHI和Xbal双酶切步骤3)获得的piggyBac质粒piggy-3378,得到长度为 3372bp的包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段，连接包含丝素轻链基因启动子和 Amp抗性基因片段和步骤4)获得的包含FLSP-His6的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的质粒piggy-3452;
[0018] 6)体外合成肠激酶酶切位点的两条DDDDK单链，其碱基序列如SEQ ID NO. 7,通过 在94 °C退火处理后形成双链，用Sail和PstI双酶切步骤5)获得的质粒piggy-3452,得到长 度为3442bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL 692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的片段；
[0019] 连接DDDDK双链与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和 Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠 激酶酶切位点DDDDK序列(FL 692-FLSP-His6-DDDDK)和Amp抗性基因的质粒piggy-3480;
[0020] 7)将丝素轻链基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、 人血清白蛋白基因和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-人血清白蛋白基因-丝素轻链P〇lyA (FL 692-FLSP-Hi s 6-DDDDK-HSA-FLPA)的质粒piggy-8449，质粒piggy-8449的碱基序列如 SEQ ID N0.8,以质粒piggy-8449 为模板，以如 SEQ ID N0.9 的 CTGCAGATAAGAACTGTAAATAATGTATATA序列 3和如 SEQ ID NO. 10 的 AAGCTTAGATCTGTGTGACTGCTTCGGACTAC ATTCT序列4为引物，通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白 轻链3'序列FLPA，其碱基序列如SEQ ID NO. 11，该序列的5'端带有Pst酶切位点，3'端带有B gill和Hindm两个酶切位点，片段长614bp;
[0021] 用PstI和Hindm双酶切步骤6)获得的质粒piggy-3480,得到长度为3472bp的包含 丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列（FL 692-FLSP-Hi s 6-DDDDK)和Amp抗性基因的片段；
[0022]连接家蚕丝素蛋白轻链3 '序列FLPA与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信 号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启 动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列 (FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的piggy-4096质粒；
[0023] 8)将丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨 酸、肠激酶酶切位点和丝素轻链P〇lyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动 子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-丝素轻链 polyA(FL 692-18s rRNA-FLSP-His6-DDDDK-FLPA)的质粒piggy-8869,质粒piggy-8869的 碱基序列如SEQ ID N0.13,以质粒piggy-8869为模板，以如SEQ ID N0.13的 ggtaccACCTTCACCTCGTGAAGGCAG序列 5和如 SEQ ID NO. 14 的 ggatccAGCTCTCTTTTTCGTTAGCTCG序列6为引物，通过PCR扩增获得18s rRNA基因启动子，其 碱基序列如SEQ ID N0.15，该启动子的5 '端带有Kpra酶切位点，在3 '端加带BamM酶切位 点，片段长1176bp;
[0024] 用ΚρηΙ和BamHI双酶切步骤7)获得的piggy-4096质粒，得到长度为4081bp的包含 丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素 蛋白轻链3'序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的片段；
[0025] 连接18s rRNA基因启动子与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六 聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列和Amp抗性基因的片段，得到包 含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶 酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列(FL 692-18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和 Amp抗性基因的质粒piggy-5257;
[0026] 9)将A3基因启动子、绿色荧光蛋白基因、SV40 (A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因依次 连接获得包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40 (A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的质 粒piggy-6212,其碱基序列如SEQ ID N0.16,用ΑΠΙΙ和Bglll双酶切质粒piggy-6212,得到 长度为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；
[0027]用Aflll和BglII、Sca頂每切步骤8)获得的质粒piggy-5257,得到长度为2610bp的 包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激 酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列(FL 692-FLSP-His6-DDDDK-FLPA)的片段；
[0028] 连接包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的片段与包含丝素轻链基因启 动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕 丝素蛋白轻链3'序列的片段，得到包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝素轻链 基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序 列-家香丝素蛋白轻链3 ' 序列（[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter_18s rRNA-promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA])的质粒piggy-8480作为本发明所述的质粒，质粒piggy-8480其碱 基序列如SEQ ID N0.17。
[0029 ]三、本发明质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒的应用。
[0030] 本发明先设计引物，用PCR的方法，分别获得丝素轻链启动子、18s rRNA启动子、丝 素轻链polyA。体外合成丝素轻链信号肽-六聚组氨酸和肠激酶位点的序列;再分别用限制 性内切酶酶切相应的片段，电泳得到目的条带后，切胶回收，用T4连接酶将相应的片段相 连，使所需的元件（Fibroin L chain Promoter_18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK_Fibroin L chain PolyA)依次连接；将piggy-6212质粒中的 标记基因与上述元件整合到同一个质粒，得到含有双启动子的通用型质粒，最终如图1所 不。
[0031]本发明的有益效果是：
[0032]本发明的质粒能够只经一次酶切连接就完成表达各种外源基因 donor质粒的构 建，减少了每次从头构建donor质粒的工作量，提高家蚕后部丝腺生物反应器工作效率，并 且可利用双启动子的作用，提高外源蛋白的表达量。
【附图说明】
[0033]图1是本发明FL和18s rRNA双启动子通用型质粒的组成示意图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0035]本发明的实施例如下：
[0036] ⑴设计引物，以piggy-7801质粒(SEQ ID NO. 1)为模板，PCR扩增获得丝素轻链启 动子(SEQ ID N0.4)。引物在启动子5'端增加 EcoRI和Aflll两个酶切位点，在3'端增加 ΚρηΙ 一个酶切位点。用EcoRI和ΚρηΙ双酶切PCR产物，得到700bp的片段，即带有酶切位点的启动 子序列，回收700bp分子量的凝胶；用EcoRI和ΚρηΙ双酶切pUC19质粒，得到2670bp的片段，回 收2670bp分子量的凝胶;将所得到的2个片段连接。连接后的质粒命名为piggy-3378。
[0037] (2)用BamHI和Xbal双酶切piggy-2767质粒（SEQ ID N0.5)，得到80bp的目的片段， 即FLSP-His 6(SEQ ID觀.6)的序列，回收8(^?分子量的凝然；用8&111!11和乂匕31双酶切 piggy-3378质粒，得到3372bp的目的片段，回收3372bp分子量的凝胶;将两个片段连接，所 得的产物命名为Piggy-3452。
[0038] (3)体外合成两条DDDDK单链（SEQ ID N0.7)，94°C退火后形成双链，用Sail和PstI 双酶切Piggy-3452质粒，得到3442bp的目的片段，回收3442bp分子量的凝胶;连接DDDDK和 3442bp两个目的片段，连接后的质粒命名为piggy-3480。
[0039] (4)以 piggy-8449 质粒（SEQ ID N0.8)为模板设计引物（SEQ ID N0.9、SEQ ID NO. 10)，上游引物端加上PstI酶切位点，下游引物端加上BglII和Hindm酶切位点，PCR扩增 获得FLPA，产物的序列结构为Pstl-FLPA-Bglll-Hindm，用PstI和Hindm双酶切FLPA PCR 产物，得到624bp的目的片段（SEQ ID勵.11)，回收62牝？分子量的凝胶；用？5^1和把11(1111双 酶切Piggy-3452质粒，得到3472bp的目的片段，回收3472bp分子量的凝胶;连接上述两个目 的片段，连接后的质粒命名为piggy-4096。
[0040] (8)设计引物，以piggy-8869质粒（SEQ ID Ν0· 12)为模板，PCR扩增获得 18s rRNA 启动子（SEQ ID NO. 15)。并在启动子5 '端加 Kpra酶切位点，在3 '端加 BamHI酶切位点。用 ΚρηI和BamHI双酶切PCR产物，得到1176bp的目的片段，胶回收；用ΚρηI和BamHI双酶切 piggy-4096质粒，得到4081bp的目的片段，胶回收;连接两个目的片段，连接后的质粒命名 为piggy_5257。
[00411 (9)用Aflll和BglII、ScaI酶切piggy-5257质粒，得到2610bp的目的片段，胶回收； 用Aflll和Bglll双酶切piggy-6212质粒（SEQ ID勵.16)，得到587(^的目的片段，胶回收； 连接两个目的片段，连接后的质粒命名为piggy-8480(SEQIDN0.17)。即为包含A3基因启 动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白 信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列（以346??-3￥40]_ [FL692prom oter_18s rRNA-promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA])的通用型质粒。
[0042] (10)用Apal和Nhel双酶切piggy-8480质粒，得到长度为8478bp的包含[A3-EGFP- SV40]-[FL692promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA和Amp抗性基因的基 因序列。将上游端带有Apal酶切粘性末端序列、下游端带有Nhel酶切粘性末端序列的T4连 接酶基因与上述片段连接，构建成家蚕后部丝腺生物反应器表达T4连接酶基因的质粒 piggyBac-10004,该质粒包含的表达框序列为[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter_18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]〇
[0043] 上述结果说明，利用家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒piggy-8480， 仅仅一步就能够得到在家蚕后部丝腺表达T4连接酶基因的质粒。
[0044] 采用转基因家蚕技术将该双启动子质粒导入家蚕基因组，获得的转基因家蚕的T4 连接酶基因表达量，比用单个丝素轻链启动子启动的T4连接酶基因表达量高10%，结果差 异达到显著水平。
[0045] 说明利用本发明的家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒构建转基因家 蚕的donor质粒，操作程序简单，工作效率高，而且外源基因的表达量也有显著提高。
【主权项】
1. 一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为 pBac[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA]，是以 piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR 以及两个转座臂之间的两个功能表达框。2. 根据权利要求1所述的一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征 在于:一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Pr 〇m〇ter-EGFP-SV40,另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白 轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3'末端的表达框， 艮PFibroin L chain Promoter_18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK_Fibroin L chain PolyA〇3. 根据权利要求1或2所述的一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特 征在于： 所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的Apal和Nhel的两个酶切位点，两个酶切位点用于 将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。4. 一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法，其特征在于该方法 的步骤如下： 1) 将3 X P3、DsRed、SV40、FL 692、GFP和SV40的多个功能基因相依次连接获得包含3 X P3-DsRed-SV40-FL 692-GFP-SV40功能元件的piggyBac质粒piggy-7801; 2) 以 piggyBac 质粒piggy-7801 为模板，以如 SEQ ID N0.2 的 ggtacctttagtggtctgttatgtgaccaatcg序列 1 和如SEQ ID N0.3 的 gaattccttaagcgcatattggacatcccttttc序列2为引物，获得丝素轻链基因启动子； 3) 用EcoRI和ΚρηΙ双酶切pUC19质粒得到包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段，连接 包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段和步骤2)获得的丝素轻链基因启动子，得到包含丝 素轻链基因启动子和Amp抗性基因的piggyBac质粒piggy-3378; 4) 用BamHI和Xbal双酶切包含丝素轻链蛋白信号肽和六聚组氨酸的piggyBac质粒 piggy-2767，piggyBac质粒piggy-2767的碱基序列如SEQ ID NO. 5,得到长度为80bp包含 FLSP-His 6的片段(其碱基序列如SEQ ID N0.6); 5) 用BamHI和Xbal双酶切步骤3)获得的piggyBac质粒piggy-3378,得到长度为3372bp 的包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段，连接包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性 基因片段和步骤4)获得的包含FLSP-His6的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链 蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的质粒piggy-3452; 6) 体外合成肠激酶酶切位点的两条DDDDK单链，其碱基序列如SEQ ID NO.7,通过在94 °C退火处理后形成双链，用Sail和PstI双酶切步骤5)获得的质粒piggy-3452,得到长度为 3442bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片 段； 连接DDDDK双链与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp 抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激 酶酶切位点DDDDK序列和Amp抗性基因的质粒piggy-3480; 7) 将丝素轻链基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、人血 清白蛋白基因和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-丝素 轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-人血清白蛋白基因-丝素轻链P〇lyA的质粒 piggy-8449，以质粒piggy-8449 为模板，以如 SEQ ID N0.9 的 CTGCAGATAAGAACTGTAAATAATGTATATA序列 3和如 SEQ ID NO. 10 的 AAGCTTAGATCTGTGTGACTGCTTCGGACTACATTCT序列4为引物，获得家蚕丝素蛋白轻链3 '序列 FLPA； 用PstI和Hindm双酶切步骤6)获得的质粒piggy-3480,得到长度为3472bp的包含丝素 轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK)和Amp抗性基因的片段； 连接家蚕丝素蛋白轻链3'序列FLPA与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号 肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动 子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3 '序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的piggy-4096质粒； 8) 将丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、 肠激酶酶切位点和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-丝素轻链polyA 的质粒piggy-8869(其碱基序列如SEQ ID NO.12)，以质粒piggy-8869为模板，以如SEQ ID NO · 13 的 ggtaccACCTTCACCTCGTGAAGGCAG 序列 5 和如 SEQ ID N0.14 的 ggatccAGCTCTCTTTTTCGTTAGCTCG序列6为引物，获得18s rRNA基因启动子(其碱基序列如 SEQ ID NO.15)； 用ΚρηΙ和BamHI双酶切步骤7)获得的piggy-4096质粒，得到长度为4081bp的包含丝素 轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白 轻链3 '序列和Amp抗性基因的片段； 连接18s rRNA基因启动子与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组 氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝 素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切 位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3 '序列和Amp抗性基因的质粒piggy-5257; 9) 将A3基因启动子、绿色荧光蛋白基因、SV40 (A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因依次连接 获得包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的3 '序列(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因 的质粒piggy-6212,用Af III和Bglll双酶切质粒piggy-6212,得到长度为5870bp的包含A3 基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40 (A3-GFP-SV40)的片段； 用Aflll和BglII、Sca頂每切步骤8)获得的质粒piggy-5257,得到长度为2610bp的包含 丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶 切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列的片段； 连接包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的3'序列的片段与包含丝素轻链基 因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列的片段，得到包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝素 轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位 点序列-家蚕丝素蛋白轻链3'序列（[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA- promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLP A])的质粒piggy-8480(其碱基序列如SEQ ID N0.17)。5. -种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的应用，其特征在于:权利要求1 ~3所述的质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒。
【文档编号】C12N15/66GK105969802SQ201610290881
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】钟伯雄, 张玉玉, 叶露鹏
【申请人】浙江大学