一种(s)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1h-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种(S)?5?氯?2,3?二氢?2?羟基?1?氧代?1H?茚?2?羧酸甲酯的生物制备方法，其以5?氯?2,3?二氢?1?氧代?1H?茚?2?羧酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)?5?氯?2,3?二氢?2?羟基?1?氧代?1H?茚?2?羧酸甲酯，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20?30℃、pH为7.0?8.0的水相缓冲液中进行。与现有技术相比，本发明的整个反应过程中未使用危险品和有机羟化试剂，大大提高了生产过程的经济性，且对环境友好，底物转化率高。
【专利说明】
一种(S) -5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1 -氧代-1 竣酸甲酯 的生物制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧 代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法。
【背景技术】
[0002] 据世界粮农组织统计，由于病虫草害的侵扰给农作物造成的损失相当于世界每年 作物产量的三分之一。目前我国农药产品以有机磷、氨基甲酸酯等高毒农药为主，开发高 效、低毒、对环境安全的绿色杀虫剂迫在眉睫。
[0003] 噁二嗪类杀虫剂是继除虫菊酯、吡虫啉等杀虫剂之后人们发现的具有划时代意义 的新型杀虫剂。讳虫威(indoxacarb)是美国杜邦公司开发的新型P,惡二嗪类(oxadiazine)杀 虫剂，商品名Ammate/Avatar，为钠通道抑制广谱杀虫剂，对几乎所有的鳞翅目害虫均具有 杀灭能力，具有杀虫活性高、环境相容性好、对哺乳动物毒性低，对鸟类、鱼类以及益虫安全 的优点，是替代高毒有机磷杀虫剂的理想品种。
[0005] 讳虫威（indoxacarb)
[0006] 茚虫威的制备方法的关键是获得其手性中间体(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧 代-1H-茚-2-羧酸甲酯（1)。从绿色化学角度来看，从其前体5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2_羧酸甲酯一步羟化(2)是最有效的方法：
[0008]目前公开的生产化合物1的路线有美国杜邦公司（DUPONT)公开的专利，如W0 1992011249，US 5462938，US 5510505和W0 199529171等，该路线使用原料氢气，需加压釜 进行反应，存在爆炸等安全隐患；以及在以上专利的基础上做出某些改进的路线，如CN 105152958，CN 104193696和CN 104193620等。上述化学路线，通常在有机溶剂中进行，均需 要加入有机羟化试剂(如有机肼和金鸡纳碱），该类实际来源有限，价格昂贵，因此其经济性 和环境友好性有待提尚。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-卜氧代- 1H-茚-2-羧酸甲 酯的生物制备方法，其克服了现有技术的不足，经济性好，对环境友好。
[0010] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种(S)-5_氯-2,3_二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其以5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯 为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)-5-氯-2，3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述 的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20-30°C、pH为 7.0-8.0的水相缓冲液中进行，在起始反应体系中，所述底物5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的浓度为15-25mg/mL，所述的单加氧酶与底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:1-20。优选地，所述底物5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧 酸甲酯的浓度为20mg/mL，所述的单加氧酶与底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲 酯的质量比为1:10。
[0011] 优选地，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为 EW1531、EW1535、EW1536或EW1538的单加氧酶中的一种或多种的组合。
[0012] 进一步优选地，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为 EW1535的单加氧酶。
[0013] 优选地，起始反应体系中，所述的葡萄糖:葡萄糖脱氢酶:5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1.6-15:1:1-20;更为优选的，所述的葡萄糖:葡萄糖脱氢酶： 5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的投料质量比为15:1:10。
[0014] 优选地，所述的辅因子为NADP，其与5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的 质量比为1:1-100，更为优选地，NADP与5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量 比为1:100。
[0015] 优选地，所述反应在助溶剂条件下进行。
[0016] 进一步优选地，所述的助溶剂为环己烷、聚乙二醇400、聚乙二醇200、甘油、甲苯、 乙二醇、吐温-60中的一种或多种的组合。
[0017]优选地，所述的水相缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
[0018] 优选地，具体实施过程如下:在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液、底物5-氯-2,3_二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，搅拌均匀后，再加入所述的单加氧酶、辅因子、葡 萄糖、葡萄糖脱氢酶，在20-30°C温度条件下震荡反应，HPLC检测反应进程，当转化率达gO-99% 时 ，过滤除酶后 ，加入等体积乙酸乙酯进行多次萃取 ，合并有机相 ，脱去溶剂后得到 (S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯产品。
[0019] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明采用了 生物酶将5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯还原生成（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟 基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，整个制备过程在水相中进行，与现有技术相比，无需使用氢 气，不会存在爆炸的隐患；同时无需加入有机羟化试剂，经济性好，同时对环境友好，且底物 的转化率高、产物 ee值高。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施 例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施 条件为常规实验中的条件。
[0021] 实施例1
[0022] 在2mL离心管中，依次加入975yL 100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，加入底物5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯2mg，甲醇25yL，搅拌均匀后，加入不同的单加氧酶 (来自苏州汉酶生物技术有限公司）2mg，NADP 2mg，葡萄糖3.2mg，葡萄糖脱氢酶2mg，30°C下 震荡反应，24小时HPLC检测反应结果如表1。
[0023] 表 1
[0025]从表1中可看出，在其他反应条件相同的情况下，采用牌号为EW1535的单加氧酶， 底物的转化率最高，而采用牌号为EW1538的单加氧酶，产物e e值最高。
[0026] 实施例2
[0027] 在5mL离心管中，依次加入1950yL 100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，加入底物5- 氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯4mg，甲醇50yL，搅拌均匀后，加入单加氧酶EW 1538(来自苏州汉酶生物技术有限公司）lmg，NADP 0.5mg，葡萄糖6mg，葡萄糖脱氢酶lmg，不 同温度下震荡反应，HPLC检测反应结果如表2。
[0028]表 2
[0030]从表2中可看出，在其他反应条件相同的情况下，在30°C温度条件下反应时，底物 的转化率最高。
[0031] 实施例3
[0032] 在5mL离心管中，依次加入1950yL 100mM不同pH的缓冲溶液，加入底物5-氯-2,3- 二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯4mg，甲醇50yL，搅拌均匀后，加入单加氧酶EW1538(来自苏 州汉酶生物技术有限公司）lmg，NADP 0.5mg，葡萄糖6mg，葡萄糖脱氢酶lmg，30°C下震荡反 应，HPLC检测反应结果如表3。
[0033]表 3
[0035] 从表3中可看出，在其他反应条件相同的情况下，在pH为7.0的水相缓冲溶液中进 行上述反应，底物的转化率最高。
[0036] 实施例4
[0037] 在5mL离心管中，依次加入1900yL 100mM pH 7.0的缓冲溶液，加入底物5-氯-2,3- 二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯4mg，不同助溶剂100yL，搅拌均匀后，加入单加氧酶EW 1538(来自苏州汉酶生物技术有限公司）lmg，NADP 0.5mg，葡萄糖6mg，葡萄糖脱氢酶lmg，30 摄氏度下震荡反应，24小时HPLC检测反应结果如表4。
[0038]表4
[0040]从表4中可看出，在其他反应条件相同的情况下，以环己烷作为助溶剂时，底物的 转化率最高。
[0041 ] 实施例5
[0042] 在100mL反应容器中，依次加入47.5mL 100mM pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液，加入底 物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯lg，环己烷2.5mL，搅拌均匀后，加入单加氧酶 EW 1538(来自苏州汉酶生物技术有限公司）0.1g，NADP O.Olg，葡萄糖1.5g，葡萄糖脱氢酶 0. lg，30°C下震荡反应，24小时HPLC检测反应转化率为99%，过滤除酶后等体积乙酸乙酯萃 取3次，合并有机相，脱去溶剂得到产品1.05g，纯度95 %，ee值99 %。
[0043]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法，其以 5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子 再生系统的存在下，发生还原反应生成(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸 甲酯，其特征在于，所述的生物催化剂为单加氧酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡 萄糖脱氢酶，所述的还原反应在温度为20-30°C、pH为7.0-8.0的水相缓冲液中进行，在起始 反应体系中，所述底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的浓度为15-25 mg/mL， 所述的单加氧酶与底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为1:1-20。2. 根据权利要求1所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号 为EW1531、EW1535、EW1536或EW1538的单加氧酶中的一种或多种的组合。3. 根据权利要求2所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，所述的单加氧酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号 为EW1535的单加氧酶。4. 根据权利要求1所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，起始反应体系中，所述的匍萄糖:匍萄糖脱氢酶:5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的质量比为15:1:10。5. 根据权利要求1所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，所述的辅因子为NADP，其与5-氯-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧 酸甲酯的质量比为1:1-100。6. 根据权利要求1所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的 生物制备方法，其特征在于，所述反应在助溶剂条件下进行。7. 根据权利要求6所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，所述的助溶剂为环己烷、聚乙二醇400、聚乙二醇200、甘油、甲苯、 乙二醇、吐温-60中的一种或多种的组合。8. 根据权利要求1所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，所述的水相缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。9. 根据权利要求1所述的（S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的生 物制备方法，其特征在于，具体实施过程如下：在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶 液、底物5-氯-2,3-二氢-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，搅拌均匀后，再加入所述的单加氧酶、 辅因子、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶，在20_30°C温度条件下震荡反应，HPLC检测反应进程，当转 化率达90-99%时，过滤除酶后，加入等体积乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相，脱去溶剂 后得到(S) _5_氯-2，3-二氢_2_羟基-1 -氧代-1H-讳_2_駿酸甲酯广品。
【文档编号】C12P7/64GK105969815SQ201610398199
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】陶军华, 付敏杰, 杨锴
【申请人】苏州汉酶生物技术有限公司