一种检测st251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒及应用

一种检测st251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒及应用
【专利摘要】本发明公开了一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒及应用，该试剂盒：a)PCR Premix；b)引物对；c)标准阳性DNA模板；d）标准阴性DNA模板；e)灭菌双蒸水，上游引物序列5’?GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC?3’，下游引物序列5’?CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT?3’，退火温度为63℃，正确的扩增产物大小为826bp，标准阳性DNA模板为ST251型嗜水气单胞菌XS91?4?1株的基因组DNA提取物，DNA浓度为500ng/μl；阴性DNA模板为维氏气单胞菌IB340株的基因组提取物，DNA浓度500ng/μl，该试剂盒适用于所有类型的基因扩增仪，检测特异性强，灵敏度高、快速而准确、稳定性好。可用于淡水鱼类暴发病和其它鱼类由嗜水气单胞菌引起的败血症的快速诊断、细菌快速检测和鉴定，并继而在疾病的预测、预报以及流行病学研究中得到广泛应用。
【专利说明】
一种检测ST251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种快速检测ST251型致病性嗜水气单胞 菌的试剂盒，还涉及一种检测ST251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒用途，可用于淡水养殖 鱼类暴发病和其它淡水鱼类由嗜水气单胞菌引起的败血症的快速鉴别诊断和流行病学研 究，还可以为相关基础研究提供技术支持。
【背景技术】
[0002] 气单胞菌(aeromonads)是我国淡水养殖鱼类中最常见的病原性细菌，几乎可以侵 害各种水产养殖动物。它们存在于水产养殖系统中的各个生态位，是健康水生动物肠道的 主要常居菌之一。分类上属于γ-变形菌纲、气单胞菌科、气单胞菌属，已被认可的种类至少 在25种以上，而且新种在不断被报道。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是该属的 代表种，也是最常被鉴定为鱼类病原菌的气单胞菌。一般认为，多数嗜水气单胞菌是条件致 病菌。嗜水气单胞菌引起水产动物疾病有急性的，也有慢性的，症状会有不同表现，如体表 溃烂、肠炎、烂尾、烂鳍、红皮炎、竖鳞，腹水病以及败血症等，所以嗜水气单胞菌的不同菌株 之间其毒力(致病性)是不一样的。然而，从上世纪80年代末开始至今，发生在我国由嗜水气 单胞菌引起的鱼类暴发性出血症却是一个例外，经常引起同一水体中多种养殖鱼类同时大 规模暴发性死亡(又称为运动型气单胞菌败血症Motile Aeromonas Septicemia，MAS)，这 种嗜水气单胞菌显示出强大的致病性。成为我国危害最大的鱼类细菌性疾病。这些嗜水气 单胞菌菌株被认为是致病性嗜水气单胞菌(virulent Aeromonas hydrophi la)。由于嗜水 气单胞菌间存在巨大的异质性，不同的致病性菌株被发现携带不一样的毒力基因组合，环 境中的无致病性菌株也常携带不止一种甚至多种毒力基因。
[0003] 气单胞菌的分类和鉴定非常复杂，但近年来随着分子生物学技术的发展，对气单 胞菌的分类鉴定和分型技术取得了重大突破。大量研究结果显示，这些来自暴发病病例的 菌株其基因型都属于ST251型。这些菌株在毒力基因谱、对斑马鱼的LD 5Q以及血清型等方面 也非常一致，可以认为属于同一克隆。从2009年开始，一种由嗜水气单胞菌引起的暴发性疾 病在美国的斑点叉尾鮰养殖地区发生，造成了巨大的经济损失，经比较发现其病原也是 ST251型嗜水气单胞菌。显然，ST251型嗜水气单胞菌与其他ST型嗜水气单胞菌是不同的。
[0004] 分子生物学技术已经证明是最有效的细菌检测、鉴定技术，具有简便、快速、廉价、 灵敏和特异性强的特点。结合传统的细菌分离、培养技术，已成为细菌学研究的基本技术。
[0005] 关于致病性嗜水气单胞菌的检测和鉴定，有许多文献和专利技术都报道了相关的 PCR检测技术。然而，这些技术都是针对该菌的某个或某些毒力基因而设计，如溶血素基因、 气溶素基因，肠毒素基因等。正如前文所述，嗜水气单胞菌具有很大的异质性，虽然这些基 因在ST251型嗜水气单胞菌普遍存在，但在许多非致病性菌株中也有分布，甚至在其它种类 的气单胞菌中也同样存在。所以，这样的检测技术无法区分ST251型嗜水气单胞菌和其它类 群的嗜水气单胞菌。
[0006] 传统的基于表型的细菌鉴定和检测技术存在明显的技术劣势，如费时、费力和准 确性不稳定。很多文献报道或专利技术所介绍的PCR检测方案，在甄别致病性嗜水气单胞菌 方面是个空白，特别是还没有专门针对ST251型致病性嗜水气单胞菌的PCR检测技术。而这 个类群的嗜水气单胞菌是鱼病学领域重点关注课题之一，对它的检测和鉴定是相关疾病诊 断和流行病学研究等必要技术手段。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是在于提供了一种检测ST251型致病性嗜水气单胞菌的试剂盒，这 个类群的嗜水气单胞菌都具有强致病性，是淡水鱼类暴发病(细菌性败血症）的病原菌。这 种致病菌在水产上的危害极大，侵害鱼类的种类多，是最重要最常见的鱼类病原细菌。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供了一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在 制备治疗或预防淡水养殖鱼类暴发病药物中的应用。在实施过程中无需特殊的试剂，并提 供了阳性对照和阴性对照DNA模板，可以防止出现假阳性和假阴性扩展。适用于目前市场上 所有类型的基因扩增仪，检测特异性强、灵敏度高、快速而准确、稳定性好。可用于水产养殖 过程中淡水鱼类暴发病和其它鱼类(如斑点叉尾鮰，罗非鱼、鱖鱼等）由嗜水气单胞菌引起 的败血症的快速诊断、细菌快速检测和鉴定，并继而在疾病的预测、预报以及流行病学研究 中得到广泛应用。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0010]本发明的技术构思是:通过对多株ST251型嗜水气单胞菌进行基因组测序，另外从 Genbank数据中下载多个嗜水气单胞菌全基因组序列，通过比较基因组学研究，我们发现一 种脱氢酶编码基因是ST251型致病性嗜水气单胞菌所独有的，在非致病性和其他类型致病 性嗜水气单胞菌中均不存在。为此，我们针对这个基因设计特异性PCR扩增引物，进行试验 和不断地优化。通过对15株库存的不同菌株和若干门诊病例菌株的反复检测，证实了这对 引物在检测、鉴定ST251型致病性嗜水气单胞菌中的高度特异性。在此基础，我们建立了相 应的检测试剂盒，用于淡水鱼类细菌性败血症和斑点叉尾鮰败血症的快速诊断，病原的快 速检测和鉴定。
[0011] 通过比较基因组学研究发现，没有哪种目前报道的所谓毒力基因是某个类群所独 有，环境菌株的基因组上也含有毒力基因。相关的文献分析也证实了这一点。因此，不难理 解针对毒力基因的检测结果容易出现假阳性，而本发明就克服了这个缺点，而且经过大量 的实验予以了证实。
[0012] 本发明提供的检测方法，不仅能够应用于已经分离纯化的细菌样品的鉴定，也可 以应用于病鱼血液样品、组织样品、水样、池塘底泥样品以及饲料样品中致病性嗜水气单胞 菌的检测。
[0013] 一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒，该试剂盒的内容包括：
[0014] a.PCR premix：一种冻干的PCR预混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、反 应缓冲液、PCR反应增强剂和稳定剂；
[0015] b.引物对；
[0016] c.标准阳性DNA模板；
[0017] d.标准阴性DNA模板；
[0018] e.灭菌双蒸水。
[0019] 其特征在于:上游引物序列为5 ' -GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3 '，下游引物序列为 5' -CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3 '，退火温度为63°C，正确的扩增产物大小为826bp。标准阳 性DNA模板为ST251型嗜水气单胞菌XS91-4-1株的基因组DNA提取物，DNA浓度为500ngAU; 阴性DNA模板为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii IB340株）的基因组提取物，DNA浓度为 500ngAU。阳性和阴性对照菌株均为申请者所在实验室自己分离、鉴定和保存的菌株。所述 的引物对是借助DNAstar软件中的引物设计板块PimerSelect来完成的，从中选择10对最理 想的引物再进行Blast比对分析，筛选得到如下特异性最高的引物对:上游引物序列为5'-GCGGCGTAAGCGGAITTGTAGC-3 ' ；下游引物序列为5 ' -CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3 '。
[0020] -种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在制备治疗或预防淡水养殖鱼类暴 发病药物中的应用。其使用步骤是：
[0021] 1.需要对待检样品进行前处理，以提取其中的总DNA用于采用本发明提供的试剂 盒进行检测。本发明提供的检测试剂盒，不仅能够应用于已经分离纯化的细菌样品，也可以 应用于病鱼血液样品、组织样品、水样、池塘底泥样品以及饲料样品中致病性嗜水气单胞菌 的检测。为了提取到高质量的DNA供本发明的试剂盒检测，可以根据样品类别，选用目前市 场上成熟的商品化DNA提取试剂盒（如QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit和QIAamp DNA Stool Mini Kit)。
[0022] 1)对于水样:取1升水样，无菌操作，在4°C条件下12800 X g离心20分钟，将沉淀物 收集用于后续DNA提取。
[0023] 2)对于池塘底泥、饲料或动物肠道等固体或半固体样品：首先于无菌条件下充分 捣碎，然后取适量用无菌水进行1:2~5稀释，振摇2min，再用400 X g离心lmin，收集上清液， 按步骤1)离心并收集其沉淀物用于后续DNA提取。
[0024] 3)对于步骤1)和步骤2)获得的离心沉淀物，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit提取其中的总DNA。
[0025] 4 )对于细菌菌落样品，可以采用Pr omega公司的Wi/arcliSGenomi c DNA Purification Kit提取其基因组DNA，用于后续PCR检测。对于菌落样品，有时也可以用灭菌 牙签挑取极少量的细菌直接置于PCR反应体系中，而无需事先提取其DNA。不过，这种情况下 需要将PCR扩增过程中的预变性时间由2min调整为5min。
[0026] 2.PCR反应体系的建立。在每一个Premix管中，加入2μ1上游引物、2μ1下游引物，1μ 1DNA模板，以及45μ1灭菌双蒸水，至总体积约为50μ1。轻度混匀后，闪离2s，使所有液体都集 中于管底。
[0027] 3.置于常规的PCR扩增仪上进行PCR扩增。PCR扩增的程序按以下反应参数进行:在 95 °C下预变性2min，进入变性、退火和延伸的循环过程:在94 °C下持续30s发生变性过程，在 63°C下持续30s完成退火过程，在72°C下持续60s进行延伸过程。上述的变性、退火和延伸的 循环过程进行32次循环，最后在72°C再次延伸10min。
[0028] 4.扩增产物凝胶电泳分析。使用1.5%浓度的琼脂糖进行凝胶电泳，溴化乙锭染色 后，置紫外灯下观察和拍照。根据DNA分子量标记，判断扩增产物DNA的片段大小。
[0029] 5.结果判断。如果扩增的DNA条带大小约为826bp，即认为扩增结果为阳性，也就是 说样品DNA中存在ST251型嗜水气单胞菌的DNA。如果无扩增条带出现，或者条带大小明显与 826bp不符，则扩增结果判定为阴性，说明样品DNA中不存在ST251型嗜水气单胞菌的DNA。
[0030] 6.质量控制：只有阳性对照样品中扩增出正确条带，而阴性对照样品无条带出现 的扩增的结果才能被认可。如果阳性对照样品没有扩增出条带，或条带大小与预计的不符， 或者阴性对照样品扩增出条带，那说明反应体系或实验操作存在某种问题，需要重新设置 反应体系进行扩增。
[0031] 一个优选的方案是，将步骤5中获得的与预期大小相似的DNA片段(826bp)，采用标 准方法对其进行回收纯化，然后进行克隆和测序。测序的结果为SEQ ID NO: 1所示的核苷酸 序列。该序列相似度应该在95%以上。
[0032] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0033] 1.与传统检测和鉴定方法相比，本发明提供的PCR的检测方法具有高灵敏性，高特 异性和高准确性的特点。
[0034] 2.本发明提供的检测试剂盒针对的是基因型为ST251的嗜水气单胞菌这个特定细 菌类群，因此针对性强。这种致病菌在水产上的危害极大，侵害鱼类的种类多，是最重要最 常见的鱼类病原细菌，也是学术界研究的重要对象。预示着本发明的应用范围将会非常广 泛。鉴于这个类群嗜水气单胞菌的巨大危害性，以及从来没有针对这个特定类群建立的检 测或鉴定技术，应该说本发明具有明显的创造性。
[0035] 3.本发明是在比较基因组学研究的基础上，发现了这个类群嗜水气单胞菌所特有 的酶类，并基于这种酶类设计特异性引物。比常规针对气单胞菌毒力基因设计的引物，其可 靠性更高。不会出现假阳性的检测结果，也就是说不会对任何非ST251型嗜水气单胞菌产生 阳性扩增反应。这说明其检测的准确性比现有的相关检测技术具有明显的优势和先进性。
[0036] 4.由于本发明的检测对象针对性强，因此其应用价值将非常高。可用于水产养殖 过程中淡水鱼类暴发病和其它鱼类(如斑点叉尾鮰，罗非鱼、鱖鱼等)细菌性败血症的快速 诊断、非生物样品中（如饲料、底泥、水体样品等)这个类群细菌的快速检测和鉴定，并继而 在疾病的预测、预报以及流行病学研究中得到广泛应用。
[0037] 5.本发明可以用于各种类型的样品检测，适用范围广。为不同的样品提供了不同 的操作方案。
[0038] 6.将本发明提供的引物进行nucleotide Blast搜索，结果与上游引物高度吻合 (100%query cover)的细菌类群主要是嗜水气单胞菌和肠杆菌科的细菌(见图1);与下游 引物高度吻合的细菌类群为嗜水气单胞菌(见图2)，而且均为ST251型菌株。所以，使用上下 游引物对细菌DNA进行扩增，同时采用本发明推荐的高退火温度(63°C)，那么只有ST251型 嗜水气单胞菌能被扩增出来。这充分证明本发明提供的检测方法，对这个类群的细菌具有 高度的特异性。
[0039] 7.在日常鱼病诊治过程中，本发明提供的检测试剂盒获得了很好的检测结果（见 表1)。表1检测结果显示，只有鲢、鳙、团头鲂、鲫鱼以及斑点叉尾鮰的暴发性出血性败血症 病鱼中检测结果为阳性，而且这个检测结果与细菌分离的结果高度吻合。其它种类的病鱼 中即使有败血症症状，也没检测出这个类群的嗜水气单胞菌，说明它的病原不是ST251型嗜 水气单胞菌，其结果同样与细菌分离的结果高度一致。池水、池塘底泥和饲料中有时也能检 测出阳性结果，证明了这种检测技术的灵敏性。有些疾病（如草鱼的肠炎和烂尾病)尽管其 病原经分离鉴定确认为嗜水气单胞菌，但这种嗜水气单胞菌不属于ST251型，所以检测结果 依然为阴性。
[0040]表1本发明提供的试剂盒用于日常病鱼样品中ST251型嗜水气单胞菌的检测结果 (2013-2016)

[0043] +表示样品中含有ST251型嗜水气单胞菌;-表示样品中不含ST251型嗜水气单胞菌
【附图说明】
[0044]图1为本发明提供的上游扩增引物，经Blast比对获得的高覆盖度（100%)序列所 对应的细菌名称，以展示引物的特异性。
[0045]图2为本发明提供的下游扩增引物经Blast比对获得的高覆盖度（100%)序列所对 应的细菌名称，以展示引物的特异性。
[0046]图3为一种试剂盒用于不同细菌、不同气单胞菌的检测结果。
[0047]以证明本检测方面的特异性。第1泳道是分子量标准；往后依次是Aeromonas hydrophila IB101，团头鲂血液分离株（ST251 型）；Aeromonas hydrophila LNB101，鲢血液 分离株（ST251 型）；Aeromonas veronii IH317,为团头妨肠道分离株;Aeromonas media 4pW15,为池塘水分离株;Aeromonas hydrophila XS91-4-1，为鲢血液分离株（ST251型）； Aeromonas sobria CR79-1-1，为病原菌株;Aeromonas media 4LNC204,为链肠道分离株； Streptococcus agalactiae 0718flz，为罗非鱼肝脏分离株；Streptococcus agalactiae 0722XY，为罗非鱼肝脏分离株；Citrobacter freudii HD00103,为舞鱼病原菌；Aermonas schubertii HYL2,为乌體病原菌;Yersinia ruckeri SC90-2-4,为鲢I庸病原菌;Vibrio anguillarum E-3-11，为海水鱼类病原菌;Aeromonas veronii IB340,为团头鲂血液分离 株;Pseudomonas fluoresces 0704CC1，为斑点叉尾鮰血液分离株。
[0048]图4为一种检测试剂盒用于病鱼样品中ST251型嗜水气单胞菌的检测结果。
[0049] 第1泳道是分子量标准，第2道为病原菌Aeromonas hydrophila XS91-4-l(ST251 型)DNA的扩增结果;第3和第4道为2尾感染XS91-4-1的病鱼肝脏样品；第5道和第6道为感染 Aeromonas veronii IB340的病鱼肝脏样品。
[0050] 图5为一种检测试剂盒用于饲料、池水和池塘底泥样品中ST251型嗜水气单胞菌的 检测的结果。
[0051] M:分子量标准，第1和第2泳道为饲料样品，第3和第4泳道分别为添加了病原菌嗜 水气单胞菌Aeromonas hydrophila XS91-4-l(ST251型）菌液的饲料样品；第5,6泳道为常 规的池塘水样;第7和8泳道为常规的池塘底泥样品。
【具体实施方式】
[0052]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常 按照常规条件如:J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002,分子克隆实验指南(第三版）；商 品化试剂盒按其附带的使用说明进行操作。所有涉及DNA提取和PCR反应体系配置的操作步 骤，均须采用无菌操作技术。
[0053]在本发明的说明书中，术语"试验样品"是指怀疑包含有待检测细菌的所有对象 物。试验样品不特别限定，只要可通过核酸扩增法对染色体DNA的特定区域扩增来检测细菌 的存在即可。优选的实例包括养殖水体中的水，养殖水体中的底泥或其他固体附着物，饵料 和生物样品等。生物样品主要是指细菌样品、水产养殖动物的血液、粘液、组织器官或肠道 内容物等。
[0054] 本发明说明书中的细菌基因组DNA提取试剂盒不仅限于QIAGEN公司和Promega公 司的产品，任何符合要求的其他公司的同类试剂盒均可。
[0055] PCR反应体系除了可以使用本发明提供的PCR Premix之外，也可以选用商品化的 同类产品，只需在Premix中加入规定量的DNA模板和引物即可进行PCR扩增。其前提是阳性 对照样品必须扩增出正确条带，阴性对照样品无扩增条带出现。
[0056] 实施例1:
[0057] -种检测致病性嗜水气单胞菌的试剂盒，该试剂盒含有：
[0058] a. PCR premix: -种PCR预混合物冻干粉，包含高保真的DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、 反应缓冲液、PCR反应增强剂和稳定剂；
[0059] b.引物对；
[0060] c.标准阳性DNA模板；
[0061 ] d.标准阴性DNA模板；
[0062] e.灭菌双蒸水。
[0063] 所述的引物对的上游引物为5 ' -GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3 ' ；
[0064] 所述的引物对的下游引物为5'-〇1^111^^11^611^661'11^1'-3'。
[0065] 具体操作过程如下：
[0066] 1) 15株细菌的基因组DNA抽提：采用细菌基因组提取试剂盒，如Promega公司的 Wizard?Genomic DNA Purification Kit，按说明书要求操作。
[0067] 2)PCR反应体系采用PCR Master Mix，然后加入下列成分 上游引物（10 μΜ) 2μ1
[0068] 下游引物（ΙΟμΜ) 2μ1 DNA模板 ΙμL 双蒸水 47μ1
[0069] 总体积 50μ丨
[0070] 以上各组分混匀后，闪离2s，使液体集中于管底。扩增条件为:94°C2min，接着32个 循环：94°C30s，63°C30s，72°C60s，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0071] 3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的分析；
[0072] PCR产物用1.5% (W/V)琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外 分析仪下观察和拍照。
[0073] 4)结果：
[0074]有的泳道有DNA条带的出现，其大小根据分子量标准判断为862bp，这说明细菌培 养物为ST251型致病性气单胞菌。未出现条带的样品所对应的菌株不是ST251型致病性气单 胞菌。阳性样品出现正确的扩增条带，而阴性对照样品中未出现扩增带（图3)。也就是说没 有出现假阳性和假阴性结果，检测结果可信。此外，3次重复试验都获得了相同的结果，说明 方法的重现性好。
[0075] 实施例2:
[0076] -种快速检测致病性嗜水气单胞菌的试剂盒，用于检测水产养殖动物组织样品中 可能存在的目标细菌。为实现这个目的，首先必须对样品进行前处理，提取样品中的总DNA， 然后采用本发明提供的试剂盒进行PCR扩增分析。
[0077] -种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在制备治疗或预防淡水养殖鱼类暴 发病药物中的应用。其操作步骤是：
[0078] 1)无菌操作，取动物的肝肾脾等内脏组织，或动物的血液。
[0079] 2)采用QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit提取组织中包括细菌基因组DNA 在内的所有DNA，按说明书要求操作。
[0080] 3)PCR反应体系采用本发明的试剂盒中的PCR Premix，然后加入下列成分 上游引物（10 μΜ) 2μ1 下游引物（1〇μΜ) 2:μ1
[0081] 双蒸水 47μ1 总体积 50μ1
[0082] 以上各组分混匀后，闪离2s，使液体集中于管底。扩增条件为:94°C2min，接着32个 循环：94°C30s，63°C30s，72°C90s，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0083] 4)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的分析及结果判断。
[0084] PCR产物用1.5% (W/V)琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外 分析仪下观察和拍照。
[0085] 5)结果:有些待检样品所对应的泳道中有DNA条带出现，其大小根据分子量标准判 断为862bp。这说明这些泳道所对应的组织样品中有ST251型致病性气单胞菌存在。阳性对 照和阴性对照样品都呈现出预期结果（图4)。也就是说没有出现假阳性和假阴性结果，检测 结果可信。此外，3次重复试验都获得了相同的结果，说明方法的重现性好。
[0086] 实施例3:
[0087] -种快速检测致病性嗜水气单胞菌的试剂盒，用于检测非生物样品（水样、底泥 样、饲料样）中可能存在的目标细菌。为实现这个目的，首先必须对样品进行前处理，提取样 品中的总DNA，然后采用本发明提供的试剂盒进行PCR扩增分析。
[0088] 一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在制备治疗或预防淡水养殖鱼
[0089]类暴发病药物中的应用。其操作步骤是：
[0090] 1)对于水样:取1升水样，无菌操作，在4°C条件下12800 X g离心20分钟，将沉淀物 收集用于DNA提取。
[0091] 2)对于池塘底泥、饲料或动物肠道等固体或半固体样品：首先于无菌条件下充分 捣碎，然后取适量用无菌水进行1:2~5稀释，振摇2min，再用400 X g离心lmin，收集上清液， 按步骤1)离心并收集其沉淀物用于后续DNA提取。
[0092] 3)对于步骤1)和步骤2)获得的离心沉淀物，采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit提取其中的总DNA，按说明书要求操作，用于下面的PCR扩增。
[0093] 4)PCR反应体系采用本发明的试剂盒中的PCR Premix，然后加入下列成分 上游引物（ΙΟ μΜ) 2μ1 下游引物（ΙΟμΜ) 2μ1
[0094] DNA 模板 ΙμL 双蒸水 47μ1 总体积 50μ1
[0095] 以上各组分混匀后，闪离2s，使液体集中于管底。扩增条件为:94°C2min，接着32个 循环：94°C30s，63°C30s，72°C60s，最后 72°C 延伸 lOmin。
[0096] 5)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的分析及结果判断。
[0097] PCR产物用1.5% (W/V)琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外 分析仪下观察，发现有的样品所对应的泳道中有DNA条带出现。其大小根据分子量标准判断 为862bp，说明所对应的样品中有ST251型致病性气单胞菌存在。阳性和阴性对照样品都呈 现出预期的结果（图5)。也就是说没有出现假阳性和假阴性结果，检测结果可信。此外，3次 重复试验都获得了相同的结果，说明方法的重现性好。
【主权项】
1. 一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒，该试剂盒含有：a) PCR premix : - 种冻干的PCR预混合物，包含高保真DNA聚合酶、dNTPs、MgC12、反应缓冲液、PCR反应增强剂 和稳定剂;b)引物对;c)标准阳性DNA模板;d)标准阴性DNA模板;e)灭菌双蒸水;其特征 在于：上游引物序列为5 ' -GCGGCGTAAGCGGATTTGTAGC-3 '，下游引物序列为5 ' -CCGGTCGGATTGGTCAGGTTCAT-3'，退火温度为63°C，扩增产物大小为826bp，标准阳性DNA模 板为ST251型嗜水气单胞菌XS91-4-1株的基因组DNA提取物，DNA浓度为500ngAU;阴性DNA 模板为维氏气单胞菌IB340株的基因组提取物，DNA浓度为500ngAU。2. 权利要求1所述的一种检测ST251型嗜水气单胞菌的PCR试剂盒在制备治疗或预防淡 水养殖鱼类暴发病药物中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK105969907SQ201610604290
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】李爱华, 刘天强, 彭波, 张倩倩
【申请人】中国科学院水生生物研究所