一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量pcr引物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物，利用鸭圆环病毒基因型（基因1型和基因2型）复制相关蛋白（Rep）基因编码区特征性核苷酸GC含量差异来设计。利用本组引物对对鸭圆环病毒基因型进行实时荧光定量PCR反应均可有效扩增，但其在鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR反应后生成的溶解曲线存在温度差异（Tm值差异）来对鸭圆环病毒的基因型进行有效区分。配合和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑并利用仪器自带的分析软件，可达到仅需一组引物，即可特异性的对不同基因型（基因1型和基因2型）鸭圆环病毒感染情况进行鉴别诊断。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。
【专利说明】
一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物
技术领域
[0001]本发明属于动物分子病原学领域，具体涉及一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物。【背景技术】
[0002]鸭感染圆环病毒(duck circovirus，DuCV)最早由德国学者Hattermann等2003年首次报道。鸭圆环病毒国内最早傅光华等报道(DuCV-MH25株，GenBank号EF451157)。随后国内多家单位对鸭感染鸭圆环病毒研究发现，鸭群感染圆环病毒见有以生长不良、羽毛紊乱、 体况消瘦等临床表征，多品种鸭群均建有感染报道(番鸭、半番鸭感染率稍高)，并表现出和鸭群其他常见病原的混合感染和多重感染现象。
[0003]通过对国内外的鸭圆环病毒分离株的基因组序列进行分析发现，鸭圆环病毒可以被分为不同的基因型和基因亚型。目前，比较公认的是可将鸭圆环病毒分为2个大的基因型:基因1型(DuCV-1)和基因2型(DuCV-2)。本发明公开了一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物的方法，即是用于在鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)的鉴别诊断研究。当前，已经见有鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)的PCR鉴别诊断方法，该方法使用2组引物对(4条引物)(Li Z, Wang X，Zhang R, et al.Evidence of possible vertical transmiss1n of duck circovirus.Vet Microb1l.2014, 174(1-2):229-232.)〇
[0004]本发明的一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物仅需1组引物对(2 条引物)即可有效对鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)进行有效区分。该引物的设计鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)复制相关蛋白(Rep)基因编码区特征性核苷酸GC含量差异来设计，利用实时荧光定量PCR反应后生成的溶解曲线的Tm值和核苷酸GC含量正相关的特点，通过观察鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)经改组引物进行实时荧光定量 PCR扩增反应后的Tm值差异，即可精确对鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)感染情况进行准确鉴别诊断，本发明可填补相关领域空白。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物及其应用，该引物能有效区分基因1型和基因2型鸭圆环病毒感染(或共感染)，为鸭群健康养殖提供技术保证。
[0006]本发明根据鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)复制相关蛋白(Rep)基因编码区特征性核苷酸GC含量差异来设计一组实时荧光定量PCR引物。该引物针对鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)进行PCR扩增均可得到特异性目的条带，用常规PCR无法对鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)感染情况进行鉴别诊断，但在该扩增区域鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)存在核苷酸GC含量差异，通过建立基于Eva Green实时荧光定量PCR方法对鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)实时荧光定量扩增反应后的生成的溶解曲线存在不同的特异峰值(Tm值)，根据溶解曲线Tm值差异可直接对鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)感染情况进行可视化鉴别诊断观察。
[0007]本发明采用以下技术方案:一组用于可视化检测的实时荧光定量PCR引物，所述实时荧光定量PCR引物F1和R1的序列为:上游引物 Fl:5’_ CACGCTCGACAATTGCAAGTT -3’，下游引物 Rl:5’_ CAGATCCCCGGGCACGAGA -3'
[0008]通过所述引物建立基于Eva Green实时荧光定量PCR方法，根据利用该引物扩增的鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)复制相关蛋白(Rep)基因编码区特征性核苷酸GC含量差异导致实时荧光定量扩增反应后的生成的溶解曲线存在不同的特异峰值(Tm值)，可直接对鸭圆环病毒(基因1型和基因2型)感染进行鉴别。
[0009]具体包括以下步骤:(1)提取基因1型鸭圆环病毒(DuCV-1)(鸭圆环病毒MH25株，GenBank号EF451157 )和基因2型(DuCV-2)鸭圆环病毒(鸭圆环病毒FQ312株，GenBank号GQ423745)基因组DNA。利用针对基因1型和基因2型鸭圆环病毒复制相关蛋白(Rep)基因编码区的引物(RepF: 5’-CAATGGCGAAGAGCGGCAACTACT -3’和RepR: 5’- AGCTGCCCAAGTGTITAATCCCT -3’)对其进行特异性PCR扩增，将PCR扩增的目的片段进行胶回收后克隆到T载体上，获得含有基因1型和基因2型鸭圆环病毒复制相关蛋白(Rep)基因编码区的阳性重组质粒(T-DuCV-1和T-DuCV-2)，测定其0D值后，做为实时荧光定量PCR方法的标准品。
[0010](2)用所述实时荧光定量引物F1和R2对基因1型和基因2型鸭圆环病毒复制相关蛋白(Rep)基因编码区的阳性重组质粒(T-DuCV-1和T-DuCV-2)进行Eva Green实时荧光定量 PCR扩增，反应完成后获得相应的扩增曲线并生成Eva Green实时荧光定量PCR扩增的溶解曲线；(3)实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察扩增曲线判断鸭圆环病毒感染情况;通过观察溶解曲线可对DuCV-1和DuCV-2根据其Tm值差异进行鉴别。
[0011]所述PCR引物在检测不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)感染情况方面的应用。[0〇12]其中，设计的实时荧光定量PCR引物需满足如下要求:(1)、该实时荧光定量PCR产物需选择不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)基因组进行分析后保守的区域设计，以便仅需一组引物能对不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和 DuCV-2)进行扩增，即观察实时荧光定量PCR反应后的扩增曲线即可对鸭圆环病毒感染进行判断(但无法区分基因型)。
[0013](2)、该组引物对不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)的扩增区域存在核苷酸序列存在GC含量差异。基于实时荧光定量PCR反应生成的溶解曲线存在Tm峰值差异，即观察实时荧光定量PCR反应后的溶解曲线即可对不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)感染进行判断(可有效区分DuCV-1和DuCV-2)。[〇〇14]其中，所述的步骤(2)的峰值如下:若在1'111=(90.52±0.08)°(:出现单一的特异性峰判为基因1型鸭圆环病毒(011(^-1)阳性;若在Tm=(88.92±0.13)°C出现单一的特异性峰判为基因2型鸭圆环病毒(DuCV-2)阳性； 其他情况均判为阴性。
[0015]本发明的有益效果:鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期鉴定的2株基因1型鸭圆环病毒和4株基因2型鸭圆环病毒进行检测，均和预期相符。且仅需1组引物对(2条引物)即可有效对鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)进行有效区分。对临床送检的9份生长不良番鸭进行检测后发现，鸭圆环病毒感染的有5株，其中基因1型鸭圆环病毒感染的有1株、基因2型鸭圆环病毒感染的有4株，未检测到临床送检的9份生长不良番鸭存在鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)共感染现象。【附图说明】[〇〇16] 图1特异性实时荧光定量PCR引物对不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)的 PCR扩增;M: DL2000分子量标准；1: DuCV-1; 2: DuCV-2; 3:阴性对照。[〇〇17]图2特异性实时荧光定量PCR引物对不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)进行检测的扩增曲线(DuCV-1和DuCV-2差异仅仅是为了便于观察，如果拷贝数相同，则DuCV-1 和DuCV-2扩增曲线一致。也可作为实验成功的对照，即没有扩增曲线，溶解曲线的检测结果没有意义)。
[0018]图3特异性实时荧光定量PCR引物对不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)进行检测的溶解曲线。【具体实施方式】
[0019]下面实施例对本发明做进一步的描述。
[0020]实施例1 1、毒株:基因1型鸭圆环病毒(DuCV-1)(鸭圆环病毒MH25株，GenBank号EF451157)和基因2型 (DuCV-2)鸭圆环病毒(鸭圆环病毒FQ312株，GenBank号GQ423745)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
[0021]2、引物设计与合成根据不同鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)复制相关蛋白基因编码区特征区域设计实时荧光定量PCR反应的引物F1和R1，其中F1和R1引物序列为:上游引物F1: 5 ’ - CACGCTCGACAATTGCAAGTT -3 ’，下游引物R1:5 ’ - CAGATCCCCGGGCACGAGA -3 ’。[〇〇22]3、实时荧光定量PCR标准品的构建以常规方法提取基因1型鸭圆环病毒(DuCV-1)(鸭圆环病毒MH25株，GenBank号 EF451157)和基因2型(DuCV-2)鸭圆环病毒(鸭圆环病毒FQ312株，GenBank号GQ423745)基因组DNA。利用针对基因1型和基因2型鸭圆环病毒复制相关蛋白(Rep)基因编码区的引物 (RepF: 5’-CAATGGCGAAGAGCGGCAACTACT -3’和RepR: 5’- AGCTGCCCAAGTGTTTAATCCCT -3’)对其进行特异性PCR扩增，将PCR扩增的目的片段进行胶回收后克隆到T载体上，获得含有基因1型和基因2型鸭圆环病毒复制相关蛋白(Rep)基因编码区的阳性重组质粒(T-DuCV-1和T-DuCV-2)，测定其0D值后，做为实时荧光定量PCR方法的标准品。[〇〇23]4、实时荧光定量PCR反应优化出的20 yL最佳反应体系为体系:Eva Green 10此、上、下游引物(10 wnol/L)各0.2此、模板2此、水补足至20此。最佳反应条件为:95 °C，2 min预变性;95 °C 10 s， 64 °C 15 s，共40个循环，循环结束后，做出溶解曲线。[〇〇24]4、实时荧光定量PCR溶解曲线实时荧光定量PCR反应结束后，观察扩增曲线，判断建立的方法有无特异性扩增(没有扩增曲线，溶解曲线的检测结果没有意义)。实时荧光定量PCR反应结束后做出的溶解曲线， 直接在和实时荧光定量PCR仪器连接的电脑上软件进行分析，对不同鸭圆环病毒基因型 (DuCV-1和DuCV-2)感染情况进行判断，判断方法为:若在1'111=(90.52±0.08)°(:出现单一的特异性峰判为基因1型鸭圆环病毒(011(^-1)阳性;若在Tm=(88.92±0.13)°C出现单一的特异性峰判为基因2型鸭圆环病毒(DuCV-2)阳性； 其他情况均判为阴性。[〇〇25]5、临床应用使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期鉴定的2株基因1型鸭圆环病毒和 4株基因2型鸭圆环病毒进行检测，均和预期相符。对临床送检的9份生长不良番鸭进行检测后发现，鸭圆环病毒感染的有5株，其中基因1型鸭圆环病毒感染的有1株、基因2型鸭圆环病毒感染的有4株，未检测到临床送检的9份生长不良番鸭存在鸭圆环病毒两个基因型(DuCV-1和DuCV-2)共感染现象。
[0026]另外，将上述鉴定为基因1型鸭圆环病毒感染的有1株、基因2型鸭圆环病毒感染的有4株的5株鸭圆环病毒，用文献鸭圆环病毒基因型(基因1型和基因2型)的PCR鉴别诊断方法，该方法使用2组引物对(4条引物)(Li Z, Wang X，Zhang R, et al.Evidence of possible vertical transmiss1n of duck circovirus.Vet Microb1l.2014, 174 (1-2): 229-232.)进行检测方法，结果一致，符合率为100%。此外，和文献[姜世金，李志国， 王鑫，张瑞华为发明人申请的国家发明专利一种快速鉴定鸭圆环病毒基因型的双重PCR方法，201410323308.X(已授权)]介绍的方法对的9份生长不良番鸭进行检测后发现，鸭圆环病毒感染的有5株，其中基因1型鸭圆环病毒感染的有1株、基因2型鸭圆环病毒感染的有4 株，未检测到临床送检的9份生长不良番鸭存在鸭圆环病毒两个基因型(DuCV-1和DuCV-2) 共感染现象，结果和本研究建立的方法符合率为100%。
[0027]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物，其特征在于:所述PCR引物序 列为:上游引物F1: 5 ’ - CACGCTCGACAAITGCAAGIT -3 ’，下游引物R1:5 ’ - CAGATCCCCGGGCACGAGA -3 ’。2.如权利要求1所述一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量PCR引物在制备区分 鸭圆环病毒基因型试剂盒上的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的鸭圆环病毒基因型为基因1型和基 因2型。
【文档编号】C12N15/11GK105969914SQ201610591795
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】万春和, 黄瑜, 程龙飞, 傅光华, 施少华, 陈红梅, 傅秋玲, 刘荣昌
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所