用于纯化包膜病毒或病毒载体的方法

用于纯化包膜病毒或病毒载体的方法【专利摘要】本发明涉及一种用于纯化包膜病毒的方法。本发明的方法用于在符合良好生产规范并可以获得临床级病毒的条件下大规模回收包膜病毒。【专利说明】用于纯化包膜病毒或病毒载体的方法
技术领域：
[0001]本发明涉及用于纯化包膜病毒的方法。本发明的方法可用于在符合良好生产规范并允许获得临床级病毒的条件下大规模回收包膜病毒。【
背景技术：
】[0002]源自于人免疫缺陷病毒(尤其是HIV-1)的慢病毒载体是最常用于基因疗法的载体的一部分。这些载体通常具有来自于其他病毒的糖蛋白假型：长臂猿白血病病毒(GALV;(GaLV-TR糖蛋白）），水疱性口炎病毒(VSV-g)，麻疹病毒(或MV)。用于纯化具有VSV-G蛋白假型的慢病毒载体的临床批料的方法已被描述(Schweizer和Merten，2010)。然而，具有其他包膜蛋白假型、更具体来说具有源自于GaLV或MV的糖蛋白假型的病毒载体未被广泛使用，这是因为目前没有令人满意的纯化流程可用。这种类型的假型载体的纯化的主要限制性障碍涉及某些膜糖蛋白的不稳定性和脆弱性。然而，这些载体就其与具有VSV-G蛋白假型的载体相比不太宽泛的嗜性而言，是特别令人感兴趣的。例如，具有源自于GALV的糖蛋白假型的载体具有更受限制的嗜性，并且更具体来说靶向造血干细胞。因此，提供用于纯化具有GALV糖蛋白假型的载体的高效方法，代表了基因疗法领域中的重要挑战。[0003]因此，本发明人提出了开发一种用于纯化包膜病毒、尤其是具有包膜糖蛋白GaLV或其他包膜蛋白假型的病毒的方法，其目的是生产用于临床用途的病毒制备物。[0004]发明概述[0005]本发明源自于由本发明人做出的出人意料的观察，即在包膜病毒纯化期间使用的溶液的pH的影响以及某些添加剂对所述纯化的得率的正面影响。[0006]具体来说，本发明源自于下述观察，即当在阴离子交换层析期间使用酸性缓冲剂时，包膜蛋白的纯化获得显著的提高。因此，本发明的目的是一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包括阴离子交换层析，在所述层析期间使用的缓冲剂具有低于6的pH。[0007]具体来说，所述pH尤其可以在5.5至6之间。根据可替选方式，在阴离子交换层析期间使用的所述缓冲剂的pH高于或等于6,并且还包含多元醇。[0008]本发明人能够显示，通过在用于纯化包膜病毒的方法的一个或几个步骤期间使用的一种或几种缓冲剂中添加多元醇，可以获得纯化得率的实质性提高。具体来说，在包含超滤/渗滤步骤和随后的阴离子交换层析的纯化中，当在所述层析期间使用的缓冲剂包含多元醇时，观察到纯化得率的提高。[0009]本发明人还提出倒转在所述纯化期间使用的阴离子交换层析步骤和超滤/渗滤步骤、尤其是切向流过滤(TFF)的次序。在阴离子交换层析之前使用超滤/渗滤、尤其是TFF，允许显著提高包膜载体的纯化得率。因此，本发明还涉及一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法依次包括超滤/渗滤步骤、尤其是TFF步骤，随后是阴离子交换层析步骤。[0010]此外，本发明涉及一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包含超滤/渗滤步骤、尤其是TFF步骤，所述步骤使用含有多元醇的缓冲剂来进行。[0011]更具体来说，本发明适应于纯化具有源自于GaLV的糖蛋白假型的病毒。在本发明可用之前，具有这种类型的糖蛋白假型的病毒被认为是"不可纯化的"。由于GaLV假型病毒的脆弱性，对这些病毒载体进行的不同研究使用未被纯化的载体的原始制备物。出人意料的是，本发明人可以显示，利用本发明的方法获得纯化得率的显著改进。本发明人也可以显示，这种方法还允许具有其他包膜糖蛋白、尤其是具有VSV-G和MV糖蛋白假型的病毒的纯化得率提尚。【具体实施方式】[0012]包膜病毒和载体的生产[0013]包膜病毒或载体的生产在本领域中是公知的。本领域技术人员可以参考该领域中的一般性知识，尤其是下述文献所代表的一般性知识：Ansorge等，2010;Schweizer和Merten2010;Rodrigues等，2011。[0014]生产的病毒尤其是包膜病毒载体。所述病毒载体尤其是源自于反转录病毒、特别是慢病毒。生产的反转录病毒载体尤其是源自于α反转录病毒（例如ALV，表示禽白血病病毒）、β反转录病毒（例如MMTV，表示小鼠乳腺肿瘤病毒）、γ反转录病毒（例如不同类型的MLV，表示鼠白血病病毒）、δ反转录病毒(例如不同类型的HTLV，表示人嗜Τ-淋巴细胞病毒）、ε反转录病毒(例如TOSV，表不大眼自卢皮肤肉瘤病毒）、泡沫病毒(例如HFV，表不人泡沫病毒，和SFV，表示猴泡沫病毒）、灵长类慢病毒例如不同类型的人免疫缺陷病毒(HIV，表示人免疫缺陷病毒）、不同类型的猴免疫缺陷病毒(SIV，表示猴免疫缺陷病毒）、或非灵长类哺乳动物慢病毒例如马传染性贫血病毒(EIAV，表示马传染性贫血病毒）、猫免疫缺陷病毒(FIV，表示猫免疫缺陷病毒）、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV，表示山羊关节炎-脑炎病毒）或绵羊维斯纳-梅迪病毒(VMV，表示维斯纳梅迪病毒）。[0015]根据特定实施方式，所述包膜病毒、尤其是所述反转录病毒载体、特别是慢病毒载体，是假型的，即它包含源自于与所述反转录病毒粒子所源自的病毒不同的病毒的包膜糖蛋白、修饰的包膜糖蛋白或嵌合的包膜糖蛋白。根据特定实施方式，所述反转录病毒载体具有源自于水疱性口炎病毒(VSV-G)、麻疹病毒(MV，表示麻疹病毒)或修饰的MV病毒(尤其是用抗CMHII抗体修饰的）、狒狒内源性病毒(BaEV)或长臂猿白血病病毒(GALV)的包膜糖蛋白假型，尽管本领域技术人员可以设想使用其他病毒的包膜糖蛋白（Frecha等，2008)。根据特定实施方式，所述包膜病毒、尤其是所述反转录病毒载体、更特别为慢病毒载体，具有修饰的包膜糖蛋白假型，例如GALVTR(GALV包膜糖蛋白，其中毒粒内C-端末端已被兼嗜性人白血病病毒A-MLV的包膜糖蛋白的C-端末端代替，从而允许包膜糖蛋白非常高效地并入到慢病毒粒子中）（Christodoulopoulos和Cannon2001)。根据特定实施方式，所述包膜病毒、尤其是所述反转录病毒载体、更特别为慢病毒载体，具有嵌合的包膜糖蛋白假型，例如其中插入有编码免疫球蛋白的重链和轻链可变区的融合蛋白（scFv，表示单链可变片段)或具有重复的锚蛋白结构域的蛋白（DARPin，表示设计的锚蛋白重复序列蛋白），以允许特异性靶向靶细胞表面处的给定受体的麻疹病毒的包膜糖蛋白（Anliker等，2010;Miinch等，2011)。根据特定实施方式，所述慢病毒载体具有源自于GALV病毒、水疱性口炎病毒(例如VSV-G包膜蛋白）或麻疹病毒的包膜假型，尽管本领域技术人员可以设想使用其他的包膜蛋白。[0016]此外，所述包膜病毒可以含有引入到它的基因组中的目标转入基因。当然，所述目标转入基因取决于所述包膜病毒载体所打算的具体用途。示例性地，我们可以提到编码治疗性RNA的目标转入基因（例如编码靶RNA或DNA序列的反义互补RNA的目标转入基因），为患有疾病的对象中缺乏或缺少的蛋白质编码的用于基因疗法的转入基因，或用于DNA疫苗接种的转入基因，即为蛋白质编码的转入基因，所述蛋白质的表达将诱导受体身体针对所述蛋白质的疫苗接种。根据特定实施方式，可用于基因疗法的包膜病毒载体被生产，然后被纯化。有利情况下，使用的生产方法与良好实验室规范相容，并为设想大规模生产包膜病毒载体、尤其是反转录病毒载体、尤其是慢病毒载体、特别是假型慢病毒载体(特别是对于反转录病毒来说具有GALV包膜蛋白假型或对于慢病毒、VSV-G或MV来说具有GALVTR假型），提供了可能性。[0017]根据用于生产慢病毒载体的优选实施方式，将下列4种元件引入到宿主细胞中：包含慢病毒基因gagpol的表达盒，包含慢病毒基因rev的表达盒，包含在慢病毒的LTR-5'和慢病毒的LTR-3'之间的目标转入基因的表达盒，以及包膜糖蛋白的表达盒。[0018]在特定实施方式中，所述包膜病毒、尤其是反转录病毒载体、更特别是慢病毒载体，从表达生产包膜病毒所需的一种或几种元件的稳定株系生产(Miller2001;Rodrigues等，2011)例如人类生产株系GPRG-EFla-hycOPT，其组成性生产源自于HIV-1的具有包膜糖蛋白VSV-G假型的慢病毒载体(Greene等，2012)，或例如鼠类生产株系PG13-MFG-GFP，其组成性生产具有包膜糖蛋白GaLV假型的MLVγ反转录病毒载体(Miller等，1991)。在特定实施方式中，所述包膜病毒从用编码生产所述病毒所需的元件的一种或几种质粒瞬时转染的哺乳动物宿主细胞生产。根据允许生产慢病毒载体的可替选方式，利用4种质粒将所述元件引入到细胞中：一种质粒带有包含慢病毒gagpol基因的表达盒，一种质粒带有包含慢病毒rev基因的表达盒，一种转移质粒包含在慢病毒的LTR-5'与LTR-3'之间包含目标转入基因的表达盒，以及一种质粒带有包膜糖蛋白的表达盒。[0019]所述宿主细胞可以选自允许生产包膜病毒的任何细胞。根据特定实施方式，所述细胞选自人类细胞(HEK293、HEK293T、HEK293FT、Te671、HT1080、CEM)、鼠类细胞(NIH-3T3)、鼬类细胞（Mpf)、犬类细胞（D17)(Miller和Chen1996;Miller2001;Merten2004;Rodrigues等，2〇11;Stacey和Merten2〇11)〇[0020]将所述细胞在适合于培养哺乳动物细胞并生产包膜病毒的培养基中培养。此外，所述培养基可以增补有本领域中公知的添加剂例如以适合浓度添加的抗生素、血清(尤其是胎牛血清等）。尤其是，所使用的培养基可以包含血清，或者可以无血清。用于哺乳动物细胞的培养基在本领域中是公知的。就此而言可以提到的有DMEM(Du1becco改良的Eag1e培养基)培养基、RPMI1640或各种不同培养基的混合物包括例如DMEM/F12,或无血清培养基例如OptiMEM⑩、optiPRQ?、optiPRO-SFM?、CD29305>Freesty1eF17?(LifeTechnologies)或Ex-Cell.?293(Sigma-Aldrich)〇[0021]在使用瞬时转染的细胞的方法中，可以使用允许质粒转染的任何试剂。尤其是可以使用磷酸钙或聚乙稀亚胺，尽管本领域技术人员可以设想其他试剂(Ansorge等，2010)。条件(尤其是质粒的量、质粒之间的比率、质粒与转染试剂之间的比率、培养基的类型等)和转染时间，可以由本领域技术人员根据所生产的病毒和/或引入到转移质粒中的转入基因的特征来适应性改变。[0022]然后按照本领域中公知的方法，从培养物的上清液收获所述包膜病毒。[0023]根据特定实施方式，所使用的培养基具有本领域中惯常用于培养细胞和生产病毒的中性pH(例如在7至7.4之间，尤其是7、7.1、7.2、7.3或7.4)。根据特定实施方式，所使用的生产方法包括将生产细胞在适度酸性的培养基中培养。尽管现有技术表明培养基的中性是细胞的最适培养和包膜病毒和载体的最适生产的必需条件，但已发现，适度酸性的条件相反提供了显著提高包膜病毒、尤其是慢病毒、特别是假型慢病毒（例如具有蛋白GaLV(或GaLVTR)、VSV-G或麻疹病毒包膜蛋白假型）的产量的可能性。[0024]根据可替选方式，包膜载体的生产在适度酸性条件下实现。表述"适当酸性条件"是指水性溶液的pH在5至6.8之间，特别是5.5至6.5之间，更特别是在5.8至6.2之间。根据特定实施方式，培养基的pH约为6。所选的pH也将取决于所使用的培养基的缓冲能力，本领域技术人员在考虑到他/她的通用知识后可以容易地确定所述缓冲能力。本领域技术人员能够改变溶液的PH，尤其是细胞培养基的pH。他/她尤其可以在所述溶液中引入酸、尤其是强酸例如盐酸的溶液。如果需要，可以使用碱、尤其是强碱例如氢氧化钠的溶液通过抬高pH来重新调整PH，以便获得所需值。[0025]根据特定实施方式，所述包膜病毒的生产包括下列步骤：[0026]-利用编码元件的一种或几种质粒瞬时转染HEK293T细胞，所述元件为所述包膜载体的生产或为使用稳定的生产细胞组成性或在诱导后生产所述载体所需；[0027]-将所述细胞在适合的培养基中培养，所述培养基的pH为约6或约7;[0028]-在所述培养物的上清液中收获所述包膜病毒。[0029]根据这种实施方式的可替选方式，所述生产的包膜病毒是在利用4种质粒转染细胞后生产的慢病毒：一种质粒带有包含慢病毒gagpol基因的表达盒，一种质粒带有包含慢病毒rev基因的表达盒，一种转移质粒包含在慢病毒的LTR-5'与LTR-3'之间包含目标转入基因的表达盒，以及一种质粒带有包膜糖蛋白的表达盒。根据可替选方式，所述包膜蛋白源自于GaLV病毒(特别是对于慢病毒载体来说修饰的糖蛋白GaLVTR)、VSV病毒(特别是VSV-G包膜)或麻疹病毒(MV)。[0030]包膜病毒和载体的纯化[0031]正如我们将在本申请的实施例中看到的，可以通过适应性修改在纯化期间使用的缓冲剂的pH条件，显著提高生产的包膜病毒的纯化得率。[0032]具体来说，非常有利的情况下，所述包膜病毒可以按照包括在阴离子交换层析期间使用酸性缓冲剂的新方法进行纯化。因此，本发明具体来说涉及一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包括阴离子交换层析步骤，在该阴离子交换层析步骤期间使用的缓冲剂具有低于或等于6.9的pH。所述包膜病毒尤其可以从生产所述包膜病毒的细胞培养物的培养基中纯化。在特定实施方式中，在所述阴离子交换层析步骤期间使用的缓冲剂的pH在4.5至6.2之间（尤其是等于4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)，更特别在5至6之间（尤其是等于5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)。根据特定实施方式，所述pH在5至6之间或在5至5.9之间，更特别地所述pH等于5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8或5.9。特别地，所述?!1在5.5至6之间（例如等于5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)，更特别地所述?!1约为5.5(例如5.4、5.5或5.6)或6(例如5.9、6或6.1)，更特别为5.5。在所述阴离子交换层析之前或之后、优选地之前，可以具有超滤步骤，特别是超滤/渗滤，尤其是切向流过滤。根据一种实施方式，所述阴离子交换层析在所述超滤之前。根据一种可替选实施方式，所述超滤在所述阴离子交换层析之前，后一种实施方式是优选的。[0033]本发明人还已显示了当在阴离子交换层析期间使用的缓冲剂具有高于或等于6的pH，尤其是6至8之间的pH(尤其是等于6·0、6·1、6·2、6·3、6·4、6·5、6·6、6·7、6·8、6·9、7·0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH)时，在所述缓冲剂中使用多元醇、尤其是蔗糖的优点。因此，本发明还涉及一种纯化包膜病毒的方法，所述方法包括超滤/渗滤步骤和随后的阴离子交换层析步骤，所述层析使用具有高于或等于6的pH、尤其是6至8之间的pH、更特别是7至8之间的pH(尤其是等于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH)并含有多元醇的缓冲剂来进行。[0034]在所述超滤/渗滤步骤、更特别是TFF期间使用的缓冲剂也可以是酸性、中性或碱性缓冲剂。[0035]本领域技术人员能够改变在用于纯化包膜病毒的步骤期间使用的溶液的pH，尤其是缓冲剂的pH。他/她尤其可以在所述溶液中引入酸、尤其是强酸例如盐酸的溶液，以降低所述pH或调整它。如果需要，可以使用碱、尤其是强碱例如氢氧化钠的溶液，通过抬高pH来获得碱性pH或重新调整所述pH，以便获得所需酸度值。当然，本领域技术人员将确保使用足以获得在所需pH下具有适合的缓冲能力的溶液的制剂。[0036]装载在超滤/渗滤装置上或其中或阴离子交换层析柱上的溶液，可以对应于细胞培养物上清液，其任选地用全能核酸酶和/或低速离心和/或澄清进行预处理。应该理解，这种任选地预处理的培养物上清液不对应于"纯化缓冲剂"。然而，如果需要，在装载它之前也可以调整它的pH。如果在中性或酸性pH下进行生产，所述任选地预处理的培养物上清液可以被直接装载，或者在装载它之前可以降低或提高它的pH。也可以设想在装载所述任选地预处理的培养物上清液之前将添加剂添加到其中。例如，可以在该步骤一旦开始后，添加多元醇、抗氧化剂(尤其是L-组氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、谷胱甘肽或维生素C)、金属盐尤其是镁盐例如MgCl2或MgS〇4，或任何其他适合的添加剂。[0037]根据特定实施方式，将所述任选地预处理的培养物上清液直接装载到所述超滤/渗滤装置上或其中或层析柱上，而不进行pH调整并且不添加所述添加剂。可以、并且优选地事先使用酸性、碱性或中性pH缓冲剂，用于平衡所述超滤/渗滤装置和/或也用于实现超滤/渗滤或阴离子交换层析。[0038]根据一种可替选方式，所述超滤/渗滤步骤是TFF步骤。在这种可替选方式中，渗滤使用pH按照上面讨论的条件调整过的缓冲剂来实现。因此，所使用的缓冲剂可以是酸性缓冲剂，尤其是pH低于6的缓冲剂或pH在4.5至6.2之间（尤其是等于4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)、尤其是在5至6之间（尤其是等于5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)的缓冲剂，特别是卩!1在5.5至6之间(尤其是等于5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)的缓冲剂，更特别是?!1为5.5的缓冲剂。在一个可替选方式中，所使用的缓冲剂是pH高于或等于6、尤其是在6至8之间（尤其是等于6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的?1〇、更特别是7至8之间（尤其是等于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH)并包含多元醇的缓冲剂。[0039]在所述超滤步骤期间和在所述渗滤步骤期间使用的缓冲剂可以不同或相同。在特定实施方式中，所述超滤步骤利用pH约为7的缓冲剂(尤其是pH在6.8至7.2之间（例如等于6.8、6.9、7.0、7.1或7.2)，更特别是?!1为7的缓冲剂)来实现，并且渗滤利用具有4.5至6.2之间的pH(尤其是等于4·5、4·6、4·7、4·8、4·9、5·0、5·1、5·2、5·3、5·4、5·5、5·6、5·7、5·8、5·9、6.0、6.1或6.2)、尤其是5至6之间的卩!1(尤其是等于5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)的缓冲剂，更特别是具有5.5至6之间的？!1(尤其是等于5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)的缓冲剂，特别是具有等于5.5的pH的缓冲剂来实现。[0040]在一个实施方式中，所述纯化方法包括阴离子交换层析步骤，随后是超滤/渗滤步骤。在另一个实施方式中，所述纯化方法包括超滤步骤，随后是阴离子交换层析步骤。[0041]在特定实施方式中，所述纯化方法包括：[0042](a)所述细胞培养基的澄清；[0043](b)超滤/渗滤步骤；[0044](c)阴离子交换层析；[0045](d)排阻层析；[0046]其中步骤(b)和(c)可以颠倒。在优选实施方式中，步骤(c)在步骤(b)之后。[0047]本申请的图1概述了符合本发明的纯化方法的优选实施方式的步骤。[0048]根据特定实施方式，第一澄清步骤如下进行:将所述培养物上清液在截留阈值在0.2至0.8μπι之间的滤器、特别是0.45μπι滤器上过滤，并且在所述滤液中回收所述包膜病毒。根据一个实施方式，所述澄清利用一系列具有不同截留阈值的滤器，例如连续的〇.8、0.45和0.2μπι或0.65和0.2μπι滤器来实现。在该澄清步骤之前可以进行以低速离心所述培养物上清液的步骤。该步骤中的离心速率尤其可以在500xg至l，000xg之间。[0049]根据特定实施方式，所述超滤/渗滤步骤尤其通过使用切向流的过滤来实现。根据这个实施方式，所述使用切向流的过滤可以利用具有中空纤维的膜或平面膜或螺旋缠绕膜盒来进行，其中孔眼的排阻尺寸在300至800kDa之间，特别是在500至750kDa之间。根据另一个实施方式，所述孔眼的排阻尺寸为至少300、400、500、600或700kDa，或者是800kDa。根据优选实施方式，用于所述使用切向流的过滤的膜的特征在于所述孔眼的排阻尺寸为750kDa。根据特定实施方式，在所述超滤/渗滤步骤结束时，所述包膜病毒、尤其是所述澄清步骤的滤液中存在的包膜病毒被浓缩直至可能的最小体积，例如至少5X、至少1OX、15X、20父、25乂、3(^、35乂、4(^、45乂、5(^、55乂或6(^。例如，在所述超滤/渗滤步骤结束时，所述包膜病毒被浓缩36.6X或50X。根据另一个实施方式，所述超滤/渗滤步骤允许将污染物的载量减少超过70%、80%、85%、90%或超过95%。根据特定实施方式，所述超滤/渗滤步骤以下列方式进行:实现第一次浓缩，例如25X的浓缩(尤其是将500mL的体积转至20mL的体积），然后使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或甚至至少10倍体积的含有或不含多元醇和/或一种或几种抗氧化剂的酸性缓冲剂、例如使用10倍体积的缓冲剂进行渗滤，在该步骤之后进行第二个浓缩步骤，尤其是浓缩至可能的最小体积，用于获得例如50X的浓缩。[0050]阴离子交换层析基材在本领域中是公知的。本发明更特别地在柱上或膜上、更特别地在柱上使用阴离子交换层析。一个优选实施方式包括应用低阴离子交换层析(尤其是DEAE(D)-二乙基氨基乙基，PI-聚乙烯亚胺）。就此而言，可以提到使用选自DEAE柱的基材。作为不例，可以提到的基材有MonolitheCIMD(BIAseparation)、PorosD50(LifeTechnologies)、SartobindD(Sartorius)、Toyopea;rl650CDEAE(Tosoh)等。在一个优选实施方式中，所述阴离子交换层析基材是不可压缩的基材例如基材MonolitheCIMD和PorosD50,其提供了获得比可压缩基材更好的得率的可能性。当在所述阴离子交换层析期间使用的缓冲剂的pH低于6时，所述缓冲剂含有或不含多元醇。具体来说，观察到通过在这一步骤期间使用pH为5.5的缓冲剂，可以获得约100%的GALVTR假型慢病毒载体得率，而不需添加多元醇。这种出色的得率水平在以前从未被达到过，并且出于较早时讨论过的原因，特别有利地提供了设想大规模使用这种类型的载体的可能性。多元醇的添加尚未显示出对这种得率的任何正面或负面影响，但是出于使洗脱的载体稳定的目的可以设想添加它们。当所使用的缓冲剂的pH高于或等于6,尤其是在6至8之间时，多元醇的添加明显提高纯化的得率。因此，根据本发明，当所述阴离子交换层析缓冲剂的pH在约6至约8之间时，所述pH的缓冲剂含有多元醇。[0051]在一个实施方式中，将来自于超滤步骤、更特别是来自于超滤/渗滤的纯化和过滤过的溶液沉积在层析基材上，所述层析基材最初已利用具有低于6的pH并任选地含有多元醇的平衡缓冲剂平衡。所述平衡缓冲剂和载样缓冲剂尤其可以含有〇至250mM之间的NaCl浓度。这些缓冲剂尤其可以是对应于具有5至6的pH(例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0，尤其是5.5的？!〇、5%蔗糖、2111]\11%(：12的祀8-1^82〇111]\1缓冲剂或具有高于或等于6、尤其是6至8之间的pH(具有等于6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH)并含有多元醇的平衡缓冲剂的化合物，例如具有7的pH并含有5%蔗糖的PBS缓冲剂或具有pH8、5%蔗糖、2mMMgCl2的Bis-Tris-丙烷。所述缓冲剂以足够的速率引入(例如1倍柱体积/min或4cm/min)。然后将所述柱用平衡缓冲剂清洗，最后洗脱。根据特定实施方式，所述阴离子交换层析柱的洗脱分两步进行，使用包含或不含多元醇的缓冲剂、尤其是0.3MNaCl、20mMBis-Tris(pH5至6,尤其是等于5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0，特别是5.5的?!〇、5%蔗糖、2mMMgCl2的缓冲剂，并且所述载体的洗脱使用包含多元醇的具有更高离子强度的缓冲剂进行，尤其是650禮他(：1、2〇11118丨8-1^8(?!16)、5%蔗糖、211111%(：12的缓冲剂。因此，符合本发明的方法有利地允许与常规使用的盐浓度相比减少从柱洗脱载体所需的盐的量。根据特定实施方式，所述洗脱使用NaCl浓度在450mM至l，000mM之间的缓冲剂进行。根据这种实施方式的可替选方式，所述洗脱缓冲剂含有450至800mM之间的NaCl，2%至8%之间、更特别地5%的多元醇(特别是蔗糖），所述缓冲剂具有5.5至6之间的？!1(尤其是扮8-1^8缓冲剂，任选地含有2mMMgCl2)。[0052]根据另一个实施方式，所述阴离子交换层析基材的洗脱分两个阶段进行，第一步对应于进行预洗脱，目的是除去所述生产的污染物。该第一洗脱的缓冲剂可以例如包含浓度在0至450mM之间的NaCl(尤其是在0至350mM之间，如果所述缓冲剂具有低于或等于6、尤其是5至6之间的pH，更特别是等于5.5或6.0的pH的话;或者在0至450mM之间，如果所述缓冲剂具有高于或等于7的pH的话）。然后进行第二洗脱，用于从层析基材回收所述病毒(例如病毒载体）。当所述第二洗脱缓冲剂的pH在5至6之间，更特别地具有5.5的pH时，所述盐浓度可以例如在450至800mM之间。当所述第二洗脱缓冲剂的pH高于或等于7时，所述盐浓度可以在600至l，000mM之间。[0053]根据包含用于阴离子交换层析基材的单一洗脱步骤的特定实施方式，使用下述步骤：[0054]i)将在所述超滤步骤结束时获得的溶液装载在所述阴离子交换层析基材上，所述溶液尤其是：[0055]-具有5.5至6之间的？!1，并包含0至20〇1111之间的恥(：1浓度；[0056]-或具有7的pH，并且NaCl浓度在0至350mM之间；[0057]ii)使用缓冲剂，从所述阴离子交换层析基材洗脱所述病毒，尤其是病毒载体，所述缓冲剂：[0058]-或者具有5.5至6之间的pH并包含450至800mM之间的NaCl浓度；[0059]-或者具有7的pH，并且NaCl浓度在600至l，000mM之间。[0060]根据包含用于阴离子交换层析基材的两个洗脱步骤的另一个特定实施方式，使用下述步骤：[0061]i)将在所述超滤步骤结束时获得的溶液装载在所述阴离子交换层析基材上，所述溶液不含任何添加的NaCl;[0062]ii)所述阴离子交换层析基材的第一次洗脱（目的是除去污染物），第一洗脱缓冲剂：[0063]-具有5.5至6之间的pH，并包含0至350mM之间的NaCl浓度；[0064]-或具有7的pH，并且NaCl浓度在0至450mM之间；[0065]iii)所述阴离子交换层析基材的第二次洗脱（目的是回收所述病毒、尤其是病毒载体），第二洗脱缓冲剂：[0066]-具有5.5至6之间的pH并包含450至800mM之间的NaCl浓度[0067]-或者具有7的pH，并且NaCl浓度在600至l，000mM之间。[0068]为了评估级分并选择随后将经历纯化过程的级分，所述柱可以在出口处装备有色谱仪，其装备有UV280nm吸光度读取器、电导计、绘图仪和分部收集器。[0069]优选地在所述阴离子交换层析步骤后立即进行排阻层析步骤。所使用的排阻树脂具有300至l，000kDa之间、尤其是500至800kDa之间的排阻尺寸。根据特定实施方式，所使用的排阻层析柱由500、700或800kDa的排阻尺寸定义。此外，在特定实施方式中，用于这一步骤的柱包含多模树脂，尤其是具有排阻凝胶和吸附凝胶(通过疏水相互作用以及通过基材的正电荷)双重功能的树脂。就此而言，可以提到的有CaptoCore700柱(GEHealthcare)。在一个实施方式中，所述层析凝胶是不可压缩的基材。将来自于阴离子交换层析的包膜病毒或载体的样品装载在所述柱上，然后以适合的速率例如〇.5mL/分钟的速率注入制剂缓冲剂。在柱出口处利用280nmUV吸光度读取器确定待收集的级分。[0070]根据一种情况，本发明涉及一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包括超滤/渗滤步骤、尤其是TFF，所述步骤利用含有多元醇的缓冲剂进行。本发明人可以显示，通过在超滤/渗滤缓冲剂中添加多元醇，可以显著提高纯化的得率(下面实施例中的表2)，这从未被报道过。可以在这一步骤期间使用的多元醇以及它们的浓度在下文中指明。在所述超滤步骤期间和渗滤步骤期间使用的缓冲剂可以不同或相同。在特定实施方式中，所述超滤步骤利用具有约7的pH缓冲剂(尤其是pH在6.8至7.2之间（例如等于6.8、6.9、7.0、7.1或7.2)，更特别是具有7的pH的缓冲剂)来进行，并且渗滤利用具有低于6或在4.5至6.2之间的pH(尤其是等于4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2)的缓冲剂，尤其是具有5至6之间的pH、更特别是具有5.5至6之间的pH(尤其是等于5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)的缓冲剂，更特别是具有等于5.5或6的?!1的缓冲剂，特别是具有等于5.5的pH的缓冲剂来进行。切向流过滤可以利用具有中空纤维的膜或平面膜或螺旋缠绕膜盒来进行，其孔眼排阻尺寸在300至800kDa之间，特别是在500至750kDa之间。根据另一个实施方式，所述孔眼排阻尺寸为至少300、400、500、600或700kDa，或者是800kDa。根据优选实施方式，用于所述切向流过滤的膜的特征在于孔眼排阻尺寸为750kDa。根据特定实施方式，在所述超滤/渗滤步骤结束时，所述包膜病毒、尤其是所述澄清步骤的滤液中存在的包膜病毒被浓缩直至可能的最小体积，例如至少5X、至少1OX、15X、20父、25乂、3(^、35乂、4(^、45乂、5(^、55乂或6(^。例如，在所述超滤/渗滤步骤结束时，所述包膜病毒被浓缩36.6X或50X。根据另一个实施方式，所述超滤/渗滤步骤允许将污染物的载量减少超过70%、80%、85%、90%或超过95%。根据特定实施方式，所述超滤/渗滤步骤以下列方式进行:实现第一次浓缩，例如25X的浓缩(尤其是将500mL的体积转至20mL的体积），然后使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或甚至至少10倍体积的含有或不含多元醇和/或一种或几种抗氧化剂的酸性缓冲剂、例如使用10倍体积的缓冲剂进行渗滤，在该步骤之后进行第二个浓缩步骤，尤其是浓缩直至可能的最小体积，用于获得例如50X的浓缩。[0071]根据上面详细描述的条件，所述超滤/渗滤步骤可以在阴离子交换层析步骤之前或之后，或者在排阻层析步骤之前。[0072]根据特定实施方式，所述生产方法旨在生产研究级的包膜病毒。在这种情况下，可以省略所述离子交换层析步骤(此时所述方法包含例如上述的步骤(a)、（b)和(d))。根据另一个实施方式，所述方法旨在纯化临床级的病毒。在后一种情况下，优选地包括所述阴离子交换层析步骤。此外，在所述排阻层析步骤之后可以进行除菌过滤步骤，尤其是利用滤膜、特别是截留阈值小于或等于〇.22μπι的膜。[0073]在本发明的情形中，术语"多元醇"是指直链、环状或双环含碳分子，其包含3至18个之间的碳原子、特别是3至12个之间的碳原子，并被至少3-6个羟基、特别是8个羟基取代。所述多元醇可以是例如醛糖或酮糖单糖，尤其是丁糖、戊糖或己糖。尤其可以提到的是下列单糖多元醇:赤藓糖，苏阿糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，来苏糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，赤藓酮糖，核酮糖，木酮糖，果糖，阿洛酮糖，山梨糖，塔格糖。所述多元醇也可以选自下列二糖或三糖，其形成可用于本发明的实施的其他多元醇的非限制性名单:纤维二糖，龙胆二糖，菊粉二糖，异麦芽糖，异麦芽酮糖，曲二糖，乳糖，乳酮糖，昆布二糖，白菌二糖，，麦芽糖，麦芽酮糖，蜜二糖，黑曲霉糖，刺槐糖，芸香糖，鹿糖，槐二糖，海藻糖，海藻酮糖，松二糖，吡喃葡糖基蔗糖，岩藻糖基乳糖，龙胆三糖，果三糖，1-蔗果三糖，6-蔗果三糖，麦芽三糖，甘露三糖，松三糖，新科斯糖(neokestose)，潘塘，棉籽糖，鼠李三糖。在特定实施方式中，所述多元醇选自棉籽糖、异麦芽三糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、葡萄糖和甘油。在特定实施方式中，所述多元醇是蔗糖。[0074]所述多元醇的浓度可以在极大程度上变化，特别是对于在此步骤期间使用的不同缓冲剂中的每种来说可能不同。所述多元醇浓度尤其可以在1%至15%(w/v)之间，尤其是1.5%至10%之间，特别是2%至8%之间，更特别是2%至5%之间。在特定实施方式中，阴离子交换层析的一种或几种缓冲剂的多元醇浓度为5%(w/v)。在特定实施方式中，在所述纯化方法期间使用的所有缓冲剂都包含多元醇、尤其是蔗糖，特别是5%(w/v)的浓度。因此，根据这个实施方式，所述方法可以包含TFF步骤、阴离子交换层析步骤和排阻层析步骤，在此期间使用的所有缓冲剂都包含多元醇。在另一个实施方式中，所述TFF步骤和阴离子交换层析的缓冲剂包含多元醇，而用于平衡和洗脱所述排阻层析柱的缓冲剂不含任何多元醇，这些缓冲剂对应于制剂缓冲剂，其组分很大程度上取决于治疗目的和用于给药最终产品的方法。[0075]在另一个实施方式中，在本发明的方法期间使用的一种或几种缓冲剂、尤其是在所述超滤/渗滤和/或阴离子交换层析期间使用的缓冲剂，包含镁盐、尤其是氯化镁或硫酸镁。每种所述缓冲剂中镁盐、尤其是氯化镁或硫酸镁的浓度，对于每种缓冲剂来说可以独立地在0.1mM至5mM之间，尤其是1至3mM之间，特别是2mM。[0076]在另一个实施方式中，在本发明的方法期间使用的一种或几种缓冲剂包含L-His、L-Met、L-Cys、谷胱甘肽或维生素C，其目的是失活自由基。每种所述缓冲剂中这些组分的浓度，对于每种缓冲剂来说可以独立地在0.1mM至20mM之间。[0077]符合本发明的纯化方法还可以包括用核酸酶、尤其是全能核酸酶处理样品的一个或几个步骤。所述核酸酶可以在每个步骤之前或之后使用。在一个实施方式中，将所述核酸酶、尤其是全能核酸酶用于质粒转染步骤后生产细胞的培养基中。[0078]根据一个实施方式，所述纯化的一个或几个步骤在低于室温的温度下、特别是2至12°C之间、更特别地4至10°C之间的温度下进行。根据特定实施方式，所述纯化的一个、几个或所有步骤，在约4°C下进行。[0079]根据一个实施方式，按照本发明的方法纯化的包膜病毒是重组包膜病毒。优选地，所述包膜病毒是重组假型反转录病毒、更特别是慢病毒，其中所述包膜蛋白源自于GaLV病毒(尤其是对于慢病毒载体来说修饰的GaLVTR糖蛋白）、VSV病毒(尤其是VSV-G包膜)或麻疹病毒(MV)。在特别优选的可替选方式中，按照本发明的方法纯化的包膜病毒是重组假型反转录病毒、更特别是慢病毒，其中所述包膜蛋白源自于GaLV病毒(尤其是对于慢病毒载体来说修饰的GaLVTR糖蛋白）。【附图说明】[0080]图1.用于纯化LV-GaLV-TR慢病毒粒子的两种方法:方法(A)是在切向流过滤的步骤后使用单一排阻层析步骤(凝胶过滤）的简化方法;方法(B)是更复杂的方法，旨在获得比使用方法(A)期间更高的纯度，例如旨在生产用于临床的载体。[0081]图2.截留值为500kDa和750kDa的膜在除去污染蛋白中的比较(SDS-PAGE(顶部)和抗p24抗体Western印迹(底部））。在Western印迹上，对于所有样品来说可以清晰看到24/25kDa条带（=p24):1)尺寸标志物；2)以750kDa渗滤(a)(试验1);3)以750kDa渗滤(b)(试验2);4)以68,338g超离心3h(重悬浮在培养基X-vivo20中）；5)以500kDa渗滤(a)(试验1);6)以500kDa渗滤(b)(试验2);7)含有LV-GaLV-TR载体的培养物上清液。[0082]图3.NaCl对储存在室温下的编码GFP的LV-GaLV-TR载体的稳定性的影响。将载体在室温(RT)下在7.0的pH(PBS)下温育4小时。为了优化阴离子交换层析步骤，我们试验了载体在NaCl盐水介质中的稳定性。为此，在UF/DF步骤后将载体在室温下，在具有不同NaCl浓度的pH7.0的PBS缓冲剂中温育4h。接下来，将载体在HCT116细胞上滴定。48小时后，将细胞在FACS上通过(流式细胞术）以便测量GFP的表达百分率。[0083]图4.洗脱缓冲剂的pH和盐度对阴离子交换层析步骤后感染性慢病毒载体的纯化得率的影响。载体的制备物通过HEK293T细胞的转染来生产，通过TFF澄清并浓缩/渗滤，旨在用于评估阴离子交换层析(低）的各种不同基材。评估了各种不同基材:Toyopearl650CDEAE，(HMD(DEAE)和PorosDdOO%的得率等同于在先前的TFF步骤后的感染性滴度。[0084]图5.通过排阻层析(CaptoCore700)纯化GaLV-TR慢病毒载体的制备物。将3mL慢病毒制备物浓缩/渗滤，然后在CaptoCore700柱(4.5mL)上通过。在这一步骤期间将roS缓冲剂(pH7.0)、5%蔗糖、2mMMgCl2用于制剂和柱的平衡。收获lmL级分并分析载体浓度(TU):a)层析，图示出了每个级分的滴度(TU)，级分4-9的载体量的积累和级分4-9的累积回收率（％);b)所有级分的Western印迹;c)所有级分的SDS-PAGE。[0085]图6.用来自于Μ0Ι20的HIV-GaLV-TR载体转导CD34+SC细胞(来自于脐带的血液）：[0086]粗品：通过用HIV-GaLV-TR粗产品转导的⑶34+细胞的流式细胞术确定的表达GFP的细胞的百分率，[0087]DF/UF:通过用在粗产品通过TFF纯化和浓缩后获得的HIV-GaLV-TR载体的la制备物转导的CD34+细胞的流式细胞术确定的表达GFP的细胞的百分率。[0088]实施例[0089]在本申请中报道的研究得益于欧洲共同体第七框架计划（7thFrameworkProgramoftheEuropeanCommunity)(FP7/2007-2013)编号222878下的资助。[0090]材料和方法[0091]细胞:[0092]HEK293T和HCT116细胞系（结肠直肠癌细胞CCL-247,来源：ATCC)在37°C和5%⑶2下，在增补有2至10%胎牛血清(FCS)(LifeTechnologies)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)(DMEM+Glutamax)中培养。培养基：通过添加盐酸（HC137%，Sigma-Aldrich)将DMEM/FCS缓冲在pH6.0,然后利用Corning?l，〇〇〇mL滤器(0.22ymPES(聚醚砜））过滤。[0093]病毒载体的生产:[0094]源自于HIV-1的具有各种不同糖蛋白假型的病毒载体，通过在293T细胞中用Merten等人(2011)所描述的4种质粒进行磷酸钙瞬时四重转染来生产。将2xl08个293T细胞接种在1，760-cm2Hyperflask(Corning)中的550mLDMEM10%FCS(Kutner等，2009)中。24小时后，通过在其中并入DNA/CaCl2/HBS复合物，将培养基更换为转染培养基。所述4种质粒是：gagpol(pKLgagpol)136yg，rev(pKrev)52·25yg，转入基因质粒（pCCL-eGFP)206·8yg，用于每种假型的适合的包膜质粒:GaLV-TR:pBA.GALV-TR/Ampho-Kana(长臂猿白血病病毒）223yg，用于生产LV-GaLV-TR;VSV-GpMDG(水疱性口炎病毒-g)68·13yg，用于生产LV-VSV-g;pFA30和pHCMH2(麻疹病毒的修饰的包膜蛋白）40yg和14yg，用于生产LV-MV;足量的18mLH2O和8.9mLTE0.1X，与3mLCaCl2(2.5M)混合，然后添加30mLHBS2X，等待4min以待复合物形成，并将所述混合物添加到培养基。16小时后，将上清液更换为2%FCS15U全能核酸酶(Merck)和2mMMgCl2(Sigma-Aldrich)的新鲜培养基。在转染后48小时后进行收获，将上清液在乙酸纤维素(CA)1L(Corning)中在0.45μηι滤器上过滤。[0095]反转录病毒载体MLV-GaLV通过PG13细胞来生产。它们是生产MLV-GaLV载体的细胞(Miller等，1991)，将所述细胞在37°C和5%⑶2下维持在增补有2至10%FCS的Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibc〇)(DMEM+Glutamax)中。在更换培养基24小时后进行载体收获。接下来，将生产上清液在乙酸纤维素(Corning)中在0.45μπι滤器上澄清。[0096]通过切向流过滤(TFF)浓缩病毒载体:[0097]这一步骤仅包括浓缩所述生产上清液，然后用足以用于继续所述过程的缓冲剂替换培养基。[0098]在制备UF盒并确定归一化到0.5巴和20°C下的水NWP的透过率后进行超滤(UF)。然后将所述膜用pH6.0的含有5%蔗糖、2mMMgCl2的Bis-Tris缓冲剂平衡，或用其他缓冲剂平衡，其目的是在其他pH下进行浓缩/渗滤(例如:PBS，pH7.0，5%Μ蔗糖，2mMMgCl2)。整个过程在约4°C下进行，并且将待浓缩的产物的容器置于冰盒中。[0099]原理:进行第一次浓缩直至体积不超过20mL，然后使用10倍体积的用于离子交换层析载样的缓冲剂(在这种情况下：l〇x20mL)进行渗滤。在这些步骤后进行第二次浓缩，直至可能的最小体积(在本实施例情况下10mL)。[0100]膜：750kDa，410cm2:"中空纤维滤筒（Ho11owfibercartridge)"（GEHealthcare，编号UFP750-E3MA)，使用Kros-FlowresearchIITFF系统（Spectrum)〇[0101]在确认膜的完整性后，使用初始体积为500mL的粗上清液开始载体的浓缩，并利用膜从500mL浓缩到20mL。[0102]将浓缩的产物针对200mL缓冲剂A进行渗滤（目的是渗滤20mL浓缩物10次）。这表示浓缩系数为25X。渗滤液的终体积为1OmL。在这种情况下，浓缩系数为50X。[0103]阴离子交换层析:[0104]在第一种程序中，阴离子交换层析步骤在TFF的下游进行。试验了几种层析基材：整体式柱CIMDDEAE、CIMDQ(BIAseparation,Villach,Austria)，柱体积：lmL;SartobindD75MA，体积：2.1mL(SartoriusStedimBiotech);PorosPI，柱体积：4mL;PorosD50,柱体积：4mL;PorosHQ，柱体积：4mL(LifeTechnologies);Toyopearl650CDEAE，柱体积：2mL(Tosoh)〇[0105]将待试验的柱连接到连接到Biologic-LPchromatograph(Biorad)，所述仪器装备有280UV吸光度读取器，带有电导计、绘图仪（图表记录仪1327，Bi〇-Rad)和分部收集器(2110型，Bio-Rad)。[0106]将所述柱用5倍柱体积(5CV)的缓冲剂A以2mL/min的流速平衡。在将样品装载到柱上之后，取决于所需PH，用5CV的适合的平衡缓冲剂按照表A)清洗柱。然后进行分两步的洗脱：0.3MNaCl，20mMBis-Tris，5%蔗糖，2mMMgCl2(pH6.0)，然后是650mMNaCl，20mMBis-Tris，5%蔗糖，2mMMgCl2(pH6.0)，用于洗脱载体。通过使用适合的缓冲剂(包括例如bis-丙烷、PBS、L-His的缓冲剂），在存在(5%)和不存在5%蔗糖和MgCl2(2mM)的情况下试验了三种其他pH，即pH5.5、7.0和8.0。[0107]最后，将级分直接装载到凝胶过滤柱(排阻层析)上，用于除去污染的盐和在650mMNaCl下随着载体洗脱的蛋白。[0108]在第二种程序中，将澄清的生产上清液不经过任何预备的超滤/渗滤步骤装载到阴离子交换层析柱PorosD上，以便评估在这些条件下层析的得率。所使用的平衡缓冲剂具有5.5的?!1，并含有5%蔗糖和211^1%(：12。[0109]排阻层析:[0110]对于方法A和B(图1)来说，这是除菌过滤之前的最后步骤。该步骤仅包括除去尺寸小于所使用的凝胶的尺寸(例如750kDa或500kDa)的污染物。将Captocore700柱用于这一步骤。这是一种具有双重功能的凝胶:排阻层析和吸附凝胶层析。[0111]在开始载样之前，将柱用1MNaOH消毒并用制剂缓冲剂平衡。将UF/DF产物(方法A)或对应于阴离子交换层析(AXC)的层析峰的级分(方法B)装载在柱上。以0.5mL/min的流速载样8mL(UF/DF或AXC级分）。接下来，以0.5mL/min的流速注入制剂缓冲剂(5CV的制剂缓冲剂）。收集对应于UV峰的级分(约16mL)，然后在0.22μπι滤膜上过滤（除菌过滤）。将样品储存在-8(TC〇[0112]病毒载体的滴定:[0113]通过HCT116细胞的转导，分析带有报告基因eGFP的载体以转导单位(TU)为单位的病毒滴度。在转导后72小时，如以前所描述的(Pfeifer等，2009)，将细胞通过FACS，用于确定以TU/mL为单位的滴度。对于病毒粒子的物理分析来说，使用试剂盒ELISAp24(PerkinElmer)，按照供应商的说明书来定量慢病毒p24的衣壳蛋白。[0114]脐带CD34+血细胞的转导:[0115]通过免疫磁选择(MiltenyiBiotec)，从来自于脐带的血液分离CD34+细胞。CD34+细胞的培养和转导按照已描述的（Charrier等，2011)来完成:首先将细胞在增补有细胞因子的X-Vivo20培养基(Lonza)中预刺激过夜。将预活化的细胞接种在48孔板中（5·104个细胞/100^1)。通过在8yg/mL￥6。1:〇;1^118；[116-1存在下添加10(^1纯化的载体（1061'1])完成转导(Fenard等，2013)。在温育6小时后，在每个孔中添加lmL分化培养基(增补有10%血清的X-VIV0-20，并且如所述(Charrier等，2011)在细胞因子(hSCF、h-Il-3、h-Flt3、h-Il-6)#在下），并且在5天后，通过利用FACS(FC500，BDBiosciences)测量GFP的表达来评估转导效率。[0116]SDS-PAGEWestern￡p迹:[0117]使用SDS-PAGE并通过Western印迹对含有慢病毒载体的培养物样品或纯化的样品进行分析，以便检测p24衣壳蛋白的存在。按照由LI-C0R开发的方法，使用Odyssey装置和Odyssey2.1软件包进行p24蛋白的揭示。所使用的第一抗体是抗p24抗体(Santa-Cruz#SC-57823)，用于检测HIV的p24衣壳蛋白。所述抗体以在0·l%PBSlX-Tween+0dyssey阻断液（1:1)中1/200的稀释率使用。所使用的山羊第二抗体偶联有Li-C0R的荧光染料"Dey800"，并针对所述第一抗体。[0118]残留蛋白和特定残留DNA的定量:[0119]总蛋白通过Bradford方法(Bio-Rad)来定量，使用血清白蛋白作为标准品。试验按照供应商的说明书来进行。[0120]残留DNA:质粒来源的和/或源自于宿主细胞的残留DNA的定量，通过定量PCR来完成。将样品用蛋白酶K(Roche)处理，然后使用下述系统提取DNA:MagNAPureADN和病毒NA小量试剂盒(MagNAPure96Roche)。然后使用针对卡那霉素基因的特异性引物进行定量实时PCR，以便检测质粒来源的残留DNA。为了检测来自于宿主细胞的残留DNA，使用靶向E1A基因的引物。相对于含有通过定量PCR扩增的区域并且拷贝数已知的参比质粒，进行绝对定量。[0121]表A:在方法中使用的缓冲剂[0123]题[0124]本发明涉及一种用于源自于HIV-1或其他反转录病毒的慢病毒载体的新的纯化流程的开发和建立，所述载体通过瞬时转染或使用具有不同包膜糖蛋白例如从稳定细胞例如PG13生产的GaLV-TR、VSV-G、麻疹病毒和γ-反转录病毒载体GaLV的稳定且假型的生产细胞生产，同时确保了纯化的病毒粒子的良好得率和良好质量。这种开发实质上但不排他地基于三种纯化技术:TFF(切向流过滤），阴离子交换层析和排阻层析。其不同组合示出在图1中。[0125]细胞的培养和澄清:[0126]这些步骤包括在定期更换培养基的连续培养中使用以稳定且连续生产反转录病毒载体为特征的稳定细胞例如PG13,和使用为了诱导慢病毒载体的生产必须用3或4种质粒(提供慢病毒的"辅助"功能和重组载体的序列）转染的例如HEK293或HEK293T的细胞，来生产反转录病毒和慢病毒载体。瞬时生产在时间上受限，并且允许在转染后几天收获一次或几次。滴度通常取决于载体的构建(序列），但是也取决于包膜蛋白。使用这些生产系统可以获得下列滴度(表1)。[0127]表1.使用不同生产系统获得的载体的浓度：[0128][0129]在任何进一步的处理之前，可以除去生产上清液中存在的细胞碎片和聚集体。通常，使用〇.45μηι滤膜（乙酸纤维素）。这一步骤的得率为80±5%。然而，本领域技术人员可以使用以类似的性能和得率为特征的其他膜或一系列膜。[0130]切向流过滤:[0131]切向流过滤包括超滤和渗滤两个连续的步骤(UF/DF)。这两个步骤都提供了除去大部分尺寸小于所使用的膜的孔眼的排阻尺寸的污染物的可能性。这个UF/DF步骤还提供了浓缩病毒粒子和减少待纯化的产物体积的可能性。使用孔眼排阻尺寸为750kDa的110cm2的膜(GEHealthCare)。为了开始UF，向经过澄清的产物添加不同浓度的蔗糖(尤其是5%蔗糖(重量/体积））和各种不同浓度的MgCl2(尤其是2mMMgCl2(终浓度））。接下来，使用80mL/min的流速在7psig下进行UF浓缩步骤。将TFF罐置于冰盒中，以确保UF/DF期间的低温。在UF期间已将体积从500mL减小到20mL后，开始渗滤步骤。对于DF来说，使用200mL(浓缩产物的10倍体积）的渗滤缓冲剂:PBS，5%蔗糖，2mMMgCl2。在这个步骤结束时，将20mLUF/DF产物回收在50mLCorning管中。缓冲剂的选择取决于制备物的用途和浓缩/渗滤后的步骤的最适条件（例如：在这种情况下，可以使用其他缓冲剂例如Bis-Tris(pH6.0)，5%蔗糖，2mMMgCl2)(参见表A)。按照Fenard等(2013)的描述将样品在HCT116细胞上滴定。[0132]浓缩/渗滤条件的优化研究：[0133]1.慢病毒粒子具有80至120nm范围内的直径，意味着可用于浓缩/渗滤的膜的孔眼尺寸可以在至多约50nm(或750kDa)的范围内。在本发明的范围内，评估了500kDa和750kDa的截留尺寸。得率(单位为TU)如下：对于750kDa膜来说64%，对于500kDa膜来说单位为TU的得率为34%。[0134]图2示出了在使用截留值为500kDa和750kDa的膜切向流过滤后，载体制备物的电泳凝胶(SDS-PAGE和Western印迹）。除了在使用750kDa膜后获得更高得率之外，显然与使用500kDa膜（图2，第5、6列）相比，750kDa的截留值在除去污染的蛋白质方面具有正面效果（图2，第2、3列）。此外，使用750kDa膜产生的浓缩物含有强度比对粗上清液观察到的低得多的蛋白质条带。[0135]2.考虑到切向流过滤步骤的特征在于产生剪切场，引起反转录病毒/慢病毒粒子的失活，因此必需优化这一步骤，其目的是维持这些载体的功能性。为了针对切向流过滤的不利条件保护慢病毒载体，评估了各种不同浓度的多元醇的添加。[0136]表2.使用各种不同浓度的蔗糖时LV-GaLV-TR的浓缩/渗滤得率。[0138]注：将190mL粗上清液浓缩到17mL，并使用PBS(pH7)+各种不同％的蔗糖和2mMMgCl2渗滤几次。[0139]这些结果清楚地显示出在蔗糖和MgCl2存在下对含有LV-GaLV-TR载体的上清液进行浓缩/渗滤的益处。在蔗糖浓度为2%至5%下获得最佳得率(表2)。[0140]此外，使用中等的蔗糖浓度具有使待浓缩的样品粘度较低的优点，因为高蔗糖浓度(10%-15%)引起粘度提高。[0141]3.pH及其对切向流过滤和有功能载体的得率的影响的评估：[0142]在由本【申请人】提交的申请FR1358909中，显示了在使用6.0的pH后，具有不同包月旲蛋白假型的包I旲载体的生广提尚（最尚2x)。因此决定评估含有慢病毒载体的上清液的pH的选择对切向流过滤的效率的影响。在这种背景下，在GaLV-TR假型慢病毒载体的浓缩/渗滤期间评估了两种不同的pH(pH6和pH7)(表3)从7.0降低到6.0导致得率降低约10%(从73.6%到64%)。然而，这种得率仍然是可接受的，因此可以设想使用酸性pH进行浓缩/渗滤。[0143]表3.待浓缩的上清液/渗滤缓冲剂的pH对GaLV-TR和VSV-g假型慢病毒载体的浓缩/渗滤得率的影响。[0145]4.用于GaLV-TR慢病毒载体的浓缩/渗滤的最佳条件的鉴定：[0146]对于GaLV-TR慢病毒来说，最佳的浓缩/渗滤(切向流过滤)条件如下:在5%蔗糖和2mMMgCl2存在下，将LV-GaLV-TR载体（1L)通过0.45μπι乙酸纤维素膜进行澄清，然后进行TFF步骤(750kDa滤筒，410cm2)以将体积缩减到20mL(50Χ)。然后针对体积为200mL的适合的缓冲剂(例如:Bis-Tris20mMpH6.0,5%蔗糖和2mMMgCl2或PBSpH7.0,5%蔗糖和2mMMgC12)进行渗滤步骤。[0147]对于LV-GaLV-TR载体来说，对于550mL的粗产物初始体积来说，这一步骤的得率为86%±5%。浓缩产物的体积为15mL，浓缩因子为36.6X，并且污染物的去除达到超过90%。[0148]5.建立的切向流过滤条件用于具有不同包膜蛋白假型的其他反转录病毒和慢病毒载体的浓缩/渗滤的评估：[0149]在科学文献中，对各种不同的包膜蛋白进行了评估，其目的在于研究和提高反转录病毒和慢病毒载体的嗜性。在这种背景中，评估了将为GaLV-TR慢病毒载体的浓缩/渗滤建立的条件用于具有各种不同包膜蛋白假型的反转录病毒和慢病毒载体的浓缩/渗滤(表4)。标出了使用GaLV-TR假型慢病毒载体获得的结果作为参比。[0150]表4.具有各种不同包膜蛋白假型的反转录病毒载体的浓缩/渗滤：[0153]注:MLV-GaLV:GaLV假型鼠反转录病毒；LV-GaLV-TR:GaLV-TR假型慢病毒；LV-MV:具有麻疹病毒的env(CMHII修饰的）的假型慢病毒;LV-VSV-g:VSV-g假型慢病毒。[0154]表4中呈现的结果显示，具有不同包膜蛋白假型的所有反转录病毒或慢病毒载体可以在7.0的pH下、在蔗糖和MgCl2存在下浓缩，导致得率在对LV-GaLV-TR来说的约74%到对VSVg来说的约100%的范围内。对于使用6.0的pH来说，对VSVg假型载体没有观察到差异。[0155]对于GaLV-TR假型慢病毒载体来说，已证明这些载体在切向流过滤期间在pH7.0下更加稳定。浓缩/渗滤得率超过90%，而对于GaLV-TR慢病毒载体来说得率在74%左右。[0156]阴离子交换层析：[0157]通过切向流过滤进行的浓缩/渗滤步骤相当大地减少了蛋白质和DNA的载量(参见上文），意味着对于接近层析配体而言可能是待纯化的载体的竞争物的污染物的显著部分被减除。原则上，根据后续用途，可以想象用于所设想的纯化的两种不同方式。它们被示出在图1中：使用单一排阻层析步骤的简化方法（图1中的A)，和旨在制备用于临床用途的慢病毒载体的使用额外的阴离子交换层析步骤的更精细复杂的方法(图1中的B)。[0158]随后开发了不同的层析可能性：[0159]在TFFUF/DF步骤之后，并且为了减少污染物并良好地分离病毒粒子，添加阴离子交换层析步骤。这种技术允许依靠pH和盐浓度，根据生物分子的等电点来分离它们。因此，在给定的pH值下，为了脱掉持留的生物分子需要一定的盐浓度(通常为NaCl)，并且这种浓度必须根据生物分子与配体之间的相互作用力来选择:这种相互作用越强，盐浓度（盐度）必须越高。此外，层析缓冲剂的pH越接近待纯化的生物分子物质的等电点，从层析配体脱离所述生物分子所需的盐越少。然而，已知反转录病毒和慢病毒载体依赖于盐浓度快速失去它们的感染度(被Segura等，2006综述）。因此，在第一阶段中，评估了慢病毒载体针对不同NaCl浓度的稳定性。[0160]1.盐度对GaLV-TR慢病毒载体的稳定性的影响：[0161]正如上文指出的，被层析柱持留的生物分子的洗脱，通常使用盐梯度(含有NaCl的缓冲剂)或提高盐浓度(NaCl)的步骤来实现。因此，为了评估NaCl浓度的影响，在50mM至1，500mM范围内的不同NaCl浓度中，在室温下进行了4h的TFF后慢病毒载体的温育试验。图3示出了在室温下慢病毒载体的感染性随NaCl浓度的变化，并与不添加任何NaCl或相同的载体制备物在4°C下温育并且不添加NaCl的条件进行比较。这个试验清楚地显示，50mM至1M之间的NaCl浓度对GaLV-TR慢病毒载体的稳定性具有中度不利的影响，其中感染性的损失在29.52%(50mMNaCl)至43.86%(1MNaCl)的范围内（相对于在4°C下储存的制备物的百分率）。另一方面，当将载体制备物在室温下储存4h时，1.5M的NaCl浓度引起感染性损失63.8%。应该指出，在不添加NaCl的情况下在20°C(室温)储存4h，与在4°C储存相比，也引起载体感染性的一定程度的损失，约为23%。[0162]这些结果意味着使用可能的最低盐度洗脱层析基材的GaLV-TR慢病毒载体是绝对必要的，因此为了维持最大感染性，理想的是低于1M的NaCl。此外，在低温(理想地在4°C至l〇°C之间）下进行整个纯化(所有步骤），也是优选的。[0163]2.不同阴离子交换层析基材(AEX)的评估：[0164]我们使用低阴离子交换层析基材(DEAD(D))，以便确定使用这种类型的基材是否可以限制载体的失活，特别是通过尝试降低从层析柱脱离所述载体所需的盐浓度。在使用来自于PG13细胞(MLV-GaLV)培养物的浓缩上清液的初步试验中，可以显示使用基于DEAE的层析基材(TosohTSK凝胶DEAE5PW)产生约71%的感染性载体得率，高于使用强交换剂(来自于GEHealthcare的QSepharoseFF)期间仅仅16%的得率，后一种情况是由于过强的相互作用在洗脱期间引起失活。在这个实例中，脱离反转录病毒载体所需的盐浓度分别为655mM和915mM。[0165]在这些结果的基础上，选择低阴离子交换剂继续开发：评估了几种层析基材：MonolitheCIMD(DEAE)，PorosD50(LifeTechnologies),SartobindD(Sartorius)(Bandeira等，2〇l2)，Toyopearl6f50CDEAE(Merten等，2〇11)〇[0166]与初步试验相同，对三种基材进行评估，目的是在5.5或6.0和7.0的pH下纯化GaLV-TR慢病毒载体。对于在5.5或6.0和7.0的pH下试验的所有基材来说，低的pH选择(5.5或6.0)对于感染性载体得率来说是有益的：对于CMDDEAE基材来说，在将用于层析的缓冲剂的pH从7.0降低到6.0期间，得率从23%(pH7.0)提高到64%(pH6.0)(图4)。对于基材Sartobind75D(得率从5.8%提高到15.6%)和PorosD(得率从32%(pH7.0)提高到80·2%(ρΗ6.0)和约100%(pH5.5))以及凝胶Toyopearl650C(得率从23%(pH7.0)提高到89%(pH5.5))来说，观察到类似的结果（图4)。此外，为了从基材脱离载体，在pH6.0下在层析期间洗脱缓冲剂的盐度可以更低（因此对慢病毒载体更温和）。对于在pH6.0下使用的基材PorosD来说，载体的洗脱在650mMNaCl下完成(参见下文）。就总体效率而言，"现代的"基材(更近些时候开发的，在层析期间产生降低的剪切力(本质上是由于比其他基材更大的孔隙率)并且以在缓冲剂流速改变期间基材的不可压缩性为特征，例如monolithCMDDEAE或PorosD)与具有膜的基材(Sartobind75D)或基于可压缩凝胶的基材(Toyopearl650C)的得率相比，表现出更高的得率。[0167]最后，在最近的基材上做出选择，因为与更常规的基材相比它们分离和回收载体的效率更高。因此对这两种承载物(support)进行了更广泛评估，并优化了它们在纯化慢病毒载体中的使用。两种承载物(ΠΜDDEAE和PorosD都具有超过60%的令人感兴趣的得率。洗脱在650mMNaCl，Bis-Tris，5%蔗糖，2mMMgCl2，pH6.0下发生。将洗脱缓冲剂的pH提高到7.0(PBS)导致得率降低到低于7%的值，但是向PBS添加5%蔗糖导致从约7%显著提高到40%。然而，在这种情况下，必需使用超过1M的NaCl浓度。事实上，观察到对于pH7.0来说，为了洗脱载体(不含额外的蔗糖的缓冲剂），在PBS中必需存在1.5MNaCl，这可能是低得率的解释。盐浓度对病毒粒子的稳定性的负面影响是已知的(Segura等，2005)。[0168]3.使用基材PorosD时不同pH值对层析效率的影响的评估：[0169]在存在和不存在5%蔗糖的情况下，将pH在5.5至8.0的范围内变化。当pH高于5.5时，5%蔗糖的存在对阴离子交换层析步骤期间的得率具有正面效果（实例:P〇r〇sD)(表5)。在pH5.5下，不再观察到蔗糖的存在对得率的正面效果。另一方面，在pH8.0下，为了回收约58%的感染性载体，蔗糖的存在是必不可少的。然而，在使用6.0至7.0范围内的pH期间，得率在52至65%之间，在5.5的pH下获得最佳得率(约100%)。[0170]通常，5%蔗糖的存在导致开始慢病毒载体的洗脱所需的盐度降低，其中NaCl浓度的所需降低约为25mM。[0171]表5.在存在或不存在蔗糖的情况下，使用各种不同pH(5.5-8.0)的缓冲剂在PorosD上层析的LV-GaLV-TR得率的比较。[0173]4.包含阴离子交换层析作为第一步骤的可替选程序的评估：[0174]我们评估了在澄清步骤后立即进行阴离子交换层析步骤后获得的得率。在这些条件下，观察到的得率低于在澄清与阴离子交换层析之间进行超滤/渗滤步骤时的得率。因此选择后一种程序用于后续的纯化。[0175]排阻层析:[0176]排阻层析是一种按照生物分子的分子尺寸来分离它们，从而允许将粒子与污染物分离开的选择方法。[0177]使用过滤凝胶CaptoCore700(GEHealthcare)，但是也可以设想其他基材。这个步骤允许我们用所需的制剂缓冲剂替换前一步骤的缓冲剂，以除去尺寸小于750kDa的污染物分子并避免稀释待装载的样品。这个层析步骤可以在切向流过滤(浓缩/渗滤-方法A)后或离子交换层析步骤(方法B)后直接使用（图1)。将来自于切向流过滤的样品或来自于阴离子交换层析的含有慢病毒载体的级分的样品装载到排阻层析柱上。在两种情况下，按照被保留以备后续使用的级分，这一步骤的得率为86%±4。[0178]图5示出了通过在凝胶(CaptoCore700)上过滤进行的慢病毒载体的纯化(通过切向流过滤进行浓缩和渗滤）。载体的洗脱峰存在于缓冲剂的通过前锋处并在级分4-9处离开柱子，其覆盖最初装载在柱上的载体量的约70%(图5a)。图5B和5C示出了每个级分的电泳分析(Western印迹，SDS-PAGE)，清楚地表明不存在污染条带（图5c)并且在24-25kDa处存在对应于慢病毒载体的衣壳的P24蛋白的条带。[0179]得率和纯度:[0180]最重要的参数涉及在污染的蛋白质和污染的DNA的载量减少下慢病毒载体制备物的总体得率和纯度。[0181]对于旨在纯化用于临床用途的慢病毒载体的程序B(包括TFF、阴离子交换层析(AEX)和排阻层析(SEC))(图1)来说，得率约为50%，并且这一程序允许除去99.9%的污染的蛋白质和99.9%的污染的DNA。[0182]旨在纯化用于研究的慢病毒载体的程序A(包括TFF和排阻层析(SEC))(图1)较为简单，因为它没有离子交换层析步骤。由于纯化步骤的数量减少，总体得率更高并达到60.2%，这种简化程序的残留DNA污染物的去除在96.17%的量级上，并且观察到污染的蛋白质减少99.63%。[0183]靶细胞的转导的实践例：[0184]⑶34+细胞的转导:[0185]为了确定纯化的载体的质量，对脐带血细胞CD34+进行转导。在用细胞因子预先刺激18小时后，将细胞融化。转导进行6小时。接下来，将细胞置于分化培养基中5天。然后将细胞通过FACSFC500(BDBiosciences)，以测量GFP表达的百分率。典型地获得下述结果（图6):通过浓缩/渗滤进行的慢病毒载体(GaLV-TR)的纯化导致CD34+细胞的转导效率(表示为表达GFP的细胞的百分率)从使用粗上清液时的9%提高到使用浓缩/渗滤过的LV载体制备物时的70%。[0186]利用麻疹病毒的修饰的包膜的假型慢病毒载体的纯化[0187]在这里描述了一种利用麻疹病毒的修饰的包膜糖蛋白的假型慢病毒载体(MV假型）的纯化方法。将按照上面指示的程序生产的LV-MV-CMHII(CMHII=抗CMHII)慢病毒载体，按照下面的步骤进行纯化：[0188]1)利用TFF步骤的浓缩/渗滤[0189]-所使用的膜:GE#UFP-750-E-3MA110cm2,用于纯化1升产物[0190]-渗滤缓冲剂:PBS((pH7.0)，2mMMgCl2,5%蔗糖）[0191]-体积缩减:从500mL/l，000mL到20mL，缓冲剂被替换为渗滤缓冲剂[0192]-感染性载体的得率:64-70%[0193]2)排阻层析(凝胶过滤）：[0194]-所使用的柱：CaptoCore7004.7mL[0195]-制剂缓冲剂:PBS，5%蔗糖，2mmMgCl2,或者X-vivo或HANKS，含有5%蔗糖和2mMMgCl2[0196]-柱子用10CV的制剂缓冲剂平衡[0197]-将来自于TFF的浓缩物以0.5mL/min的流速装载在CaptoCore700柱上[0198]-用20CV的制剂缓冲剂清洗柱子[0199]-收获对应于0D峰的样品（在50X时体积为21mL)[0200]-感染性载体的得率：以TU计>90%[0201]这一纯化的总体得率为60至63%的感染性载体，这代表了纯化以及因此利用修饰的MV糖蛋白的假型慢病毒载体的使用的巨大进步。[0202]参考文献[0203]-AnlikerB，AbelT，KneisslS,HlavatyJ,CaputiA，BrynzaJ，SchneiderIC，MunchRC，PetznekH，KontermannRE，KoehlU，JohnstonIC,KeinanenK,MullerUC,HohenadlC，MonyerH，CichutekK，BuchholzCJ(2010)使用慢病毒载体向神经元、内皮细胞和造血祖细胞的特异性基因转移（Specificgenetransfertoneurons，endothelialcellsandhematopoieticprogenitorswithlentiviralvectors)?Nat.Methods7:929-935。[0204]-AnsorgeS，Henry0，KamenA(2010)慢病毒载体大规模生产的最新进展（Recentprogressinlentiviralvectormassproduction)，Biochem.Eng.J.48:362_377〇[0205]-BandeiraV，PeixotoC，RodriguesAF，CruzPE，AlvesPM，CoroadinhaAS，CarrondoMJT(2012)慢病毒载体的下游处理：松开瓶颈（Downstreamprocessingoflentiviralvectors:releasingbottlenecks)?Hum.GeneTher.Methods.23:255_263〇[0206]-CharrierS，FerrandM，ZerbatoM，PrecigoutG，ViorneryA，Bucher_LaurentS，Benkhelifa_ZiyyatS，Merten0_W，PereaJ，GalyA(2011)在单个造血系集落形成细胞中慢病毒载体拷贝数的定量显示出对转导频率和水平的载体剂量依赖性效应(Quantificationoflentiviralvectorcopynumbersinindividualhematopoieticcolony-formingcellsshowsvectordose-dependenteffectsonthefrequencyandleveloftransduction)，GeneTher.18:479-487.[0207]-ChristodoulopoulosI，〇81111〇11，？1(2001)长臂猿白血病病毒包膜蛋白的细胞质尾部中的序列阻止它并入到慢病毒载体中（Sequencesinthecytoplasmictailofthegibbonapeleukemiavirusenvelopeproteinthatpreventitsincorporationintolentivirusvectors)?J.Virol.75:4129-4138〇[0208]-GreeneMR,LockeyT,MehtaPK,KimYS,EldridgePff,GrayJT,SorrentinoBP(2011)用通过稳定细胞系在临床规模上生产的用于SCID-X1的自失活慢病毒载体转导人类CD34+种植细胞（TransductionofhumanCD34+repopulatingcellswithaself-inactivatinglentiviralvectorforSCID-Xlproducedatclinicalscalebyastablecellline)，Hum.GeneTher.Methods23:297-308。[0209]-FenardD，IngraoD，SeyeA，BuissetJ，GenriesS，MartinS，KichlerA，GalyA(2013)VeCt〇fusin-l这种新的病毒进入增强剂强烈促进人类造血干细胞的慢病毒转导(Vectofusin-1,anewviralentryenhancer，stronglypromoteslentiviraltransductionofhumanhematopoieticstemcells)?Mol.Ther.NucleicAcids2:e90〇[0210]-FrechaC，SzecsiJ，CossetFL，VerhoeyenE(2008)用于慢病毒载体定向的策略（Strategiesfortargetinglentiviralvectors)?Curr.GeneTher.8: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