一种弓形虫荧光定量pcr特异性引物、试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种弓形虫荧光定量PCR特异性引物、试剂盒及其检测方法,本发明含有弓形虫荧光定量PCR特异性引物、DNA提取液、荧光定量PCR反应液、质控反应液、Spin Columns CB3、Collection Tubes 2ml，本发明应用GRA7基因作为遗传标记，以特异性引物优化试剂浓度、温度等PCR反应体系条件，能够快速、特异、灵敏检测动物感染弓形虫病，操作简捷，能应用多种动物弓形虫病的诊断。
【专利说明】
一种弓形虫荧光定量PCR特异性引物、试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学诊断技术领域，尤其涉及荧光定量PCR特异性引物及其应 用检测技术。
【背景技术】
[0002] 刚性弓形虫简称弓形虫，是专性细胞内寄生虫。弓形虫的生活史包括5种形态，即 滋养体(又称速殖子）、包囊(可长期存活于组织内，破裂后可释出缓殖子）、裂殖体、配子体 和囊合子，前3期为无性生殖，后2期为有性生殖。弓形虫生活史的完成需中间宿主和终宿 主，弓形虫寄生在中间宿主内进行无性生殖，只有在终宿主内才能进行有性生殖。
[0003] 猫和其他猫科动物是弓形虫的终末宿主，弓形虫有性生殖仅在终宿主肠粘膜上皮 细胞内发育，发生局部感染;而中间宿主(包括人、其他哺乳类动物，禽类)吞入囊合子会发 生感染，囊合子内含子孢子，能穿过小肠肠壁，随血液或淋巴流动散播全身各个组织，在细 胞内以纵二分裂法进行增值，宿主细胞破裂后，滋养体会侵犯其他细胞，对中间宿主造成危 害。流行病学调查结果显示，全球人类感染弓形虫的概率有25-50%。一般免疫功能正常的 人不会出现明显的临床症状。多种畜禽如猪、牛、猫、犬、羊、马、骆驼、家兔、鸡、鸭等均可感 染弓形虫，其中以猪的感染率较高，病死率可达60%以上，这对畜牧业造成重大的经济损 失。
[0004] 当前弓形虫病的诊断方法有病原学检查、免疫学检查及分子生物学方法。病原学 培养和动物接种虽是弓形虫检测的金标准，但漏诊率高，操作繁琐，耗时长，成本高，通常只 用于基础研究。传统的血清学方法由于简便，快速，敏感性尚佳，仍然是各实验室的常用方 法，但血清学只是感染的间接标志，当机体免疫力低下时，则很难获得可供诊断的血清学结 果。
[0005] 自 1985年MyLls等创立聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术， 如今已发展出多种相关技术应用于寄生虫遗传变异和种类鉴定的分子生物学方法研究，包 括特异PCR、DNA序列分析、多重PCR、扩增片段长度多态性(AFLP)、聚合酶链式反应连接的限 制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAH))、单链构象多态性(SSCR)以及 荧光定量PCR等，为分子寄生虫学和分子遗传学的发展提供了有利的工具。
[0006] 荧光定量PCR原理是以荧光共振能量转移为基础，在反应体系中加入荧光探针或 荧光染料，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的反应过程。荧光染料结合在DNA双链的 小沟中，当DNA扩增时，焚光染料可与dsDNA结合，发出荧光信号，随着dsDNA渐增，荧光信号 逐渐增强，当信号达到阈值时，荧光信号即可被荧光定量PCR仪器检测到。每个模板的Ct值 与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。通过对不同稀释倍数的标准样品做荧光定量 PCR，即可做出标准曲线。利用标准曲线可以对未知样品进行定性和定量检测。常用的荧光 染料有Pico Green和SYBR Green，荧光染料法相对于荧光探针优势在于检测方法简单，检 测成本低。实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相 比，具有灵敏度高，特异性强，自动化程度高等优点，并且能有效解决PCR污染问题。
[0007] 对比文件1:中国发明专利申请公开号为"CN101613751A"，名为《快速检测弓形虫 的荧光定量PCR试剂盒》的文件中针对弓形虫B1基因的检测，记载了如下技术特征：
[0008] 快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒包括：
[0009] 1)DNA提取液裂解缓冲液，其组分:0.1MTris-HCl(pH8.0)，0.1 ~0.15M NaCl，0.1 ~0.15M EDTA(pH8.0)，l%~4%SDS;
[001 0] 20mg/ml蛋白酶K贮存液，加入裂解缓冲液的终浓度为4yg/yL;
[0011] 2)荧光定量PCR反应液（包括SYBR-Rreen I，弓形虫B1基因特异性引物、MgC12、 dNTPs、无菌双蒸水）；
[0012] 3)标准阳性模板pMD-Bl，含有弓形虫B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD- 18重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌DH5a增殖后；
[0013] 4)弓形虫B1基因特异性引物；
[0014] 5)阴性质控标准品，即无菌双蒸水。
[0015]第一，对比文件1中以B1基因为检测的靶基因，理论上检测的灵敏度与实际检测下 限出入较大。正常情况下，临床样品感染了 0.5个速殖子，加上DNA提取效率不可能达到 100%及一些操作上的误差，实际上是难以检测得到的；
[0016] 第二，对比文件1中检测的时间为2小时，检测效率并未达到最高水平，究其原因可 知:对比文件1中扩增的目的片段为223bp，而理想的qPCR的目的片段长度为200bp以下，所 以扩增效率不够高;另外，该技术方案的反应采用3步法，检测时间较长；
[0017] 第三，对比文件1在加样时，反应液是分开加的（SYBR-Rreen I，MgC12、dNTPs，Taq 酶及Buffer)，操作不够简便。
[0018] 为了克服B1基因的检测技术的不足，另开发一种新检测技术是医学发展的必然需 求。
[0019] 研究表明：弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)虽只占弓形虫蛋白总量的0.5%，但在弓 形虫生活史的每个阶段均有表达(参考文献1)，可见GRA7对于弓形虫的作用非同小可。GRA7 基因序列具有高度保守性，但目前在分子生物学层面上对该基因序列检测研究甚少。
[0020] 参考文献[1]洪彩玲.弓形虫GRA7分泌蛋白与宿主组分的相互作用研究[D].首都 医科大学，2014.
【发明内容】
[0021] 本发明的目的在于为克服现有技术中检测灵敏度不足、检测效率不高等存在的问 题，提供1对能用于检测弓形虫的特异性引物。
[0022] 本发明的另一个目的是提供利用上述引物制成的试剂盒。
[0023] 本发明的进一步目的是提供利用上述试剂盒以SYBR Green荧光染料法进行弓形 虫病荧光定量PCR检测的方法。
[0024] 为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
[0025] 本研究对来自于不同宿主，不同地理位置的弓形虫分离株的致密颗粒蛋白7 (GRA7)基因进行序列比对分析，发现GRA7种内保守性很高，可用作诊断检测的靶基因。本申 请发明人根据弓形虫的GRA7的特异序列设计1对特异引物如下：
[0026] qPCR-F:5，-ACGACAACATCTACGAGGAG-3，；
[0027] qPCR-R:5，-GCACCCATACCAACAGC-3，。
[0028] 本发明基于上述引物组成用于检测猪弓形虫的试剂盒，含有：
[0029] (l)DNA 提取液：Buffer GA、Buffer GB、Buffer GD、Buffer PW、Buffer TE、 Proteinase K、无水乙醇。
[0030] (2)荧光定量PCR反应液:SYBR Green I、引物、双蒸水。
[0031 ] (3)质控反应液：阴性对照反应液:灭菌双蒸水、阳性对照反应液:含有弓形虫GRA7 基因的pMD-18质粒。
[0032] 在上述试剂盒中，还包括Spin Columns CB3、Collection Tubes 2ml〇
[0033] 在上述试剂盒中，各物质的优选量为：
[0034] (l)DNA 提取液：为反应 200 次的 50mL 的 Buffer GA、50mL 的 Buffer GB、52mL 的 Buffer GD、50mL的Buffer PW、60mL的Buffer TE、4mL的Proteinase K、10mL的无水乙醇；
[0035] (2)荧光定量PCR反应液:为反应200次的SYBR Green I试剂、终浓度为lOpmol/yL 的弓形虫特异性引物、双蒸水；
[0036] (3)质控反应液:为反应200次的阴性对照反应液和阳性对照反应液。
[0037]本发明同时提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0038] 1:DNA的提取（参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒，按说明书提取弓形虫全基 因组DNA):
[0039] (1)取200yL生理盐水或ros研磨好的待检动物的组织匀浆，11200xg离心lmin，弃 上清，加 200yL缓冲液GA，震荡至彻底混匀；
[0040] (2)加入20yL蛋白酶K，于漩涡振荡器上混匀，瞬时离心后放置到56°C的水浴锅中 作用lh;
[0041 ] (3)瞬时离心后加入200yL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70 °C放置10min，溶液应变清 亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
[0042] (4)加入200yL无水乙醇，充分震荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去 除管盖内壁的水珠；
[0043] (5)将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CB3中13400x g离心lmin，倒掉废液，将 吸附柱CB3放回收集管中；
[0044] (6)向吸附柱中加入500μ1缓冲液⑶(使用前先检查是否已加入无水乙醇），13400x g离心lmin，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
[0045] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇）， 13400x g离心lmin，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0046] (8)重复操作步骤(7);
[0047] (9)将吸附柱CB3放回收集管中，13400x g离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温 放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
[0048] (10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100yL 洗脱缓冲液TE，室温放置5min，13400x g离心2min，将溶液收集到离心管中；为增加基因组 DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，13400x g离心2min;离心 管中的液体即为提取的基因组DNA，-20°C保存待检。
[0049] 2:荧光定量PCR扩增:反应体系为：SYBR Green I 10yL，上下游引物各0.4yL，双蒸 水7.2yL，模板DNA 2yL。按照待检的扩增样品数n(n = n+l)取PCR反应液混匀，然后分别吸取 18yL至各个反应管中，将保存待检DNA加入对应反应管中，同时分别吸取2yL的阴性对照反 应液和阳性对照反应液于2个反应管中，标记后混匀离心，置于荧光定量PCR仪上，设置扩增 为:95 °C预变性3min; 95 °C变性5s，60.5 °C退火延伸30s，共40个循环;熔解参数为:熔解温度 范围为60 °C到95 °C，每步升温1°C，然后启动反应。
[0050] 3:荧光定量PCR结果分析:从终端电脑上读取荧光定量PCR扩增结果及熔解结果。
[0051] 本发明的有益效果是：
[0052] (1)本发明对来自于不同宿主，不同地理位置的弓形虫分离株的致密颗粒蛋白7 (GRA7)基因进行序列比对分析，发现GRA7种内保守性很高，可用作诊断检测的靶基因。本申 请发明人根据弓形虫的GRA7的特异序列设计1对特异引物，建立了用于检测猪弓形虫病的 荧光定量PCR方法。
[0053] (2)本发明通过优化反应体系和反应条件，研制出一种基于荧光染料法的检测猪 弓形虫病荧光定量PCR试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定 客观。该方法可实现对猪弓形虫病的流行病学调查、隐性感染的检测和临床诊断，为动物弓 形虫病的诊断和防治技术等进一步研究奠定了基础。
【附图说明】
[0054]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不 构成对本发明的不当限定，在附图中：
[0055]图1弓形虫荧光定量PCR特异性扩增图；
[0056]图1中卜6分别代表RH株弓形虫，PRU株弓形虫，VEG株弓形虫，新孢子虫，猪等孢球 虫和猪附红细胞体的特异性扩增曲线图；
[0057]图2弓形虫荧光定量PCR特异性熔解图；
[0058]图2中卜6分别代表RH株弓形虫，PRU株弓形虫，VEG株弓形虫，新孢子虫，猪等孢球 虫和猪附红细胞体的特异性熔解曲线图；
[0059]图3弓形虫阳性质粒标准品荧光定量PCR扩增曲线；
[0060]图 3中，1-5 分别代表阳性质粒 PMD18-GRA7 浓度为107、106、105、104、10 3copies/uUt 的扩增曲线图；
[0061 ]图4弓形虫阳性质粒标准品焚光定量PCR标准曲线；
[0062] 图5弓形虫荧光定量PCR敏感性实验结果；
[0063] 图 5中，1-6 分别代表阳性质粒 PMD18-GRA7 浓度为lO^lO'lO^lO^lO^lOlopies/ ul时的扩增曲线图；
[0064] 图6弓形虫荧光定量PCR重复性实验结果；
[0065] 图6中，1-4分别代表阳性质粒PMD18-GRA7浓度为107、106、105、10 4copies/ul时分 别做的三个重复扩增曲线图；
[0066]图7到图12 50份猪血液临床样品的检测结果；
[0067] 图7到图12中，PC代表阳性对照，NTC代表阴性对照。
【具体实施方式】
[0068]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施 例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
[0069]实施例1试剂盒的组成
[0070] 试剂盒内含：
[0071] 1)DNA提取液，其中含有反应200次的50mL的Buffer GA、50mL的Buffer GB、52mL的 Buffer GD、50mL的Buffer PW、60mL的Buffer TE、4mL的Proteinase K、10mL的无水乙醇；
[0072] 2)荧光定量PCR反应液为反应200次的SYBR Green I试剂、终浓度为lOpmol/yL的 弓形虫特异性引物、灭菌双蒸水、MgCl 2、dNTPs，Taq酶。
[0073] 3)质控反应液为反应200次的阴性对照反应液和阳性对照反应液。
[0074]实施例2试剂盒特异性试验
[0075] 分别以RH株DNA，PRU株DNA，VEG株DNA，猪等孢球虫DNA，附红体DNA，新孢子虫DNA为 模板，按照试剂盒的反应条件进行特异荧光定量PCR扩增，同时设空白对照。
[0076] 反应体系为：SYBR Green I 10yL，上下游引物各0.4yL，双蒸水7.2yL，模板DNA 2μ L〇
[0077]荧光定量PCR扩增条件为：
[0079]结果表明：不同虫株的弓形虫DNA均出现了特异性扩增，阴性对照及其它DNA均无 扩增(图1)。
[0080] 实施例3试剂盒的标准曲线及敏感性分析
[0081] 分别以101()~10*3拷贝/VL的质粒标准品为模板进行实时荧光定量PCR扩增，选择连 续5个点制作标准曲线（图2)和标准方程(表1)并分析其敏感性，结果显示荧光定量PCR在模 板浓度为1 〇拷贝以下时未见有扩增，可得出荧光定量PCR的灵敏度为10个拷贝的靶DNA。 [0082] 表1弓形虫荧光定量PCR标准方程
[0083]
[0084] 注:X = lg(初始模板浓度），CT值为荧光信号达到设定阈值时的循环数。
[0085]本研究为了更加真实反映理论上的检测下限与实际检测下限的差距，做了以下技 术上的改进:取纯化后的弓形虫RH株速殖子腹腔液，通过镜检稀释成1000，100，50，25，20， 15，10及1个速殖子的8份虫液，分别混于8份磨碎的猪肉样品中，然后再分别提取其DNA。 [0086]通过实验发现10个及1个速殖子的混合样品检测不到，其它6份均可检测到，与理 论计算值有一定的差异，理论值的10个拷贝大体上相当于实际的15个拷贝，结果贴近实际， 可信度高。
[0087]实施例4试剂盒的稳定性试验
[0088]分别以107，106，105，104(： 〇?以8/111的四个浓度梯度的阳性标准品为模板进行 qPCR，每个梯度重复3次，计算每次的CT值，求得变异系数，评价其稳定性。
[0089] 结果显示其变异系数CV为0.9%~2.7%，均小于3% (表2)。说明该方法具有良好 的稳定性。
[0090] 表2弓形虫荧光定量PCR稳定性试验结果
[0091]
[0092] 实施例5试剂盒对临床样品的检测
[0093]分别对广东惠州、江门和肇庆三个规模化猪场共50份样品进行检测。从血液中直 接提取DNA，利用本试剂盒进行荧光定量PCR检测，结果显示本试剂盒操作简便，结果客观准 确，可用于临床诊断及流行病学调查。
[0094]表3 50份猪血液临床检测结果
[0096] 注表示弓形虫核酸阳性；表示弓形虫核酸阴性。
[0097] 综上可知，本发明的优点主要有以下几点：
[0098] 1、本申请的检测灵敏，理论计算值贴近实际，可信度高；
[0099] 2、本申请扩增的目的片段为112bp，符合理想的qPCR目的片段200bp的长度要求， 且本申请将退火和延伸并为一步，米用2步法，大大缩短检测时间，提尚效率；
[0100] 3、本申请优化反应液的各组分浓度比例，将其混合在一起为mix，操作更简便。
[0101] 因本研究选取弓形虫高度保守的基因 GRA7的绝对保守片段作为检测的靶标，本领 域技术人员能够通过上述以猪为检测对象应用的本检测技术，直接推论出本申请的检测技 术同样能够应用于其他中间宿主，而不仅限于检测猪弓形虫。
[0102] 以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例 对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本 发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方 式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1. 一种弓形虫巧光定量PCR特异性引物，其特征在于： 包括W下序列： 上游引物 qPCR-F: 5 ' -ACGACAACATCTACGAGGAG-3 '， 下游引物 qPCR-R: 5 ' -GCACCCATACCAACAGC-3 '。2. -种弓形虫巧光定量PCR特异性检测试剂盒，其特征在于： 包括弓形虫巧光定量PCR特异性引物。3. 根据权利要求2所述的一种弓形虫巧光定量PCR特异性检测试剂盒，其特征在于： 所述弓形虫巧光定量PCR特异性引物的终浓度为lOpmol/化。4. 根据权利要求2所述的一种弓形虫巧光定量PCR特异性检测试剂盒，其特征在于： 还包括（1 )DNA提取液； (2) 巧光定量PCR反应液； (3) 质控反应液； (4) Spin Columns CB3； (5) Collection Tubes 2ml。5. 根据权利要求4所述的一种弓形虫巧光定量PCR特异性检测试剂盒，其特征在于： (1 )DNA提取液:为反应200次的 Buffer GA 50 mL; Buffer GB 50 inL; Buffer GD 52 mL; Buffei'PW 50 mL ; Buffer TE 60 mL; Proteinase K 4 mL; 无永乙醇 Kh'nL·; (2) 巧光定量PCR反应液:为反应200次的SYBR Green I试剂、双蒸水； (3) 质控反应液:为反应200次的阴性对照反应液和阳性对照反应液。6. 根据权利要求5所述的一种弓形虫巧光定量PCR特异性检测试剂盒，其特征在于： 所述阴性对照反应液为灭菌双蒸水； 所述阳性对照反应液为含有弓形虫GRA7基因的pMD-18质粒。7. -种弓形虫巧光定量PCR特异性检测方法，其特征在于： (1) 提取待检动物DNA; (2) 巧光定量PCR扩增，进行烙解曲线分析，设置的扩增及溶解参数如下： 护增：硕变性 3 min; 变性 ％ C 5 s ; 退火延伸 60.5"C 30 s; 40个循踩； 烙解:60 °C~95 °C，每步升溫rC。8.根据权利要求7所述一种弓形虫巧光定量PCR特异性检测方法，其特征在于： 巧光定量PCR扩增体系包括如下： SYB民 GreenI l(),uL; 上下游引物 各0.4 灭菌双蒸木 7.2軒巳； 模板 DNA 2 μL^。
【文档编号】C12Q1/68GK105969855SQ201610318797
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】廖昕萌, 袁子国, 谢国清
【申请人】广州海沥生物科技有限公司