一种特异性检测朝鲜孢囊线虫的引物及特异性分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异性检测朝鲜孢囊线虫的引物及特异性分子检测方法，该引物包括特异性引物和内标引物，所述特异性引物的上下游碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该特异性分子检测方法包括：以线虫DNA为模板，通过权利要求1或2所述引物进行PCR扩增，获得扩增产物；若扩增产物中包含449bp的片段，则判定为朝鲜孢囊线虫。本发明采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物，并结合内标引物，进行线虫DNA的PCR扩增，通过判定扩增产物中是否包含449bp的片段，实现了朝鲜孢囊线虫的检测，具有特异性高、灵敏度强、检测时间短等优点，降低了对标本的误判，具有很高的实际应用价值。
【专利说明】
一种特异性检测朝鲜孢囊线虫的引物及特异性分子检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物线虫分子检测技术领域，尤其涉及一种特异性检测朝鲜孢囊线虫 的引物及特异性分子检测方法。
【背景技术】
[0002] 孢囊线虫是危害植物根部的一类重要线虫，会引起许多重要作物的产量损失。其 中，最具有经济重要性的孢囊线虫种类隶属于孢囊线虫属(Heterodera)和球孢囊线虫属 (Globodera)〇
[0003] 朝鲜孢囊线虫于1992年由Vovals等在朝鲜半岛南部的毛竹上首次报道发现，当时 该线虫在分类地位上隶属于无膜孔孢囊线虫属(Afenestrata)，并命名为朝鲜无膜孔孢囊 线虫（A.koreana) (Vovlas，N.，Lamberti，F，Choo H. Y.Description of Afenestrata koreana n·sp·(Nematoda:Heteroderinae)，a Parasite , of Bamboo in Korea[J] ? Journal of Nematology，1992 · 553-559)。1997年Inserra等于美国佛罗里达州的苗圃中 的人面竹根围土中发现该种线虫（R·N. Inserra，N. Vovlas，P · S · Lehman ·Parasitism of fishpole bamboo roots by Afenestrata koreana.[J].NEMATR0PICA·1999)。2008年 Mundo-Ocampo等确认了孢囊线虫属和无膜孔孢囊线虫属是同属异名，故该线虫被更名为朝 鲜抱囊线虫（H. koreana) (Mundo-Ocampo Manuel ,Troccoli Alberto , Subbotin Sergei A.et al. Synonymy of Afenestrata with Heterodera supported by phylogenetics withmolecular and morphological characterisation of H.koreana comb.n.and H.oriental is comb.n.(Tylenchida:Heteroderidae)[J].Nematology,2008,10(5):611-632)。在泰国该线虫亦有报道;2012年王宏洪等(王宏洪，卓侃，张洪玲，廖金铃.孢囊线虫中 国新纪录种一朝鲜孢囊线虫(Heterodera koreana) [J].植物病理学报，2012，05:551-555) 在江西省南昌市的毛竹根际首次发现朝鲜孢囊线虫(H. koreana); 2015年Maafi等在伊朗的 紫竹上亦报道发现该线虫（Maafi ZT;Taheri ZM. .First Report of Korean Cyst Nematode ,Heterodera koreana,Parasitic on Bamboo ,Phyllostachys nigra, from Iran. [J] .J Nematol .2015)。至今的研究表明，朝鲜孢囊线虫主要寄生在竹类植物上。
[0004] 孢囊线虫的分子诊断技术有基于蛋白和DNA的两种方法。其中，基于DNA的诊断方 法中目的区域rRNA，包括18S，28S，ITS1 (内转录间隔区）和ITS2区，而18S和28S rRNA基因区 域包含保守序列，所以通用引物根据此保守序列设计，并用于ITS区的PCR扩增，如D2A/D3B。
[0005] 近年来，以PCR为基础的分子诊断技术在植物线虫学中取得了很大的进步。葛健军 等设计属水平上的特异性引物Rl、R2(Rl/2)和种水平上的特异性引物RSl、RS2(RSl/2)进行 双重PCR扩增香蕉穿孔线虫，可扩增出长度为362bp和291bp的2个特异性片段谱带。达到快 速检测香蕉穿孔线虫的目的（葛建军，曹爱新，周国梁，赵国柱，谢丙炎.香蕉穿孔线虫双重 PCR快速检测技术研究[J].植物病理学报，2007，05:472-478.)。
[0006] 彭德良等采用双重PCR体系，包括SCAR特异性引物SCNFI/SCNFR/和内标引物D2A/ D3B，达到快速检测大豆孢囊线虫的目的（Shiqi 0ul，2;Peng，Deliangl(dlpeng@ ippcaas.cn)；Xuemin Liu2；Yu Li2；Moens,Maurice3,4.Identification of Heterodera gly-cines using PCR with sequence characterised amplified region(SCAR) pr imers·[J]·NEMATOLOGY.2008(No·3))〇
[0007] 毛竹(？]^11〇8丨&〇1178。油68〇6118)属禾本科竹亚科(1^111131180丨(16&6)，刚竹属，在我 国，毛竹林面积大、分布广、经济价值高，生产潜力大，是影响林农收入的重要经济竹种。目 前，在毛竹上已发现有Heterodera fengi ·、Heterodera guangdongensis ·、Heterodera hainanensis和Heterodera koreana四个孢囊线虫种类，以形态学区分它们，需要专业的知 识基础，且费时费力，达不到快速从土壤样品中检测出线虫的水平。
[0008] 目前，国内外尚无基于朝鲜孢囊线虫核糖体DNA的ITS区的分子检测报道。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种特异性检测朝鲜孢囊线虫的引物及特异性分子检测方法，该引 物和方法具有灵敏度高，特异性强，检测耗时短，操作简单的优点；可用于朝鲜孢囊线虫的 早期诊断和田地监测。
[0010] -种特异性检测朝鲜孢囊线虫的引物，包括特异性引物和内标引物，所述特异性 引物的上下游碱基序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示。
[0011] 为避免检测过程中出现假阴性，在PCR扩增体系中加入内标引物;作为优选，所述 内标引物的上下游碱基序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0012] 一种朝鲜孢囊线虫的特异性分子检测方法，包括：以线虫DNA为模板，通过权利要 求1或2所述引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0013] 若扩增产物中包含449bp的片段，则判定为朝鲜孢囊线虫。
[0014]进一步地，若扩增产物为449bp和785bp的两个片段，则判定为朝鲜孢囊线虫。
[0015] 具体地，所述的线虫为朝鲜孢囊线虫、小麦孢囊线虫、大豆孢囊线虫、菲利普孢囊 线虫、甜菜孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、松材线虫、水稻干尖线虫、豆伞滑刃线虫、甘薯茎线虫 中的一种。
[0016] 进一步地，所述线虫DNA为线虫的二龄幼虫DNA或孢囊DNA。
[0017]作为优选，所述PCR扩增的反应体系为：2·5μ1 lOXEasyTaq Buffer(Mg2+);2.0yl dNTP;lyl ΙΟμ mol/L特异性引物的上游引物；ΙμL ΙΟμ mol/L特异性引物的下游引物；ΙμL 10 ymol/L内标引物的上游引物；ΙμL lOymol/L内标引物的下游引物;0·25μ1 EasyTaq DNA聚 合酶；2.5μ1 DNA模板;ddH20补足至25μ1。
[0018] 作为优选，所述 PCR 扩增的反应条件为:94°C3min;94°C1.5min，56°C45s，72°C80s， 35个循环；72°C延伸10min。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020] 本发明采用如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所示的特异性引物，并结合内标引物， 进行线虫DNA的PCR扩增，通过判定扩增产物中是否包含449bp的片段，实现了朝鲜孢囊线虫 的检测，具有特异性高、灵敏度强、检测时间短等优点，降低了对标本的误判，具有很高的实 际应用价值。
【附图说明】
[0021] 图1为上游引物Hk/F在Η. kor eana的ITS序列上的位点。
[0022] 图2为下游引物Hk/R在H. kor eana的ITS序列上的位点。
[0023]图3为本发明特异性引物Hk/F和Hk/R在核糖体RNA的位点。
[0024]图4为特异性引物Hk/F和Hk/R检测朝鲜孢囊线虫的电泳图；
[0025] 其中，1-3为朝鲜孢囊线虫;CK为阴性对照。
[0026] 图5为实施例2中双重特异性检测朝鲜孢囊线虫的电泳图；
[0027] 其中，1-3:朝鲜孢囊线虫;4:禾谷孢囊线虫;5:大豆孢囊线虫;6:旱稻孢囊线虫;7: 菲利普孢囊线虫;8:甜菜孢囊线虫;9:水稻干尖线虫；10:松材线虫；11:豆伞滑刃线虫；12: 甘薯茎线虫;13:阴性对照。
[0028] 图6为实施例2中单条朝鲜孢囊线虫二龄幼虫不同DNA量对特异性引物灵敏度的影 响；
[0029] 其中，1-9 分别为 1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256倍、 1/512倍，10:阴性对照。
[0030] 图7为实施例2中单个朝鲜孢囊线虫孢囊不同DNA量对特异性引物灵敏度的影响；
[0031] 其中，1-14 分别为 1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256 倍、1/512倍、1/1024倍、1/2048倍、1/4096倍、1/8192倍、16384倍，15:阴性对照。
【具体实施方式】
[0032] 下列实施例中涉及的材料中，朝鲜孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、大豆孢囊线虫和菲利 普孢分别采自浙江省临安市、山西省运城市、安徽省宿州市和河南省禹州市囊线虫，甜菜孢 囊线虫由中国农业科学院植物保护研究所彭德良研究员赠与，旱稻孢囊线虫由湖南农业大 学丁中教授赠与，松材线虫、水稻干尖线虫、甘薯茎线虫和豆伞滑刃线虫均为浙江大学植物 线虫实验室保存。
[0033] EasyTaq Buffer(Mg2+)、dNTP、EasyTaq DNA聚合酶均购自北京全式金生物公司；弓丨 物、PUCM-T载体均由英潍捷基(上海）贸易有限公司合成;DNA Marker和DNA凝胶回收试剂盒 均购自TaKaRa公司。
[0034] 实施例1朝鲜孢囊线虫特异性分子检测体系的建立
[0035] 1、线虫DNA的提取
[0036] 挑取单条的二龄幼虫，放在滴加了6μ1 dd H2O的eppendorf管中；将eppendorf管 置于液氮中lmin，再65 °C水浴2min，上述操作重复2次。向eppendorf管中分别加入2μ1 PTK、 2μ1 buffer(Mg2+free)，再将eppendorf管置于56°C的水浴锅中温育2h;在95°C下变性 1 Omin，再在12000r/min下离心lmin，取eppendorf管中的上清DNA悬浮液，于-20 °C中保存备 用。
[0037] 2、特异性引物的设计
[0038] 在NCBI中下载隶属于孢囊线虫属的10个近缘种的ITS区序列（如表1所示），该近缘 种包括不同地区来源的23个群体;采用软件clustalxl. 83,将上述10个近缘种的ITS区序列 与朝鲜孢囊线虫的ITS区进行序列比对，找出差别位点（如图1，2所示），用Primer Premi er 5设计引物Hk/F和Hk/R，Hk/F和Hk/R均位于I TS 1中（如图3所示）。
[0039]引物序列如下：
[0040] Hk/F：GGCCTTTGGAATGGCCTGT(SEQ ID N0.1),
[0041] Hk/R：CTTCCGAAGAAGCGTAACAA(SEQ ID N0.2)〇
[0042] 表1 23种孢囊线虫的名称及在NCBI上的登录号
[0043]
[0044] 3、朝鲜孢囊线虫特异性分子检测体系的建立
[0045] 采用上述引物序列对朝鲜孢囊线虫和10个近缘种的DNA进行PCR扩增。
[0046] 其中，PCR扩增体系，如下：
[0049] ddH2〇 补足至 25μ1。
[0050] PCR扩增条件是：941€3111丨11;94°(：1.5111丨11，56 1€458,721€8〇8,35个循环；72°(：延伸 10min〇
[0051] PCR扩增后，取3μ1扩增产物，加6x Loading buffer 2μ1混匀，在1.0%琼脂糖凝胶 上，用1 · 0 X ΤΑΕ缓冲液在110V下电泳30min，紫外灯下观察并照相。
[0052]结果显示，朝鲜孢囊线虫的扩增片段长度为449bp，而小麦孢囊线虫、大豆孢囊线 虫、菲利普孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、松材线虫、水稻干尖线虫、豆伞滑刃线 虫和甘薯茎线虫均不能扩增得到449bp的片段。
[0053]实施例2朝鲜孢囊线虫特异性分子检测体系的特异性检测 [0054] 1、朝鲜孢囊线虫特异性分子检测体系的特异性检测
[0055]为了进一步确保特异性检测的准确性，在实施例1所述的PCR扩增基础上，结合朝 鲜孢囊线虫28S上的通用引物D2A和D3B，做双重PCR扩增检测。
[0056] 双重PCR是由内标引物D2A和D3B，特异性引物Hk/F和Hk/R组成，内标引物序列如 下：
[0057] D2A：ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG(SEQ ID NO.3),
[0058] D3B：TCGGAAGGAACCAGCTACTA(SEQ ID N0.4)〇
[0059] PCR检测体系
[0061 ] ddH20 补足至 25μ1。
[0062] PCR扩增条件是：941€3111丨11;94°(：1.5111丨11，56 1€458,721€8〇8,35个循环；72°(：延伸 10min〇
[0063] PCR扩增后，取3μ1扩增产物，加 6x Loading buffer 2μ1混匀，在1.0%琼脂糖凝胶 上，用1 · 0 X ΤΑΕ缓冲液在110V下电泳30min，紫外灯下观察并照相。
[0064] 结果显示，朝鲜孢囊线虫、小麦孢囊线虫、大豆孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、甜菜孢 囊线虫、旱稻孢囊线虫、松材线虫、水稻干尖线虫、豆伞滑刃线虫和甘薯茎线虫均能扩增出 785bp的片段，说明供试线虫的DNA没有质量问题。此外，朝鲜孢囊线虫可扩出第二条稳定的 片段，大小为449bp，而其它线虫不能扩增出此大小的片段，说明此引物具有非常高的特异 性和稳定性。
[0065] 2、朝鲜孢囊线虫特异性分子检测体系的灵敏度检测
[0066]提取单条朝鲜孢囊线虫二龄幼虫的DNA，以2倍稀释法稀释DNA，分别设置1/2倍、1/ 4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256 倍、1/512 倍、1/1024倍等 13 个梯度，各 取2.5μ1作为模板，进行PCR扩增，以检测特异性引物的灵敏度。
[0067]提取单个朝鲜孢囊线虫的孢囊DNA，以2倍稀释法稀释DNA，分别设置1/2倍、1/4倍、 1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍、1/128 倍、1/256 倍、1/512 倍、1/1024倍、1/2048 倍、1/4096 倍、1/8192倍、16384倍等16个梯度，各取2.5μ1作为模板，进行PCR扩增，以检测特异性引物 的灵敏度。
[0068] 如图6所示，对于朝鲜孢囊线虫二龄幼虫的DNA而言，从1倍DNA量到1/64倍DNA量均 能扩增出条带(泳道1-6)，1/128倍和1/256倍也能看到微弱的条带，阴性对照没有扩增出条 带。
[0069] 如图7所示，对于朝鲜孢囊线虫的孢囊DNA而言，从1倍DNA量到1 /2048倍DNA量均能 扩增出条带(泳道1-11)，1/4096倍和1/8192倍的条带仍能隐约可见，阴性对照没有扩增出 条带。
[0070]上述结果显示，本实施例的朝鲜孢囊线虫特异性分子检测方法，灵敏度可达1/256 条二龄幼虫和1/8192个孢囊，说明该特异性引物的特异性及检测方法的灵敏度均非常高， 检测方法非常可靠，具有很高的生产应用价值。
【主权项】
1. 一种特异性检测朝鲜孢囊线虫的引物，包括特异性引物和内标引物，其特征在于，所 述特异性引物的上下游碱基序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。2. 如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述内标引物的上下游碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。3. -种朝鲜孢囊线虫的特异性分子检测方法，其特征在于，包括：以线虫DNA为模板，通 过权利要求1或2所述引物进行PCR扩增，获得扩增产物； 若扩增产物中包含449bp的片段，则判定为朝鲜孢囊线虫。4. 如权利要求3所述的特异性分子检测方法，其特征在于，若扩增产物为449bp和785bp 的两个片段，则判定为朝鲜孢囊线虫。5. 如权利要求3所述的特异性分子检测方法，其特征在于，所述的线虫为朝鲜孢囊线 虫、小麦孢囊线虫、大豆孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、松材线 虫、水稻干尖线虫、豆伞滑刃线虫、甘薯茎线虫中的一种。6. 如权利要求3所述的特异性分子检测方法，其特征在于，所述线虫DNA为线虫的二龄 幼虫DNA或孢囊DNA。7. 如权利要求3所述的特异性分子检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为： 2·5μ1 lOXEasyTaq Buffer(Mg2+);2.0yl dNTP;lyl lOymol/L特异性引物的上游引物；ΙμL ΙΟμL?θΙ/L特异性引物的下游引物；ΙμL ΙΟμL?θΙ/L内标引物的上游引物；ΙμL ΙΟμL?θΙ/L内标 引物的下游引物;〇.25μ1 EasyTaq DNA聚合酶;2.5μ1 DNA模板;ddH20补足至25μ1。8. 如权利要求3所述的特异性分子检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为： 941€3111丨11 ;94。(：1.5111丨11，561€458,721€8〇8,35个循环 ；72。(：延伸1〇11^11。
【文档编号】C12Q1/68GK105969888SQ201610521664
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】郑经武, 朱红雪, 田忠玲, 蔡瑞杭, 李晓琳
【申请人】浙江大学