检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒及检测方法

检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒及检测方法。检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒包括扩增Mx基因的引物、DNA聚合酶及其缓冲溶液，特异位点为S631N位点。本发明在家鸡抗病育种方面，首次复合采用特异引物、二次PCR SSCP筛选家鸡S631N位点，实现了该技术对家鸡抗病品种抗禽流感品种的筛选检测，经济、准确、灵敏的获得检测结果，实现了低成本的高效精确检测。
【专利说明】
检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测鸡抗禽流感基因特异位点的试 剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 禽流感是由动物病毒引起的动物传染病，同时严重威胁人类健康。家鸡是禽流感 的自然宿主，一旦发病，对养殖户造成重大损失，同时也会使人类染病，引发社会恐慌。1997 年在香港发现人类感染病例，引起了世界范围的高度关注。2013年，我国上海、安徽发现3例 人感染H7N9禽流感病例，其中两人抢救无效。因此要从源头切断这种病毒的扩散，需从禽流 感自然宿主家鸡等鸟类着手。家鸡体内有一种免疫相关蛋白Mx蛋白，Mx蛋白就是在IFN诱导 下产生的蛋白质，研究发现，Mx蛋白在真核生物中普遍存在并行使重要的功能。1962年， Lindenmann首次发现小鼠 A2G16号染色体上有一个显性基因能抵抗正黏液毒科的病毒(流 感病毒），并将该基因命名为myxovirusresistant，即Mx基因。后来进一步发现人类细胞质 中的MxA蛋白可以抑制流感病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒(measles Virus)和 111〇8〇1:〇￥;[1'118。2002年和2004年，如6-!101^1(0等人对鸡的1^蛋白结构及功能进行研究，选 用了 25个品种/系的鸡诱导Mx蛋白表达，证实鸡Mx蛋白基因呈多态性。对这些分品种/系的 氨基酸序列进行比对发现第631位氨基酸起关键作用，凡是631氨基酸位为Asn的品种/系均 抗禽流感、新城疫等活性明显增强，而631位是Ser的抗病性明显降低。2006年，Seyama. T等 发现来自老挝的红色原鸡和印度尼西亚的红色原鸡、灰色原鸡和绿色原鸡Mx基因均为敏感 性的，随后的很多研究发现培育品种Mx基因多为抗性的。因此筛选具有抗性基因的品种，通 过育种培育携带具有Mx蛋白S631N抗性位点N的品种可以为家鸡抗病育种提供很好的平台， 在技术上需要进行SNP检测。筛选SNP的方法目前有很多，诸如全基因组测序、基因测序技 术，毛细管电泳技术，变性高效液相色谱检测，基因芯片技术(根据荧光强弱或荧光的种类 测出被检测序列的碱基类别），三色荧光技术检测SNP等，但是需要的仪器设备要求较高，操 作繁琐，花费巨大，没有上百万的研究经费很难进行相关研究。利用错配碱基产生酶切位点 快速检测禽类Mx蛋白基因单核苷酸改变，尹春光等，利用RFLP方法进行S631N相关位点研 究，使用限制性核酸内切酶，通过琼脂糖凝胶电泳分析，但是进行高通量检测时分辨率较 低。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是提供一种检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒，该试剂盒能够 高效检测抗禽流感相关位点；本发明同时提供了应用该试剂盒的检测方法，使用二次 PCRSSCP方法，最大限度减少DNA损伤。
[0004] 本发明所述的检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒包括扩增Mx基因的引物、 DNA聚合酶及其缓冲溶液，特异位点为S631N位点。
[0005] 用于Mx基因检测的引物为：
[0006] F:5 '-GCAACTCCCATACGTGTTTT-3 '，
[0007] R:5，-CAGTAGAGAGGTAGATCAGA-3，。
[0008] 本发明采用上述试剂盒应用于检测鸡抗禽流感基因特异位点的检测方法是通过 两次PCR及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Mx基因特异位点。
[0009] 所述的两次PCR是第一次PCR使用引物F和引物R，第二次PCR使用引物F或引物R。
[0010] 所述的试剂盒具体包括:一次PCR组分和二次PCR组分，2次组分除引物使用浓度不 同及DNA不同外，其余均相同。
[0011] 一次PCR组分:特异扩增引物一对(F，R) ;PCR缓冲液;MgCl2、dNTPs的混合物，Taq 酶；
[0012] 使用所述试剂盒进行一次PCR复合扩增反应的条件： DNA 2.0L Primer F (20pniol/L) 0,5L Primer R (20 pmol/L) 0.5L
[0013] lOmM dNTP Mix 2.0L PCR反应缓冲液 2.5L ddH20 17.2L Taq DNA Polymerase 0.3L
[0014] 二次PCR组分:特异扩增引物一条(F或R)PCR缓冲液;MgCl2、dNTPs的混合物，Taq 酶；
[0015] 使用所述试剂盒进行二次PCR复合扩增反应的条件： 一次PCR产物 2.0L Primer F 或 Primer R (40pm〇l/lj 0.5L
[0016] lOmM dNTP Mix 2.0L PCR反应缓冲液 2.5L ddH20 17.2L
[0017] Taq DNA Polymerase 0.3L
[0018] 所述的试剂盒进行PCR扩增反应的引物:？:5'-60六40^0^了406了61'1'1'1'-3'，1? :5'-CAGTAGAGAGGTAGATCAGA-3 '；PB:FB5 '-ACTGTCACCTTCTAATA-3 '，
[0019] 所述试剂盒进行PCR反应程序：95°C预变性3min后94°C变性30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸60sec三个阶段循环30次后，72°C5min，4°C5min。该程序可使用任何品牌任 何型号PCR仪进行扩增。
[0020]其中所检测的家鸡基因组DNA为:使用酚/氯仿抽提法或高盐法对来源样本进行处 理得到的DNA;所述的来源样本为:来源于家禽的肌肉组织、内脏组织样或血样。其中建议使 用微量采血法提取DNA，翅下静脉采血，仅需25ul微量血液即可，具体方法见Jon Η，Wetton， Royston E，et al.Nature,1987。
[0021 ]二次PCR产物检测使用改进后的SSCP法检测，与传统PCR SSCP变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳方法不同的是使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，由于PCR产物为单链，缓冲液中无需 添加去离子甲酰胺，上样前无需经高温变性，程序简化可以最大限度保护DNA，其余步骤同 常规程序，即制胶、预电泳、电泳、固定、氧化、染色。
[0022] 本发明通过生物信息学分析，专门针对不同家鸡品种进行了 S631N位点检测特异 引物筛选及PCR反应程序优化PCR，为了更清晰呈现检测结果，通过二次PCR SSCP的方法，使 用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，提高了分别率，省略DNA高温及药物变性过程，最大限 度减少DNA损伤，准确呈现检测抗性位点（S631N)结果，为品种的筛选及育种提供了方便、快 捷、经济、准确的方法。
[0023] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0024] 本发明提供的试剂盒是针对禽流感抗性位点的PCR检测试剂盒，该试剂盒通过使 用筛选的特异引物，二次PCR反应，借助SSCP方法呈现特异位点SNP特征，鉴别该品种是否具 备禽流感抗性。本发明以Mx基因为检测对象，通过二次PCR扩增，获得单链DNA，直接通过非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可进行基因 SNP鉴定，筛选出具有特定基因型的个体，为抗病 育种品种选择提供参考。在家鸡抗病育种方面，首次复合采用特异引物、二次PCR SSCP筛选 家鸡S631N位点，实现了该技术对家鸡抗病品种抗禽流感品种的筛选检测，经济、准确、灵敏 的获得检测结果，实现了低成本的高效精确检测。
【附图说明】
[0025] 图1是本发明试剂盒特异引物扩增一次PCR后电泳结果。
[0026] 图2是本发明试剂盒二次PCR后电泳结果，其中，左图是F为引物时的电泳结果，右 图是R为引物时的电泳结果。
[0027] 图3是本发明进行SSCP聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
[0028] 图4是本发明试剂盒进行SSCP反应后的测序结果。
【具体实施方式】
[0029] 以下结合实施例对本发明做进一步描述。
[0030] 所用的试剂及材料均为市售产品。
[0031] 实施例1
[0032] 1.鸡血液DNA提取和检测采用微量翅下采血DNA提取法。
[0033] 1.1.翅下采血25ul，加入475ul STE buffer含Tris 0.05M，NaCl 0.15M，EDTA ImM pH8 · 0;加入7 · 5ul (25 % ) SDS，15ul蛋白酶K( lOmg/ml)，55°C 消化过夜；
[0034] 1.2.酚，酚:氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，氯仿：异戊醇(体积比24:1)抽提各一 次;加入0.1倍体积NaAc(3M)，2倍体积冰乙醇，轻轻颠倒混匀，11600g离心3至5min;收集DNA 沉淀。
[0035] 1.3.75%酒精洗2次，干燥，加入 150ul含 10mM Tris，lmM EDTA TE。
[0036] 2.0嫩克隆及测序克隆载体转化菌为1'〇?10、0耶(购自1'丨&即611公司） ；常规克隆使 用TaKaRa公司pMD19-T。目的片断回收及连接转化及重组质粒的筛选使用常规方法。选取 PCR阳性菌测序鉴定。
[0037] 3 ·二次 PCR-SSCP 分析
[0038] 3.1.-次PCR:引物一对(F，R)，反应体系25ul:F，R(20pmol)0.5ul;dNTP(2.5mmol/ l)2ul;基因组 DNA(0.5ug/ul)lul ;Taqase(2U/ul)0.5ul; lOxbuffer 2.5ul，ddH2〇 18.5111)。？0?反应程序为：95°(：预变性31^11后94°(：变性3〇86(3,60°(：退火3〇86(3,72°(：延伸 60sec 三个阶段循环 30 次后，72 °C 5min，4°C 5min。
[0039] 3.2.二次?〇?:反应程序使用一次?〇?程序，8卩：95°(：预变性31^11后94°(：变性3086(3， 60°(：退火3〇86(3,72°(：延伸6〇86(3三个阶段循环30次后，721€5111丨11，41€5111丨11。引物为？ (40?111〇1)或1?(40?111〇1)，其余组分及用量不变(1阶？（2.5111111〇1/1)2111;基因组0嫩(0.51^/111) lul;Taqase(2U/ul)0.5ul;10xbuffer 2.5ul，ddH2〇 18.5ul〇
[0040] 3.3改进后的330?法检测
[0041] ①制胶及预电泳:将新鲜配置的聚丙烯酰胺（12%)倒入玻璃板内，插入梳子。胶凝 固后，拔掉梳子，蒸馏水冲洗点样孔，然后用吸水纸将孔内的水吸干净，倒入1XTBE电泳缓 冲液。预电泳 10min(300V，60mA);
[0042] ②电泳:取2uL PCR产物，点样，电泳20min(200V)后，4°C电泳过夜（150V小于5W); [0043]③固定及氧化:取出凝胶，蒸馏水冲洗，乙醇(20%)固定2次（15min/次）。蒸馏水漂 洗凝胶，加入硝酸（1 % )氧化3min，蒸馏水漂洗。
[0044]④染色：凝胶中加入硝酸银溶液(0.1%)，室温下置于摇床上染色20-30min，凝胶 用蒸馏水漂洗，然后加入碳酸钠溶液(2%，含甲醛)进行显色。待条带清晰，倒掉碳酸钠溶 液，加入乙酸(4 % )浸没胶面，终止显色。
[0045] ⑤判断分析:判断带型，用呈像系统照相留做分析统计。测序验证
[0046] 结论：
[0047] 本发明分型完整清晰，结果如图1-4所示：
[0048] 1.利用Primer 5.0设计的引物PCR结果带型清晰，由左向右依次为样品YJ(北京油 鸡）;WL(白来航）;WC(海南文昌鸡）；LH(汶上芦花鸡）；JN(济宁百日鸡）;Marker;检测样品单 一条带;无引物二聚体，无非特异性条带。
[0049] 2.二次PCR后，F为引物图：由左向右依次为样品YJ(北京油鸡）;WL(白来航）;WC(海 南文昌鸡）；LH(汶上芦花鸡）；JN(济宁百日鸡）;Marker;R为引物图：由左向右依次为样品YJ (北京油鸡）;WL(白来航）;WC(海南文昌鸡）；LH(汶上芦花鸡）；JN(济宁百日鸡，右侦阳个点样 孔）；检测样品单一条带;无引物二聚体，无非特异性条带。
[0050] 3.本发明进行SSCP聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，样品依次分型为AA、AB、AB、AA、AB 型。
【主权项】
1. 一种检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒，其特征在于包括扩增Mx基因的引物、 DNA聚合酶及其缓冲溶液，特异位点为S631N位点。2. 根据权利要求1所述的检测鸡抗禽流感基因特异位点的试剂盒，其特征在于 用于Mx基因检测的引物为： F:5 '-GCAACTCCCATACGTGTTTT-3 '， R:5，-CAGTAGAGAGGTAGATCAGA-3，。3. -种采用权利要求1或2所述试剂盒应用于检测鸡抗禽流感基因特异位点的检测方 法，其特征在于通过两次PCR及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Mx基因特异位点。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的两次PCR是第一次PCR使用引物F 和引物R，第二次PCR使用引物F或引物R。
【文档编号】C12Q1/68GK105969858SQ201610321907
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】尹春光, 王晓强, 赵强, 冯磊
【申请人】济宁学院