一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为BOE16、S119、S83，本发明同时公开一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的方法。本发明的方法可将‘夏翠芥蓝’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
【专利说明】
一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子检测领域，尤其涉及一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物 及方法。
【背景技术】
[0002] 种子质量是农业生产中的重要元素，其质量的优劣程度直接影响农产品的质量和 产量。品种的纯度和真伪鉴定是以形态学标记为依据，这种鉴定方法从农业生产角度具有 稳定可靠的优点，但从遗传学角度看，品种的纯度和真伪鉴定是实质上是对品质基因型的 鉴定，只有通过鉴定DNA分子本身才能准确可靠的鉴定品种的基因型。DNA分子标记技术是 随着分子生物学的发展而发展起来的一种新型的鉴定方法。它具有简便、快速、准确的特 点。目前常用的分子标记技术包括AFLP，SRAP，SCAR，SSR等，SSR分子标记分布广泛，且具有 共显性和高多态性等特征。加之甘蓝(芥蓝为甘蓝的一个变种）已经完成基因组测序，有足 够的SSR标记可以选择。
[0003] 芥蓝是起源于华南地区的一种特色叶菜，为甘蓝的一个变种。有限的亲本资源以 及杂交品种的不断涌现，使得品种间尤其是杂交种子之间的遗传差异越来越小，蔬菜种子 的真实性与品种纯度鉴定也越来越难，加之夏翠芥蓝是利用自交不亲和系配制而成的杂交 一代，在制种过程中母本有一定的自交结实率，常常会出现假杂种，导致种子遗传纯度下 降，给生产造成巨大损失。
[0004] "夏翠芥蓝"是以Lb07F为母本，Lb07M为父本育成的国内首次通过品种审定的杂交 种。具有生长势强，产量高，抗病抗逆型强的特点。是华南地区推广面积较多的早熟品种。为 了保证优良品种产生最大的经济效益，因此一种快速、准确、有效的品种鉴定方法非常重 要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物及方法，旨在 解决目前在夏翠芥蓝的杂交一代，在制种过程中母本的自交结实率，常常会出现假杂种，导 致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大损失的问题。
[0006] 本发明是这样实现的，一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，该用于夏翠 芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为B0E16、S119、S83;
[0007] 所述B0E16引物序列为SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:1 序列为B0EI6-F: 5'-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3'，SEQ ID NO:2SB〇E16-R:5'-CAAACGTGGAAGGAGATTA。
[0008] 进一步，SSR引物还采用S119引物，
[0009] 所述S119引物序列为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:3序列为S119-F: 5'-TTGCACACATACCAGATGCC-3'，SEQ ID N0:4序列为S119-R:5'-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC。
[0010] 进一步，SSR引物还采用S83引物，
[0011] 所述S83引物序列为SEQIDN0:5和SEQIDN0:6，SEQIDN0:5序列为S83-F:5'- GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'，SEQ ID
[0012] 本发明另一目的在于提供一种夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定方法，该夏翠芥蓝杂交 种子纯度的鉴定方法包括如下步骤：
[0013] 1)提取芥蓝幼苗基因组DNA;
[0014] 2)以芥蓝基因组DNA为模板，使用SSR引物Β0Ε16、S119、S83进行PCR扩增；
[0015] 3)对扩增的产物进行凝胶电泳；
[0016] 4)对电泳结果进行分析，同时具有亲本特异性条带的单株做为杂交种，缺少亲本 特异性条带中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，计算方法为：
[0017] SSR鉴定杂交种比率（％ )=(杂交种带数/总带数）X 100%，
[0018] 其中，SSR引物B0E16产生458bp的母本特异标记和产生485bp的父本特异标记。 [0019]提取芥蓝幼苗基因组DNA包括以下步骤：
[0020]①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入ΙΟΟΟμΙ 2% CTAB提取缓冲液，混匀后置于65°C水浴中温浴50min，每隔5min摇动一次；
[0021] ②静置至室温后在4°C下12000rpm离心10min，将上清（约800μ1)转移到新的2ml离 心管；
[0022]③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25 : 24:1，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4°C下 12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml离心管中；
[0023]④加2/3体积340μ1预冷的异丙醇，缓慢混匀，缓慢颠倒20次，置于一20°C下培养 30min；
[0024] ⑤在4°C下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μ1预冷的70%乙醇洗涤DNA 沉淀两次，微干；
[0025] ⑥加入100μ1无菌水溶解。
[0026] 进一步，PCR扩增的20μ1 反应体系为：基因组DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTP 0.2mmol · L-SSSR引物0.25mmol · L-STaq酶0.2U。
[0027] 进一步，PCR扩增的程序为：94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸40s，35个循环后，72 °C保持7min，然后置于4°C保存待检测。
[0028] 进一步，所述凝胶电泳为扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶 上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.1%AgN0 3银染15min;银染后用2%Na0H、 0.4%甲醛、0.04%Na2C03显色，显色后在灯箱上拍照分析。
[0029] 本发明的方法可将'夏翠芥蓝'杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测 出杂交种子的纯度，现在鉴定纯度的方法是将杂交种子种植在田间，苗长大后肉眼进行观 察哪些是杂交种，哪些是假杂种，这种方法时间长，占地大，还要非常有经验的一线工作人 员才能鉴定出，准确率因人而异，而利用SSR引物进行鉴定可以达到快速、准确、有效的特 点，节省人力、物力、财力;本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统 杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明实施例提供的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定方法流程图；
[0031] 图2是本发明实施例提供的引物B0E16夏翠芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺 凝胶电泳图谱一；
[0032]图3是本发明实施例提供的引物B0E16夏翠芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺 凝胶电泳图谱二；
[0033] 图中；P1:母本A-2;P2:父本C_8:F1为杂交一代种子。
[0034] 图4是本发明实施例提供的引物S119夏盛芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺 凝胶电泳图谱一；
[0035] 图5是本发明实施例提供的引物S119夏盛芥蓝种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺 凝胶电泳图谱二；
[0036] 图中：P1:母本A-2;P2:父本C_8:F1为杂交一代种子。
【具体实施方式】
[0037] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0038] 下面结合附图及实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0039] -种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，该用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定 的引物为SSR引物，所述SSR引物为B0E16、S119、S83;
[0040] 所述B0E16引物序列为SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:1 序列为B0EI6-F: 5'-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3'，SEQ ID NO:2SB〇E16-R:5'-CAAACGTGGAAGGAGATTA;
[0041 ]所述S119引物序列为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:3序列为S119-F: 5'-TTGCACACATACCAGATGCC-3'，SEQ ID N0:4序列为S119-R:5'-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC;
[0042] 所述S83引物序列为SEQIDN0:5和SEQIDN0:6，SEQIDN0:5序列为S83-F:5'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-3'，SEQ ID
[0043] 如图1所示:一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定方法，该用于夏翠芥蓝杂交种子 纯度的鉴定方法包括如下步骤：
[0044] S101:提取芥蓝幼苗基因组DNA;
[0045] S102:以芥蓝基因组DNA为模板，使用SSR引物Β0Ε16、S119、S83进行PCR扩增；
[0046] S103:对扩增的产物进行凝胶电泳；
[0047] S104:对电泳结果进行分析，同时具有亲本特异性条带的单株做为杂交种，缺少亲 本特异性条带中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物B0E16产生458bp 的母本特异标记和产生485bp的父本特异标记。
[0048] 进一步，PCR扩增的20μ1 反应体系为：基因组DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTP 0.2mmol · L-SSSR引物0.25mmol · L-STaq酶0.2U。
[0049] 进一步，PCR扩增的程序为：94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸40s，35个循环后，72 °C保持7min，然后置于4°C保存待检测。
[0050] 进一步，所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0051 ] 实施例1
[0052] '夏翠芥蓝'杂交种子纯度检测方法的建立。
[0053]筛选纯度鉴定的SSR引物。
[0054]从所公布的甘蓝SSR引物及EST-SSR引物在双亲间进行筛选，选出共显性差异标记 条带的三对引物序列如下所示：
[0064]三种标记带型清晰、重复性好。引物能产生的母本特异性标记和的父本特异性标 记。
[0065]利用上述特异性引物对'夏翠芥蓝'杂交种子进行纯度鉴定。
[0066]鉴定方法：
[0067] (1)芥蓝DNA的提取：
[0068]实验材料为'夏翠芥蓝'商品种及其母本A-2、父本C-8幼小叶片DNA。步骤如下： [0069]①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入ΙΟΟΟμΙ 2% CTAB提取缓冲液，混匀后置于65°C水浴中温浴50min(每隔5min摇动一次）。
[0070] ②静置至室温后在4°C下12000rpm离心10min，将上清（约800μ1)转移到新的2ml离 心管。
[0071 ]③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24:1 )，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4°C下 12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml离心管中。
[0072]④加2/3体积340μ1预冷的异丙醇，缓慢混匀（缓慢颠倒20次），置于一 20°C下培养 30min〇
[0073] ⑤在4°C下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μ1预冷的70%乙醇洗涤DNA 沉淀(两次），微干。
[0074] ⑥加入100μ1无菌水溶解。
[0075] (2)SSR_PCR 扩增：
[0076] PCR 体系（20μ1)
[0077] DNA 模板：5ng
[0078] 引物_F:0·25mmol · L-1
[0079] 引物-R:〇.25mmol · L-1
[0080] dNTP:0.2mmol · L-1
[0081] Mg2+:0.15mmol · L-1
[0082] 10XPCR buffe：2.0yl
[0083] Taq酶：0.2U
[0084] ddH20 补足至 20μ1
[0085] PCR扩增程序：
[0086] 94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸4〇8,35个循环后，72°〇 保持7min，然后置于4°C保存待检测。
[0087] (3)凝胶电泳
[0088]扩增产物在双垂直非变性浓度为8 %的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小 时，电泳结束后进行〇. 1 %AgN〇3银染15min;银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2C〇3显 色，显色后在灯箱上拍照分析。
[0089] (4)扩增结果
[0090] 三种引物在'夏翠芥蓝'父母本及杂交一代种子分别能扩增出两条特异带；其中 B0E16引物母本pi扩增出的a条带，母本p2号扩增出b的条带;见图2和图3。
[0091] 引物S116母本扩增出c条带，父本扩增出d条带，见图4和图5。
[0092]回收特异条带，送生物工程有限公司测序。条带的序列如SEQ ID N0:1-2所示，杂 交种子中与父本、母本扩增产物的序列相符。
[0093] 实施例2
[0094]采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的50株'夏翠芥蓝'，对其 单株编号，提取单株DNA进行检测，检测结果两个引物检测结果一致，种子纯度为98%，与田 间调查结果一致，准确率为100 %。
[0095] 以上实施例表明，本发明的方法可将'夏翠芥蓝'杂交种子与其父母本种子进行有 效区分，快速、准确检测出种子纯度。并且选取任何一个引物均能准确鉴别。
[0096] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，该用于夏翠芥蓝杂交种 子纯度鉴定的引物为SSR引物，所述SSR引物为B0E16;所述B0E16序列为SEQ ID NO: 1和SEQ IDN0:2，SEQIDN0:1序列为B0E16-F:5'-CGTAAGCGAGATAGGCAGAT-3'，SEQIDN0:2序列为 B0E16-R:5 '-CAAACGTGGAAGGAGATTA。2. 如权利要求1所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，所述SSR 引物还采用S119,所述S119序列为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:3序列为5119_ F : 5 '-TTGCACACATACCAGATGCC-3 '，SEQ ID N 0 : 4 序列为 S 1 1 9 - R : 5 '-ACTCGAAGAGAAGATAAGGTC 〇3. 如权利要求1所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度鉴定的引物，其特征在于，所述SSR 引物还采用S83,所述S83序列为SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:5序列为S83-F: S'-GATCAAATAACGAACGGAGAGA-S^SEQ ID N0:6序列为 5831:5: GAGCCAAGAAAGGACCTAAGAT 〇4. 一种利用权利要求1所述引物进行夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于， 该夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法包括如下步骤： 1) 提取芥蓝幼苗基因组DNA; 2) 以芥蓝基因组DNA为模板，使用SSR引物B0E16进行PCR扩增； 3) 对扩增的产物进行凝胶电泳； 4) 对电泳结果进行分析，同时具有亲本特异性条带的单株做为杂交种，缺少亲本特异 性条带中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物B0E16产生458bp的母本 特异标记和产生485bp的父本特异标记。5. 如权利要求4所述的夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，提取芥蓝幼苗 基因组DNA包括以下步骤： ① 用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入ΙΟΟΟμΙ 2%CTAB 提取缓冲液，混匀后置于65°C水浴中温浴50min，每隔5min摇动一次； ② 静置至室温后在4°C下12000rpm离心10min，将上清转移到新的2ml离心管； ③ 加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25 :24:1，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4°C下 12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml离心管中； ④ 加2/3体积340μ1预冷的异丙醇，缓慢混匀，缓慢颠倒20次，置于一 20°C下培养30min; ⑤ 在4°C下13000rpm离心10min，弃上清，加入200-300μ1预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀 两次，微干； ⑥ 加入100μΙ无菌水溶解。6. 如权利要求2所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增 的 20μ1 反应体系为：基因组 DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTPOJmmol · L-SSSR 引物 0.25mmol · L-STaq酶0.2U。7. 如权利要求2所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增 的程序为:94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35个循环后，72°C 保持7min，然后置于4°C保存待检测。8. 如权利要求2所述的用于夏翠芥蓝杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，所述凝胶 电泳为扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小 时，电泳结束后进行ο. 1 %AgN〇3银染15min;银染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2C〇3显 色，显色后在灯箱上拍照分析。
【文档编号】C12Q1/68GK105969898SQ201610579106
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】李桂花, 陈汉才, 王亭亭, 黎庭耀, 张艳
【申请人】广东省农业科学院蔬菜研究所