Ctnnb1第三外显子突变检测引物探针及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种CTNNB1第三外显子突变检测引物探针包括检测引物探针组A、检测引物探针组B和检测引物探针组C；检测引物探针组A包括检测32密码子GAC>CAC突变、33密码子TCT>TGT突变、33密码子TCT>GCT突变的上游引物和探针，以及通用下游引物；检测引物探针组B包括检测34密码子GGA>GAA突变、34密码子GGA>GTA突变、35密码子ATC>AGC突变的上游引物和探针，以及通用下游引物；检测引物探针组C包括检测37密码子TCT>TAT突变、37密码子TCT>TTT突变、45密码子TCT>CCT突变的上游引物和探针，以及通用下游引物；本发明还涉及一种采用上述引物探针的试剂盒。本发明的CTNNB1第三外显子突变检测引物探针及其试剂盒使用便捷，灵敏度高，准确率高。
【专利说明】
CTNNB1第三外显子突变检测引物探针及其试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] β-Catenin是介导细胞黏附和信号传导双重活性的细胞质内可溶性蛋白，基因 CTNNB1位于3p22,全长23.2kb，CTNNBl基因（β连环蛋白的编码基因）在WNT信号传导通路的 重要的角色。CTNNB1基因编码序列由三个转录本，CTNNB1基因第三外显子发生突变，与细胞 核内的TCF/LEF蛋白结合形成蛋白复合物，这种蛋白复合物能够与DNA结合，启动其他与肿 瘤相关的基因（如c_myc、cyclin D1)的转录，导致一系列的连锁反应，最终导致细胞分裂加 速。CTNNB1基因调控上皮细胞的生成和维持，W在肿瘤的进展中起重要作用，高表达与0S的 降低密切相关。研究发现CTNNB1基因的突变是子宫内膜癌、肝癌、髓母细胞瘤(MDB)、等肿瘤 的原因。
[0003] 美国MD Anderson癌症中心的研究人员发现，对于患有典型的低级别早期子宫内 膜癌女性患者，CTNNB1基因外显子3突变的预后较差，（J Natl Cancer Inst.2014,106: dju245)。临床上早已发现，部分子宫内膜癌患者在初次手术治疗后容易复发并因此死亡。 过去临床上辨识这些患者，现在就可以通过检测CTNNB1基因突变来筛选这些预后较差的患 者。一旦低级别、早期子宫内膜癌患者被检测出具有CTNNB1基因突变，妇瘤科医生可采取除 传统子宫切除外更激进的治疗策略。
[0004] 肝细胞癌(HCC)是男性五分之四最常见的癌症和癌症相关死亡世界第二最常见的 原因，一些研究表明β连环蛋白突变的肝癌具有关键作用，CTNNB1突变可以与增加谷氨酰胺 合成的水平，与肿瘤的增大存在相关性，并且在肝癌患的不同肿瘤区域发现不同突变状态 CTNNBUCieply.B发现肝癌患者CTNNB1突变主要发生在该基因的第三外显子内，第三外显 子编码的蛋白一般是磷酸化的氨基酸序列，发生CTNNB1基因的第三外显子突变患者的β连 环蛋白的表达水平表达较高。（B.Cieply,Hepatology ,49(2009)，ρρ· 821-831)
[0005] 髓母细胞瘤是恶性小儿脑肿瘤的最常见的类型，Wnt信号通路在这个类型的肿瘤 被激活，Si 1 va Rd对髓母细胞瘤病例进行了分析β连环蛋白基因（CTNNB1)的突变分析，结果 发现六分之一的患者CTNNB1基因第三外显子发生了突变，这些突变改变糖原合酶激酶3β磷 酸化位点，随后在细胞核积累，促纤维增生和结节神经管细胞瘤的变体（Clinics(Sao Paulo).2013;68(2):167-72)。
[0006] 目前CTNNB1基因突变检测主要是测序法，对于临床工作者来说耗时、易污染、程序 繁琐。
【发明内容】
[0007] 本发明公开了一种检测快速方便，灵敏度高，准确率高的CTNNB1第三外显子突变 检测试剂盒，以及其检测引物探针。
[0008] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种CTNNB1第三外显子突变 检测引物探针，包括检测引物探针组A、检测引物探针组B和检测引物探针组C;
[0009] 所述检测引物探针组A包括用于检测CTNNB1基因第三外显子32密码子GAOCAC突 变的上游引物a和探针a，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>TGT突变的上游引 物b和探针b，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>GCT突变的上游引物c和探针c， 以及通用下游引物；
[0010] 所述检测引物探针组B包括用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GAA突 变的上游引物d和探针d，用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GTA突变的上游引 物e和探针e，用于检测CTNNB1基因第三外显子35密码子ATOAGC突变的上游引物f和探针f， 以及通用下游引物；
[0011] 所述检测引物探针组C包括用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TAT突 变的上游引物g和探针g，用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TTT突变的上游引 物h和探针h，用于检测CTNNB1基因第三外显子45密码子TCT>CCT突变的上游引物i和探针i， 以及通用下游引物；
[0012] 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示;所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述探针b的核苷酸序列 如SEQ ID No. 16所示;所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针c的核苷 酸序列如SEQ ID No. 17所示;所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探针d 的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示;所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所 述探针e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示;所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，所述探针f的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探针g的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示;所述上游引物h的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示，所述探针h的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;所述上游引物i的核苷 酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探针i的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示;所述通用下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0013] 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团；所述所述探针d、 探针e和探针f的5'端设有相互区别的报告荧光基团；所述探针g、探针h和探针i的5'端设有 相互区别的报告荧光基团；所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f、探针g、探针h和 探针i的3 '端设有淬灭荧光基团。
[0014] 各上游引物在PCR反应中的终浓度是0.19μΜ/1，各探针在PCR反应中的终浓度是 0.16μΜ/1，所述通用下游引物在PCR反应中的终浓度是0.27μΜ/1。
[0015] 上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三种是Cy5或R0X;所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。
[0016] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种采用上述的引物探针的 CTNNB1第三外显子突变检测产品。
[0017] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种CTNNB1第三外显子突变 检测试剂盒，包括突变检测液A、突变检测液B和突变检测液C;
[0018] 所述突变检测液A中包括检测引物探针组A，所述突变检测液B中包括检测引物探 针组B，所述突变检测液C中包括检测引物探针组C;
[0019] 所述检测引物探针组A包括用于检测CTNNB1基因第三外显子32密码子GAOCAC突 变的上游引物a和探针a，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>TGT突变的上游引 物b和探针b，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>GCT突变的上游引物c和探针c， 以及通用下游引物；
[0020] 所述检测引物探针组B包括用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GAA突 变的上游引物d和探针d，用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GTA突变的上游引 物e和探针e，用于检测CTNNB1基因第三外显子35密码子ATOAGC突变的上游引物f和探针f， 以及通用下游引物；
[0021] 所述检测引物探针组C包括用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TAT突 变的上游引物g和探针g，用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TTT突变的上游引 物h和探针h，用于检测CTNNB1基因第三外显子45密码子TCT>CCT突变的上游引物i和探针i， 以及通用下游引物；
[0022]所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示;所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述探针b的核苷酸序列 如SEQ ID No. 16所示;所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针c的核苷 酸序列如SEQ ID No. 17所示;所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探针d 的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示;所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所 述探针e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示;所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，所述探针f的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探针g的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示;所述上游引物h的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示，所述探针h的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;所述上游引物i的核苷 酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探针i的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示;所述通用下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0023] 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团；所述所述探针d、 探针e和探针f的5'端设有相互区别的报告荧光基团；所述探针g、探针h和探针i的5'端设有 相互区别的报告荧光基团；所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f、探针g、探针h和 探针i的3 '端设有淬灭荧光基团。
[0024] 各上游引物在PCR反应中的终浓度是0.19μΜ/1，各探针在PCR反应中的终浓度是 0.16μΜ/1，所述通用下游引物在PCR反应中的终浓度是0.27μΜ/1。
[0025] 上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三种是Cy5或R0X;所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。
[0026] 各突变检测液中还包括内标引物探针混合液、10 XPCR缓冲液、dNTPs混合液和灭 菌超纯水;所述PCR缓冲液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2;所述dNTPs试 剂包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP;
[0027]所述内标引物探针混合液包括内标基因上游引物、内标基因下游引物和内标基因 探针；
[0028] 所述内标基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，所述内标基因下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，所述内标基因探针的核苷酸序列如SEQ ID No.24所 不。
[0029] 上述CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒还包括质控检测试剂、热启动taq酶、阳性 对照液和阴性对照液；
[0030] 所述质控检测试剂包括质控基因上游引物、质控基因下游引物和质控基因探针；
[0031] 所述质控基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述质控基因下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，所述质控基因探针的核苷酸序列如SEQ ID No.25所 不。
[0032]上述CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒反应时，反应体系中包括十倍浓度的PCR 缓冲液1体积，2.5mM的dNTPs混合液1体积，0.5υ/μ1的热启动taq酶1体积，检测引物探针组1 体积，内标引物探针混合液1体积，灭菌超纯水4体积，DNA模板1体积;所述DNA模板的使用浓 度为 10~50ng/yl。
[0033]本发明具有积极的效果:本发明的CTNNB1基因第三外显子突变检测产品是一个便 利而直接的工具，利用扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System， ARMS)衍生的系列技术，采用三组三重PCR反应检测CTNNB1基因9个突变热点。具有高通量、 低成本的特点，可用于组织、血样中微量突变检测，操作简便快捷，灵敏度高，适合大规模的 临床应用。CTNNB1基因突变与人肿瘤的发生有重要意义，对于CTNNB1突变的检测可准确预 测对应靶向药物治疗的有效性，便于临床用药的选择，显著性提高治疗效果，是患者最大程 度收益，同时还可以避免不合理地用药造成病人医药费复旦及社会医疗资源浪费，减少不 必要的实效损失以及经济损失。
【附图说明】
[0034]图1是采用实施例1的试剂盒检测样本1的32密码子GAOCAC的扩增曲线；
[0035]图2是采用实施例1的试剂盒检测样本1的33密码子TCT>TGT的扩增曲线；
[0036]图3是采用实施例1的试剂盒检测样本1的33密码子TCT>GCT的扩增曲线；
[0037]图4是采用实施例1的试剂盒检测样本1的34密码子GGA>GAA的扩增曲线；
[0038] 图5是采用实施例1的试剂盒检测样本1的34密码子GGA>GTA的扩增曲线；
[0039] 图6是采用实施例1的试剂盒检测样本1的35密码子ATOAGC的扩增曲线；
[0040] 图7是采用实施例1的试剂盒检测样本1的37密码子TCT>TTT的扩增曲线；
[00411图8是采用实施例1的试剂盒检测样本1的37密码子TCT>TAT的扩增曲线；
[0042]图9是采用实施例1的试剂盒检测样本1的45密码子TCT>CCT的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0043]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意 表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实 验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所 有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或 均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0044] 实施例1
[0045] -、试剂盒的组成。
[0046] 本实施例的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒是针对CTNNB1第三外显子如表1所 示的9种突变类型设计的。
[0047] 表1CTNNB1第三外显子检测位点
[0049] 其中，CTNNB1的第33密码子、第34密码子、第37密码子均有两种突变情况。
[0050]本实施例的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒包括:检测引物探针组A、检测引物 探针组B、检测引物探针组C、10XPCR缓冲液、dNTPs混合液、质控检测试剂、内标引物探针混 合液、阳性对照样品、阴性对照样品、热启动taq酶和灭菌超纯水。其中，各检测引物探针组 分别与内标引物探针混合液、10 X PCR缓冲液、dNTPs混合液和灭菌超纯水分装在一起，成为 对应的突变检测试剂。
[0051]各试剂的成分如表2所示。
[0052]表2试剂盒的组成
[0054] 各个试剂原料的来源如表3所示。
[0055] 表3试剂原料来源
[0057] 上述表中试剂盒说明如下：
[0058]将引物浓度做倍比连续稀释，验证的引物(除通用下游引物)最佳使用浓度是1.9μ Μ/1，在反应体系中的最终浓度是0.19μΜ/1;通用下游引物最佳使用浓度是2.7μΜ/1，在反应 体系中的最终浓度是〇.27μΜ/1;探针倍比连续稀释，验证的探针最佳浓度是1.6μΜ/1，在反 应体系中的最终浓度是〇. 16μΜ/1。
[0059] 突变检测试剂Α中包括检测32密码子GAOCAC突变的特异性上游引物a和探针a、检 测33密码子TCT>TGT突变的特异性上游引物b和探针b、检测33密码子TCT>GCT突变的特异性 上游引物c和探针c、通用下游引物、内标基因引物对、内标基因探针、10 X缓冲液、dNTPs混 合液和灭菌超纯水。
[0060] 突变检测试剂B中包括检测34密码子GGA>GAA突变的特异性上游引物d和探针d、检 测34密码子GGA>GTA突变的特异性上游引物e和探针e、检测35密码子ATOAGC突变的特异性 上游引物f和探针f、通用下游引物、内标基因引物对、内标基因探针、10 X缓冲液、dNTPs混 合液和灭菌超纯水。
[0061 ]突变检测试剂C中包括检测37密码子TCT>TAT突变的特异性上游引物g和探针g、检 测37密码子TCT>TTT突变的特异性上游引物h和探针h、检测45密码子TCT>CCT突变的特异性 上游引物i和探针i、通用下游引物、内标基因引物对、内标基因探针、10 X缓冲液、dNTPs混 合液和灭菌超纯水。
[0062] 10XPCR缓冲液包括 100mM的Tris-HCl、500mM的KC1 和 15mM的MgCl2,用于配置PCR 缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3。(1阶？8混合液包括(^了？、(^?、(1(^和(11^，在反应 体系中终浓度各为0.25mM。
[0063] 热启动taq酶由Takara公司提供的Hot Start taq酶稀释而成，稀释后的浓度为 0 · 5UAU。10 X PCR缓冲液、热启动taq酶和dNTPs均来自Takara(货号:R007A)。
[0064]质控检测试剂包括检测CTNNB1第三外显子保守序列的质控基因引物、质控基因探 针、内标基因引物、内标基因探针、10 X缓冲液、dNTPs混合液、灭菌超纯水。质控基因引物使 用浓度为〇. 19μΜ/1;质控基因探针使用浓度为0.16μΜ/1，内标基因引物使用浓度为0.19μΜ/ 1，内标基因探针使用浓度为0.16μΜ/1。
[0065] 体积为10μ1的突变检测反应体系包括ΙμL的10 X缓冲液、ΙμL的热启动taq酶 (0.5υ/μ1)、ΙμL的dNTPs混合液(2.5mM)、ΙμL的检测引物探针混合液、ΙμL的内标引物探针混 合液、4μ1的灭菌超纯水、ΙμL的DNA模板。
[0066] 体积为10μ1的质控检测反应体系包括ΙμL的10 X缓冲液、ΙμL的热启动taq酶 (0.5UAU)、ΙμL的dNTPs反应液(2.5mM)、ΙμL的质控引物探针混合液、ΙμL内标引物探针混合 液、4μ1的灭菌超纯水、ΙμL的DNA模板。10 X缓冲液、dNTPs混合液、质控引物探针混合液、内 标引物探针混合液和灭菌超纯水分装在一起成为质控检测试剂。
[0067]阳性对照样品是分别存在以上CTNNB1基因第三外显子9种突变类型、内标基因、质 控基因的重组基因组质粒载体，质粒载体的空载体为PMD19-T载体。突变型质粒的获取常规 构建步骤:用上述的特异性引物与通用下游引物配对，扩增含相应突变点样本的目的片段 产物，构建入pMD 19-T载体;质控和内标基因质粒用上述的质控和内标引物扩增出所需目的 片段，将目的片段克隆到PMD19-T载体中。克隆的载体寄给上海迈浦生物科技有限公司，由 该公司提供重组质粒载体。
[0068] 阴性对照相应含有CTNNB1基因9个突变位点野生型目的片段序列的重组质粒载体 稀释而成，稀释液是灭菌超纯水。
[0069] 各探针和引物序列均由上海百力格生物技术有限公司合成，引物和探针均用灭菌 超纯水溶解，并稀释成工作液。各探针和引物的特征如表4所示。
[0070] 表4探针引物特征表
[0073]针对各突变检测位点的特异性上游引物序列如SEQ NO. 1~SEQ N0.9所示。特异性 ARMS上游引物分别在3'末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，同时在其3'末端倒数第 2~3位增加一个或者两个碱基错配，增加突变检测的特异性。
[0074] 通用下游引物序列如SEQ N0.10所示，通用下游引物可用于所有突变检测的下游 引物。
[0075] 特异性探针TaqMan探针序列如SEQN0.15~SEQN0.23所示，为避免假阳性，特异 性探针3'末端碱基与待检测突变型的突变碱基互补，而且特异性探针与特异性引物相互重 叠，且重叠碱基长度为3~5bp，且为了减少反应管数，节约样本。同一管检测试剂中的三个 探针的5 '端分别标记了 FAM、HEX、R0X不同的荧光报告基团，3 '端则都标记了 BHQ1荧光淬灭 基团；
[0076]内标基因上游引物序列如SEQ N0.11所示，内标基因下游引物序列如SEQ N0.12所 不，内标基因探针序列如SEQ N0.24所不。内标基因探针的5端标记了VIC9?光报告基团，内 标基因探针的3 '端标记了 BHQ1荧光淬灭基团。内标基因是区别于CTNNB1的看家基因 ACTB， 通过检测内标基因的扩增(VIC通道），可分析待测DNA是否被正常扩增，从而排除漏加试剂 或者样本含有PCR抑制剂等原因造成的PCR检测失败。
[0077]质控基因是CTNNB1基因，质控基因上游引物序列如SEQ N0.13所示，质控基因下游 引物序列如SEQ N0.14所示，质控基因探针序列如SEQ N0.25所示。质控基因探针的5'端标 记了FAM荧光报告基团，质控基因探针的3'端则标记了BHQ1荧光淬灭基团。质控基因的引物 设计是排除CTNNB1基因第三外显子的序列的CTNNB1基因其他位置保守区域，质控引物探针 不享受突变检测位点引物和引物结合位点，在保守区域不同区段设计三条探针，分别标记 不同的荧光信号，质控序列扩增可校正诸如DNA含量、标本内PCR聚合酶抑制物，不同反应管 间扩增效率的差异，通过比较突变检测试剂和质控检测试剂的扩增情况确定样本是否发生 突变。
[0078]二、试剂盒的使用方法。
[0079]本实施例的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒的具体检测步骤如下：
[0080] 1、样本DNA提取：
[0081 ]米用试剂盒(Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取肿瘤样本的 DNA作为样本DNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0082] 2、样本DNA质量检测：
[0083] 获得样本DNA后，通过Thermo-Fisher核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000)测定浓度 和纯度，控制样本质量，最终加入反应体系中的样本。0D260/0D280的比值在1.8~2.0之间 的可获得最优反应结果，浓度稀释为10~50ngAU。
[0084] 3、PCR 反应：
[0085] 采用本实施例的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒进行检测，以样本反应体系的 体积为1〇μ1，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度详见表3(反应体系的体积 还可以是20μ1，在配制时将10μ1反应体系中的组分翻倍即可）。
[0086] 1)配制10μ 1的质控PCR反应体系和10μ 1的检测PCR反应体系：
[0087] 取8μ1的质控检测试剂和ΙμL热启动taq酶稀释液于PCR管中，加入DNA模板lyl(DNA 模板的使用浓度为1 〇~50ng/y 1)。
[0088] 分别取8μ1的突变检测试剂A或B或C和ΙμL的热启动taq酶稀释液于PCR管中，加入 DNA模板1 μ 1 (DNA模板的使用浓度为10~50ngAi 1)。
[0089]反应体系中的DNA模板分别指对应的样本DNA，阳性对照，阴性对照。
[0090] 2)PCR反应程序。
[0091]各反应体系在安捷伦实时荧光定量PCR扩增仪(MxPro)上进行实时荧光PCR反应， 最优反应程序如表5所示。
[0092] 表5 PCR反应程序
[0094] 4、PCR结果判定。
[0095] 1)试剂盒有效性的判定。
[0096]阳性对照有效：阳性对照FAM、HEX、R0X信号通道所有的扩增曲线有明显的指数增 长期，且Ct阳性<30。
[0097]阴性对照有效：阴性对照FAM、HEX、R0X信号通道所有的扩增曲线无明显的指数增 长期，或Ct阴性多38。
[0098]内标基因有效:除阴性对照外，所有的反应孔VIC信号通道均有扩增曲线，且扩增 曲线有明显的指数增长期，CT值<22。
[0099] 2)检测样本有效性的判定。
[0100] 根据质控FAM通道的CT值进行判定：
[0101] 若Ct质控<20,则样本基因组加入过量，建议稀释后重新检测；
[0102]若20<Ct质控<26,样本加入量适中，适合进行结果判定；
[0103]若Ct质控>26,则样本基因组加入量低，不能稳定的进行突变结果判定。
[0104] 3)突变结果的判定。
[0105] 通过以上步骤，确定检测样本、阳性对照、阴性对照和内标基因检测均有效的前提 下，再对样本的结果进行判定。样本判断结果如表6所示
[0106] 表6突变情况判断表
[0108]根据公式Act值=ct(样板(姐)-(^(厨飯)姐)，计算有效检测样本的Act值。按照以下 步骤对样本检测结果进行判读，确定样本是否存在突变。
[0109] A·阴性情况
[0110] 1)若CtGAC>CAC(FAM通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32，则判定该样本32密码子GAOCAC位点为阴性(野生型）；若CtCAC> CAC(FAM通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且彡32，但是ACt > 8.6，则该样本32密码子GAOCAC位点也为 阴性(野生型）。
[0111] 2)若CtTCT>TGT(HEX通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32,则判定该样本33密码子TCT>TGT位点为阴性(野生型）；若CtTCT> TGT(HEX通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且<32，但是ACt > 10，则该样本33密码子TCT>TGT位点也为 阴性(野生型）。
[0112] 3)若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32,则判定该样本33密码子TCT>GCT位点为阴性(野生型）；若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且彡32，但是ACt > 10，则该样本33密码子TCT>GCT位点也为 阴性(野生型）。
[0113] 4)若CtGGA>GM(FAM通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32，则判定该样本34密码子GGA>GAA位点为阴性(野生型）；若CtCCA>CAA(FAM通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且<32,但是ACt>9,则该样本34密码子GGA>GAA位点也为阴 性(野生型）。
[0114] 5)若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32，则判定该样本34密码子GGA>GTA位点为阴性(野生型）；若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是ACt>9,则该样本34密码子GGA>GTA位点也为阴 性(野生型）。
[0115] 6)若CtATC>AGC(R0X通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32，则判定该样本35密码子ATOAGC位点为阴性(野生型）；若CtATC>AGC(ROX通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且彡32，但是ACt > 8.6，则该样本35密码子ATOAGC位点也为 阴性(野生型）。
[0116] 7)若CtTCT>m(FAM通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32,则判定该样本37密码子TCT>TTT位点为阴性(野生型）；若CtTCT>TTT(FAM通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且<32，但是ACt > 10，则该样本37密码子TCT>TTT位点也为 阴性(野生型）。
[0117] 8)若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32,则判定该样本37密码子TCT>TAT位点为阴性(野生型）；若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且<32，但是ACt > 10，则该样本37密码子TCT>TAT位点也为 阴性(野生型）。
[0118] 9)若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的扩增曲线无明显的指数增长期(无 Ct值)或者Ct> 32,则判定该样本45密码子TCT>CCT位点为阴性(野生型）；若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的扩 增曲线有明显的指数增长期，且<32，但是ACt >9，则该样本45密码子TCTXXT位点也为阴 性(野生型）。
[0119] B.阳性情况
[0120] 1)若CtGAC>CAC(FAM通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct彡8.6，则该样本32密码子GAOCAC位点为阳性(突变型）。
[0121] 2)若CtTCT>TGT(HEX通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct彡10,则该样本33密码子TCT>TGT位点为阳性(突变型）。
[0122] 3)若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct< 10，则该样本33密码子TCT>GCT位点为阳性(突变型）。
[0123] 4)若CtGGA>GAA(FAM通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct<9，则该样本34密码子GGA>GAA位点为阳性(突变型）。
[0124] 5)若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct彡9，则该样本34密码子GGA>GTA位点为阳性(突变型）。
[0125] 6);若CtATC>AGC(R0X通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct彡8.6，则该样本35密码子ATOAGC位点为阳性(突变型）。
[0126] 7)若CtTCT>m(FAM通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct< 10，则该样本37密码子TCT>TTT位点为阳性(突变型）。
[0127] 8)若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct彡10,则该样本37密码子TCT>TAT位点为阳性(突变型）。
[0128] 9)若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的扩增曲线有明显的指数增长期，且彡32,但是Λ Ct<9,则该样本45密码子TCT>CCT位点为阳性(突变型）。
[0129] 三、试剂盒的特性。
[0130] 特异性和灵敏度:检测分别含10%、5%、1%的CTNNB1基因9个突变位点的突变基 因组DNA(突变百分比=突变型/野生型X 100%)，敏感度达到1 %，与临床检测突变"金标 准"Sanger测序法的结果符合率彡96.2%，批内CV和批间CV均小于3%。
[0131] 四、应用示例
[0132] 构建含有CTNNB1第三外显子32密码子GAC>CAC突变、33密码子TCT>TGT突变、34密 码子GGA>GAA突变、35密码子ATOAGC突变、37密码子TCT>TAT突变、45密码子TCTXXT突变6 种突变类型的重组基因组质粒载体作为样本1。采用本实施例的CTNNB1第三外显子突变检 测试剂盒对样本1进行检测，扩增结果如图1至9所示。可见，32密码子GAOCAC突变、33密码 子TCT>TGT突变、34密码子GGA>GAA突变、35密码子ATOAGC突变、37密码子TCT>TAT突变、45 密码子TCTXXT突变的检测结果为阳性，33密码子TCT>GCT、34密码子34密码子、37密码子 TCT>TTT检测结果为阴性。证明了试剂盒的有效性。
[0133] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发 明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种CTNNB1第三外显子突变检测引物探针，其特征在于：包括检测引物探针组A、检 测引物探针组B和检测引物探针组C; 所述检测引物探针组A包括用于检测CTNNB1基因第三外显子32密码子GAOCAC突变的 上游引物a和探针a，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>TGT突变的上游引物b和 探针b，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>GCT突变的上游引物c和探针c，以及 通用下游引物； 所述检测引物探针组B包括用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GAA突变的 上游引物d和探针d，用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GTA突变的上游引物e和 探针e，用于检测CTNNB1基因第三外显子35密码子ATOAGC突变的上游引物f和探针f，以及 通用下游引物； 所述检测引物探针组C包括用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TAT突变的 上游引物g和探针g，用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TTT突变的上游引物h和 探针h，用于检测CTNNB1基因第三外显子45密码子TCTXXT突变的上游引物i和探针i，以及 通用下游引物； 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示； 所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探针d的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探针e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示； 所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述探针f的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示； 所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探针g的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示； 所述上游引物h的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探针h的核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示； 所述上游引物i的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探针i的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团；所述所述探针d、探针 e和探针f的5'端设有相互区别的报告荧光基团;所述探针g、探针h和探针i的5'端设有相互 区别的报告焚光基团;所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f、探针g、探针h和探针i 的3'端设有淬灭荧光基团。2. 根据权利要求1所述的CTNNB1第三外显子突变检测引物探针，其特征在于:各上游引 物在PCR反应中的终浓度是0.19μΜ/1，各探针在PCR反应中的终浓度是0.16μΜ/1，所述通用 下游引物在PCR反应中的终浓度是0.27μΜ/1。3. 根据权利要求1所述的CTNNB1第三外显子突变检测引物探针，其特征在于:所述相互 区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3,第三种是Cy5或 ROX;所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。4. 一种采用如权利要求1所述的引物探针的CTNNB1第三外显子突变检测产品。5. -种CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒，其特征在于：包括突变检测液A、突变检测 液B和突变检测液C; 所述突变检测液A中包括检测引物探针组A，所述突变检测液B中包括检测引物探针组 B，所述突变检测液C中包括检测引物探针组C; 所述检测引物探针组A包括用于检测CTNNB1基因第三外显子32密码子GAOCAC突变的 上游引物a和探针a，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>TGT突变的上游引物b和 探针b，用于检测CTNNB1基因第三外显子33密码子TCT>GCT突变的上游引物c和探针c，以及 通用下游引物； 所述检测引物探针组B包括用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GAA突变的 上游引物d和探针d，用于检测CTNNB1基因第三外显子34密码子GGA>GTA突变的上游引物e和 探针e，用于检测CTNNB1基因第三外显子35密码子ATOAGC突变的上游引物f和探针f，以及 通用下游引物； 所述检测引物探针组C包括用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TAT突变的 上游引物g和探针g，用于检测CTNNB1基因第三外显子37密码子TCT>TTT突变的上游引物h和 探针h，用于检测CTNNB1基因第三外显子45密码子TCTXXT突变的上游引物i和探针i，以及 通用下游引物； 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示； 所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探针d的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探针e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示； 所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述探针f的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示； 所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探针g的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示； 所述上游引物h的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探针h的核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示； 所述上游引物i的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探针i的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团；所述所述探针d、探针 e和探针f的5'端设有相互区别的报告荧光基团;所述探针g、探针h和探针i的5'端设有相互 区别的报告焚光基团;所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f、探针g、探针h和探针i 的3'端设有淬灭荧光基团。6. 根据权利要求5所述的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒，其特征在于:各上游引物 在PCR反应中的终浓度是0.19μΜ/1，各探针在PCR反应中的终浓度是0.16 μΜ/l，所述通用下 游引物在PCR反应中的终浓度是0.27μΜ/1。7. 根据权利要求5所述的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒，其特征在于:所述相互区 别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3,第三种是Cy5或 R0X;所述淬灭荧光基团是BHQ1或MGB。8. 根据权利要求4至7中任一项所述的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒，其特征在 于:各突变检测液中还包括内标引物探针混合液、10 X PCR缓冲液、dNTPs混合液和灭菌超纯 水;所述PCR缓冲液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl 2;所述dNTPs试剂包括 dATP、dGTP、dCTP和dTTP; 所述内标引物探针混合液包括内标基因上游引物、内标基因下游引物和内标基因探 针； 所述内标基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，所述内标基因下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，所述内标基因探针的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。9. 根据权利要求4至7中任一项所述的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒，其特征在 于:还包括质控检测试剂、热启动taq酶、阳性对照液和阴性对照液； 所述质控检测试剂包括质控基因上游引物、质控基因下游引物和质控基因探针； 所述质控基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示，所述质控基因下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，所述质控基因探针的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示。10. 根据权利要求9所述的CTNNB1第三外显子突变检测试剂盒，其特征在于:反应时，反 应体系中包括十倍浓度的PCR缓冲液1体积，2.5mM的dNTPs混合液1体积，0.5UAU的热启动 taq酶1体积，检测引物探针组1体积，内标引物探针混合液1体积，灭菌超纯水4体积，DNA模 板1体积;所述DNA模板的使用浓度为10~50ng/y 1。
【文档编号】C12Q1/68GK105969908SQ201610608948
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】赵新泰, 王明
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司