一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法
【专利摘要】本发明属于生物医学领域中核酸的检测方法，具体涉及一种基于MoS2传感器及其检测SNPs的方法。本发明的技术方案主要包括：1）制备MoS2；2）制备MoS2?AuNPs复合物；3）把SYBR Green I插入双链DNA后，物理吸附到MoS2或固定化到MoS2?AuNPs上；4）测量双链DNA前后的荧光变化，鉴定出SNPs。本发明充分利用MoS2和MoS2??AuNPs淬灭荧光的特性，采用SYBR Green I插入到双链DNA中，通过DNA淬灭前后荧光变化，实现无标记、高灵敏度、快速、低成本地检测SNPs。
【专利说明】
一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医学领域中核酸的检测方法，具体为基于二硫化钼(m〇s2)物理吸附和二硫化钼-纳米金(MoS2-AuNPs)复合材料传感器固定化的方法，来检测DNA的单核苷酸多态性(SNPs)。【背景技术】
[0002]单核苷酸多态性(SNPs)是核酸序列上单个碱基的差异性变化，这普遍是因为细胞分裂期间的复制错误。大多数的SNPs不会影响表型变异，我们能观察到的，仅仅是一小部分的SNP影响表观遗传的变异。但这一小部分的SNPs对于人类健康而言显得尤为重要。SNP 是最常见的基因突变，由于其与许多重大疾病密切相关，如癌症，在人类基因组学与基因测试学中发挥重要的作用。SNPs与个体药物反应息息相关，可被用来预测某些药物的潜在副作用。临床上，检测SNPs已经作为许多疾病检测与早期诊断的有效手段，如女性57? ^和 57?Cd 基因突变，其患乳腺癌与宫颈癌的风险大大增高。因此，准确地监控SNP对于疾病的预防、早期诊断及治疗是至关重要的。(Jiahao Huang, Zhenyu Wang, Jang-Kyo Kim, Xuefen Su, Zhigang Li, Detecting Arbitrary DNA Mutat1ns Using Graphene Oxide and Ethidium Bromide, Anal.Chem.2015, 87,12254-12261.)〇[〇〇〇3] M0S2制备简单，成本比较低，从而在生物检测中得到广泛的应用，而且M0S2在与DNA 相互作用时，单链DNA通过Jr —Jr效应，能吸附到M〇S2表面(Ge，J.，0u，E.C.，Yu，Q.R.， Chu, X.，2014.J.Mater.Chem.B 2，625-628 )。完全配对的DNA、含错配碱基的DNA与 SYBR Green I的结合能力不同，前者结合后的荧光强度明显高于后者。而且，M〇S2结合双链 DNA后，由于荧光共振能量转移(FRET)，结合于双链DNA上的SYBR Green I的荧光会被淬灭， 但由于错配碱基的存在，使错配与配对的双链DNA间有明显的差别。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的问题，本发明发现了物理吸附到MoS2表面的错配DNA会与MoS2 表面结合更紧密，导致其淬灭效率高于配对的DNA。同样，MoS2-AuNPs通过巯基(-SH)结合不同DNA后，由于荧光共振能量转移，插入到双链DNA上的SYBR Green I的荧光会被淬灭，共价结合到MoS2-AuNPs表面的错配DNA会更靠近M〇S2表面，导致其淬灭效率高于配对的DNA，该方法有效地提高了检测的准确性。
[0005]根据SYBR Green I染料插入的不同双链DNA会显示不同的荧光强度;在染料插入的DNA中加入M0S2，或在染料插入的巯基化DNA中加入MoS2_AuNPs后，不同双链DNA荧光会有不同程度的淬灭，根据荧光强度的变化，从而对SNP进行检测。
[0006]—种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，利用物理吸附方法，M〇S2传感器用于检测SNPs的方法，包括如下步骤:(1)用SYBR Green I染料插入配对及错配的双链DNA，并测量其荧光强度；(2)M〇S2表面物理吸附DNA，由于FRET，配对及错配的双链DNA荧光强度的淬灭程度不同，根据荧光强度变化不同，检测出SNPs。
[0007]其中，所述M〇S2是参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散。[〇〇〇8]一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，利用MoS2-AuNPs固定方法，MoS2一AuNPs传感器用于检测SNPs的方法，包括如下步骤:(1)用SYBR Green I染料插入配对及错配的带有巯基的双链DNA，并测量其荧光强度；(2)Tween80的修饰:加入10%的Tween80，Tween80通过自组装与M0S2-AuNPs表面相结合;能够缩短巯基标记的DNA与二硫化钼复合金纳米的连接时间，阻止DNA非特异吸附；(3)在步骤(1)所得产物中加入步骤(2)所得的产物，70°C水浴加热2.5 h，离心去上清液，加入溶解为初始总体积;M〇S2—AuNPs能够有效淬灭双链DNA中的SYBR GreenI的荧光， 测其荧光强度，对比前后荧光强度的变化，从而进行检测SNPs。
[0009]其中，步骤(3)中，所述带有巯基的双链DNA的浓度为10 nM;所述MoS2-AuNPs的浓度为20-70 yg/mL。
[0010]所述M0S2-AuNPs传感器是通过以下步骤制备的:(1)制备M〇S2:参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散；(2)制备AuNPs:采用经典Frens法制备金纳米颗粒，平均粒径15.7nm，浓度为1.2* 1018 M-3;(3)制备MoS2-AuNPs:将步骤(1)分散好的M〇S2溶液与步骤(2)制备好的金纳米，搅半均匀，加入乙二醇，在90°C反应5小时，10000r离心15min，然后将沉淀分散于超纯水中，避光保存。
[0011]本发明具有以下优点:(1)本发明中MoS2和MoS2—AuNPs易于获得，方法简单、成本低，充分利用MoS2和MoS2-AuNPs淬灭不同双链DNA(MoS2—AuNPs所结合DNA必须巯基标记)的荧光程度不同，而对DNA进行鉴定。
[0012](2)本发明采用非传统的荧光标记DNA的方法，用SYBR Green I能有效地结合到双链DNA的中，作为检测荧光信号的来源，是一种无标记的检测方法，具有高灵敏性。【附图说明】[〇〇13]图1:本发明的检测流程图；图2:是MoS2-AuNPs固定化检测流程图；图3:是SYBR Green I对双链DNA进行标记时的荧光强度图，其中DNA浓度为10nM，加入 SYBR Green I染料(5.0 X)，染料最终为0.5 X;图4:基于MoS2传感器对SNPs检测图，图中DNA浓度是10nM;图5:基于MoS2传感器对SNPs分析鉴定图。【具体实施方式】
[0014]以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
[0015]实施例1:(1)制备Mo S2纳米材料:氩气氛围下，将3 g天然M〇S2晶体浸泡入装有3mL 1.6M正丁基锂烧瓶中2天进行锂插入。然后，用正己烷过滤以及冲洗产生的Li x MoS2除去杂质。Li x MoS2在超纯水中通过超声lh，悬浮液通过离心以及用水冲洗后，用混合纤维素酯膜过滤后，获得沉淀物于氩气保护的手套箱内300 °C变性1小时，获得的M〇S2溶于水，超声2h，制得Mo&溶液备用。
[0016](2)合成特异的DNA序列:T: A GCA TCT TAT CCG GGTP: ACC CGG ATA AGA TGC T Ml: ACC GGG ATA AGA TGC T M2:ACTGGG ATA AGA TGC T M3:ACTGGG ATA AGA TCC T 该序列在生工生物工程(上海)股份有限公司合成；(3)基于MoS2传感器对SNP进行检测:取等量10處的？1]\^21^31^2分别与等量的10虚的1'置于95°(:下5分钟，室温下冷却两小时以上，再加入PBS (1.0 X，PH=7.4 )将双链DNA稀释到1福。分别取5 34y L PBS与6yL的 ?謂1'、？210'、？310'、？21'、1'混合于避光的￡?管中，之后分别加入5￥81?6代611160仙(5.0父)， 混匀，总体积600yL。10分钟后测量其荧光强度。[〇〇17]如图3所示，加入SYBR GreenI染料后，配对DNA的荧光强度明显高于错配DNA。[〇〇18]向不同的DNA中加入等量的MoS2(终浓度2.5ug/mL)，混匀，20分钟后再次测量其荧光强度，如图4,淬灭后的配对DNA荧光强度仍然高于其他DNA荧光强度。[〇〇19]图5是配对DNA与错配DNA淬灭前后的荧光强度对比，可以看出DNA间荧光强度差距在增大，由此可以鉴定出SNPs。
[0020]其中图1为本案例的检测流程图。错配DNA与配对DNA相比，与染料结合能力弱，但与MoS2结合能力较强。MoS2对错配DNA中SYBR Green I具有较强的淬灭效应，通过加入MoS2 前后的荧光强度变化来分析鉴定出SNPs。
[0021]实施例2:步骤(1)和(2)同实施例1中。[〇〇22](3):取等量10虚的？謂、？21^31^2分别与等量的10處的!'置于95°(:下5分钟，室温下冷却两小时以上，再加入PBS( 1.0 X，PH=7.4)将双链DNA稀释到lyM。分别取534yL PBS与6 yl的？謂1'、？210'、？310'、？21'、1'混合于避光的￡?管中，之后分别加入5￥81?6代611160此(5.0 X)，混匀，总体积600此。10分钟后测量其荧光强度。加入MoS2—AuNPs溶液，同时加入10yL 10% Tween80,70°C水浴加热2.5 h。离心去上清液，加入PBS到600此。再次检测DNA的荧光强度。 [〇〇23]其中图2为本案例的检测流程图。MoS2-AuNPs通过-SH固定化DNA，错配DNA与染料结合能力弱，但更靠近MoS2-AuNPs表面，从而通过荧光强度的变化检测出SNPs。
【主权项】
1.一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，MoS2传感器用于检测SNPs 的方法，包括如下步骤:(1)用SYBR Green I染料插入配对及错配的双链DNA，并测量其荧光强度；(2)M〇S2表面物理吸附DNA，由于FRET，配对及错配的双链DNA荧光强度的淬灭程度不同， 根据荧光强度变化不同，检测出SNPs。2.根据权利要求1所述的一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，所 述M〇S2是参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散。3.—种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，MoS2-AuNPs传感器用于检 测SNPs的方法，包括如下步骤:(1)用SYBR Green I染料插入配对及错配的带有巯基的双链DNA，并测量其荧光强度；(2)1￥661180的修饰:加入10%的1￥661180，1￥661180通过自组装与]\1〇32-411即8表面相结合；(3)在步骤(1)所得产物中加入步骤(2)所得的产物，70°C水浴加热2.5 h，离心去上清 液，加入溶解为初始总体积;M〇S2—AuNPs能够有效淬灭双链DNA中的SYBR GreenI的荧光， 测其荧光强度，对比前后荧光强度的变化，从而进行检测SNPs。4.根据权利要求3所述的一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，步 骤(3)中，所述带有巯基的双链DNA的浓度为10 nM;MoS2—AuNPs的浓度为20-70 yg/mL。5.根据权利要求3所述一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，所述 M0S2-AuNPs传感器是通过以下步骤制备的:(1)制备Mo&:参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散；(2)制备AuNPs:采用经典Frens法制备金纳米颗粒，平均粒径15.7nm，浓度为1.2* 1018 M-3;(3)制备MoS2-AuNPs:将步骤(1)分散好的M〇S2溶液与步骤(2)制备好的金纳米，搅半均 匀，加入乙二醇，在90°C反应5小时，10000r离心15min，然后将沉淀分散于超纯水中，避光保存。
【文档编号】C12Q1/68GK105969865SQ201610335958
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】高力, 邓泽斌, 夏妮, 张春霞, 周阳, 陈克平, 时海霞, 李琴, 李娆琪, 严丽荣
【申请人】江苏大学