使用锁式探针的基于rca的局部扩增方法

文档序号:10617469阅读:824来源:国知局
使用锁式探针的基于rca的局部扩增方法
【专利摘要】本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法,其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物,所述方法包括:(a)提供包含重复单体的多联体第一RCA产物;(b)将包含靶互补3’和5’末端区的可环化的寡核苷酸与所述第一RCA产物的单体直接或间接杂交,以便所述寡核苷酸的3’和5’末端并置地杂交以彼此直接或间接地连接,其中所述靶为所述第一RCA产物的单体或与其杂交的中间分子中的序列,并且其中所述可环化的寡核苷酸的靶互补末端区的长度为6个至16个核苷酸;(c)将所述可环化的寡核苷酸的末端直接或间接连接以环化寡核苷酸,从而提供用于第二RCA反应的模板,其中当所述末端间接连接时,(i)提供在可环化的寡核苷酸的3’与5’末端之间与第一RCA产物的单体杂交,以便其可连接于各自末端的间隙寡核苷酸,或通过聚合酶延伸可环化的寡核苷酸的杂交的3’末端以便延伸的3’末端可连接于杂交的5’末端,并且(ii)与单体直接或间接杂交的第二RCA模板的区域的总长度不长于32个核苷酸;和(d)使用(c)的所述第二RCA模板和用于所述第二RCA的引物进行第二RCA反应,以形成第二RCA产物,其中在所述第二RCA反应中,所述第二RCA模板保持附着于第一RCA产物,从而第二RCA产物附着于所述第一RCA产物。
【专利说明】
使用锁式探针的基于RCA的局部扩増方法
技术领域
[0001] 本发明总体上属于利用滚环扩增(RCA)的核酸扩增领域,具体属于在至少两轮扩 增中产生基于RCA的局部高度线性扩增的构思。第二(或进一轮)RCA反应的产物并非以物理 方式源自第一(或更早的)RCA产物,并且第二轮或进一轮的RCA扩增提供了用于放大可从滚 环扩增反应获得的信号的方式。本发明的方法包括通过第二单独的RCA模板的RCA产生第二 RCA产物。第二RCA模板由所谓的锁式探针提供,所述锁式探针是可环化寡核苷酸,其以使所 述寡核苷酸的末端可直接或间接相互连接以形成与第一 RCA产物拓扑连接(成链或"连锁") 的环化寡核苷酸的方式与第一 RCA产物杂交。与预期相反,发现可能实现与第一 RCA产物拓 扑连接的此类锁式探针的高效RCA,即有用水平上的RCA。由于第二RCA模板物理附着于第一 RCA反应的产物,并且被延伸以形成第二RCA产物的用于第二RCA的引物附着(杂交)于和保 持附着(杂交)于第二RCA模板,因此可获得其中第二RCA反应的产物附着于第一反应的产物 的局部扩增反应。本发明提供了此类方法,并且在来自基于检测RCA产物的检测测定的信号 的放大中特别有用。
【背景技术】
[0002] 滚环复制(RCR)是实质上用于环状DNA分子诸如质粒或病毒的复制的机制。该反应 已被采用作为用于扩增环状分子的实验室方法的基础,并且已被证实可用于多种使用或产 生环状核酸分子作为报告分子的测定中,其中通过RCA扩增(复制)环状分子,并且检测复制 或扩增的环状核酸分子。在其它方法中,可通过RCA来环化并扩增所需分子或靶分子。因此, 滚环复制(RCR)现在通常被称为滚环扩增(RCA),并且这些术语在本文中可互换使用。
[0003] RCA涉及使用环状单链核酸分子例如寡核苷酸作为滚环模板,并使用链置换聚合 酶延伸与所述环状模板杂交的引物(所述链置换活性置换引物并有效地使环"滚动")进行 的核酸分子的合成。引物在某些典型测定中可由靶核酸(RNA或DNA)分子提供。聚合酶和核 苷酸的添加启动合成反应,即聚合。由于滚环模板是无尽的,因此所得产物是由与滚环模板 互补的串联重复组成的长单链核酸分子(即多联体)。
[0004] 实际上,RCA反应通常利用线性核酸分子,例如寡核苷酸诸如在下文中更详细描述 的锁式探针,通常通过例如使用连接酶将所述核酸分子的末端连接在一起来操纵所述核酸 分子以产生环状核酸模板分子。例如,可通过与用作连接模板的祀核酸分子上的相邻序列 杂交来将核酸分子的末端彼此接近。环状核酸分子的形成使得其在RCA反应中能够被拷贝。 该反应可通过向封闭环添加引物来引发,或可从靶核酸分子即连接模板产生引物。初始引 物从而形成RCA产物的部分。这可以是特别有利的,因为其可允许对靶核酸进行局部检测, 即在其中固定用于引发RCA的核酸分子的实施方式中,所述RCA产物也将被固定。
[0005] 因此,RCA产物可保留作为核酸环的一串串联重复互补拷贝(多联体),其对于原位 检测是特别有用的,但也可在均相("溶液中")测定中被检测到。例如,RCA反应可在仅1小时 内导致环的1000倍扩增(基于由约100个核苷酸组成的环)。因此,环状寡核苷酸的RCA可产 生形成直径可为约Ιμπι的DNA束或"串滴(blob)"的RCA产物。所述产物(即串滴)可通过缀合 于荧光标记的核酸探针的杂交来检测,所述杂交允许通过荧光显微镜术或流式细胞术使串 滴可视化。在其它实施方式中,可通过用限制性内切酶或核酶进行消化来将RCA产物还原成 单体,随后检测所述单体。
[0006] 由于RCA反应产生可容易检测的信号的能力,因此其用作用于检测样品中的任何 核酸分子的报告系统,所述核酸分子可以是革G核酸分子(即待检测的核酸分子,或其中所述 核酸分子是测定的"分析物"),或其可以是待检测作为靶分析物存在的标志物(或替代物) 的核酸分子。因此,RCA反应已被用于直接检测细胞和组织样品中的靶核酸,例如核酸分子 的原位(即局部)检测,这对于研究和诊断目的具有重大意义。然而,RCA测定不限于用于非 均相形式,而且还可用于均相测定(参见例如W0 2009/037659)。
[0007] RCA也已被用于用于检测其它分析物,即除核酸分子外的分析物诸如蛋白质、肽等 的方法。在这方面,已开发了多种测定法,其中核酸分子可用于直接或间接标识或标记样品 中的靶分析物,并且所述核酸分子的检测用于指示分析物在样品中的存在。在一些方法中, 当一种或多种分子与靶分析物相互作用(例如,结合)时,可在样品中产生新的核酸分子(即 不存在于原始样品中并且不是添加至样品的组分之一的核酸分子)。所产生的核酸分子的 检测指示样品中的所述分析物。
[0008] 在本领域中详尽描述了基于使用RCA反应作为检测策略的部分来检测此类替代物 或标志核酸分子的各种方法,包括例如免疫-RCA、使用锁式探针的测定和产生环状核酸分 子的接近式探针的测定。在所有这些情况下,所述方法依赖于提供或产生随后可用作RCA反 应的底物(模板)的环状核酸分子,并且RCA产物随后可被检测作为用于直接检测靶分析物 的替代物。
[0009] 免疫-RCA包括利用核酸分子标记特定靶分析物的抗体。通常,靶分析物例如被第 一抗体捕获在底物上,并与抗体:核酸复合物接触。将环状(或可环化的)寡核苷酸与缀合于 所述抗体的核酸分子杂交(可预先杂交所述寡核苷酸,或在已使抗体与靶分析物相互作用 后添加所述寡核苷酸)。可在将样品经历RCA以扩增环状/环化的寡核苷酸之前洗掉过量的 抗体。缀合于抗体的核酸分子用作RCA的引物。因此,RCA产物被系连于与靶分析物相互作用 的抗体,从而允许局部检测样品中(例如细胞或组织样品中)的分析物。
[0010] 接近式测定依赖于〃接近探测〃的原理,其中通过多个(即2个或更多个,通常2个或 3个)探针的结合来检测分析物,所述探针,当通过结合于分析物而被拉近(从而称为"接近 式探针")时,允许信号产生。通常,接近式探针的至少一个包含连接于探针的分析物结合域 的核酸域,并且信号的产生牵涉核酸部分和/或由其它(多个)探针携带的其它功能性部分 之间的相互作用。因此信号的产生取决于探针之间的相互作用(更具体地讲是通过核酸或 由它们携带的其它功能性部分/域进行),并因而仅当探针已结合于分析物时才发生,从而 赋予检测系统提高的特异性。近年来接近探测的构思已得到发展,并且许多基于该原理的 测定现在本领域中是公知的。例如,接近式连接测定(PLA)依赖于接近式探针与分析物的靠 近结合,以从牵涉接近式探针的核酸域的或由所述核酸域(例如在其之间和/或以其为模 板)介导的连接反应产生信号。
[0011]接近式探针的核酸域在接近时,基于所谓的锁式探针原理(如例如由Landegren等 人在W0 99/49079中描述的),可作为一个或多个添加的寡核苷酸的彼此连接(包括分子内 连接)的模板来环化一个或多个添加的线性寡核苷酸,从而形成核酸环。在此类方法中,通 过与由一个或多个接近式探针的核酸域提供的一个或多个环化模板杂交使(多个)添加的 线性寡核苷酸的末端并置以便连接。各种此类测定式描述于W0 01/61037中。
[0012]因此明显的是,RCA可在样品中任何核酸分子的特异性检测中具有效用,无论其为 样品中的"原始"靶分析物,还是其为通过特定检测分子(例如接近式探针)与靶分析物(例 如蛋白质)的相互作用产生的"替代"靶分析物。RCA还可用于检测扩增的核酸分子。例如,在 其中靶核酸分子以低量存在的样品(例如稀有转录物)中,RCA可用于通过增加可用于被检 测的核酸的量来"增强"检测。
[0013]已提出基本RCA反应的各种改进,包括提供尚度线性扩增,例如以提尚基于检测 RCA产物的测定的灵敏度。
[0014] 这些方法中的许多方法包括进一步扩增在第一RCA反应中产生的信号,即基于第 一 RCA产物的扩增。一般地这些方法集中在使用第一 RCA反应的产物作为引物延伸的模板的 技术上。例如,在超分支RCA反应(HBRCA)中,引物与通过第一RCA反应产生的多联体RCA产物 中的每一个串联重复杂交。随后使用第一 RCA产物作为模板延伸引物。随着每一个引物被延 长,其遇到下游引物的产物并置换其以产生原始第一 RCA反应产物的序列的单链串联重复。 此外,第一 RCA反应的引物可随后与产生的(被置换的)单链中的串联重复杂交,并延伸以形 成另外的置换链,依此类推。因此,交替的链拷贝和链置换过程产生DNA分支的连续扩展模 式,并且依靠链置换,还产生一组离散的包含具有环的单位长度及其多倍长度的双链小片 段的游离DNA片段。这由Lizardi在Nature Genetics 1998,19,225-2323和W0 97/19193中 进行了描述。
[0015] 类似方法是DNA级联反应,如由Koch在W0 97/20948中描述的,但在该情况下引物 延伸时间受到控制,以使链的拷贝不进行至末端,并且被置换的链仍然附着于模板(RCA产 物)。
[0016] 在W0 03/012199中,描述了基于重复RCA反应的称为环对环(circle-to-circle) (C2C)法的方法,该方法还可用于扩增从第一 RCA反应产生的信号。同样,第一代RCA产物用 作用于延伸与所述产物杂交的引物的模板。然而,在该方法中,第一代RCA产物被切割成单 体(每一个单体对应于多联体产物中的一个串联重复),所述单体被环化,并随后在进一轮 RCA中用作RCA模板。由于在该方法中第一RCA产物被切割,因此第二RCA产物不可能局限至 第一产物。
[0017] 虽然已描述了基于进行初始RCA产物的二次扩增的用于信号放大的方法,但存在 对开发具有增强的灵敏度和/或性能,例如具有更强的信号、更快的信号产生和/或提高的 信噪比的测定的持续需要。特别地,存在对开发其中第二信号可被局限于第一信号的测定 (例如(但不仅仅)在原位检测方法的情况下)的需要。在某些情况下将基于初始检测产物的 信号检测偶联和共局限于基于二次检测产物的信号检测可以是有用的或需要的。

【发明内容】

[0018] 本发明涉及解决此需求,并且基于进行第二RCA反应的构思,所述第二RCA反应取 决于第一 RCA反应,但不扩增第一 RCA产物,以放大可通过第一 RCA反应产生的信号(换句话 说,以通过第二RCA产生更多的可被检测到以产生信号的〃信号产物〃)。本发明的方法的重 要特征是第二RCA产物物理附着于第一RCA产物并且保持所述附着,以使来自第二RCA产物 的信号被局限于第一RCA产物。
[0019] 在US 5,854,033中,Lizardi描述了称为巢式连接介导的RCA(巢式LM-RCA)的方 法。LM-RCA包括基于与锁式探测类似的原理产生RCA产物,其中可环化的寡核苷酸(称为〃开 环探针",但实质上为锁式探针)与靶核酸序列(如果存在的话)杂交,随后被连接以形成环。 连接后,引物与所述环杂交,并且进行RCA反应以产生包含环的串联重复的互补拷贝的线性 RCA产物(称为"串联序列DNA; TS-DNA)。在巢式LM-RCA反应中,建议的是,为了放大信号,可 将另外的可环化的寡核苷酸与TS-DNA杂交,连接,随后经历第二轮RCA。然而,此类反应的实 际性能未被证明,此外,建议在此类方法中,在RCA反应过程中,环化的寡核苷酸可被置换, 从而与其靶(与所述环化寡核苷酸杂交的)分离。因此,对于其中期望局限化信号的原位方 法,US 5,854,033提出了其中连接第一可环化的寡核苷酸(00?)但不进行扩增,并且将第二 可环化的寡核苷酸与所述第一环化的寡核苷酸(OCP)杂交的替代方法。因此,迄今还不相信 结合于第一 RCA产物的锁式探针(TS-DNA)的RCA会导致局部第二RCA反应。
[0020] 此外,迄今已相信,在其靶分子上的环化的锁式探针的拓扑联接可抑制RCA,(见 Baner等,1998Nucleic Acids Research 26(22) ,5073-5078)。此类拓扑抑制可通过切割革巴 分子以生成靠近环化的且成链的锁式探针的靶3'末端来减弱,这允许RCA继续。因此,被认 为不可能的是可进行基于结合于第一 RCA反应产物的锁式探针的局部第二RCA反应。
[0021] 基于该信念,本发明的发明人转而开发了称为超级RCA(sRCA)的局部第二RCA法, 其中将引物与第一 RCA产物杂交,并用于扩增本身不结合或杂交于第一反应产物的第二RCA 模板环(分别于2012年11月14日和2013年5月23日提交的英国专利第1220503.5和 1309327.3号,对应于W0 2014/076209 A1)。
[0022] 然而,与预期相反,通过适当的反应设计,发现实际上可能开发使用锁式探针的基 于局部第二RCA的扩增法。具体地,令人惊讶地发现通过减小锁式探针的靶杂交部分(区域) (即探针的靶互补末端区,g卩3 '和5 '末端序列)的大小,可能对第一RCA产物上的结合并成链 的(即"连锁的")的锁式探针进行RCA反应。此外,如将在下面实施例中更详细描述的,可获 得的结果显示扩增产物产生的量和/或速率足以表明沿着第一 RCA产物的长度结合的多个 锁正被复制(经历RCA)。因此,据信,通过使用具有特定大小范围的靶结合位点(靶互补区) 的锁进行第二RCA反应,可获得沿第一 RCA产物的长度结合的多个锁的第二RCA,并且不只是 结合于第一 RCA产物的游离末端上的一个锁的第二RCA。
[0023] 如上所提及的,通过环化的锁的RCA产生第二RCA产物,所述环化的锁用作用于第 二RCA反应的模板。可提供RCA引物来与锁式探针预杂交,或可在锁式探针已与第一 RCA产物 杂交后,或在锁式探针环化(连接)后添加所述RCA引物。通过RCA引物的延伸产生第二RCA产 物,所述RCA产物通过其与用于第二RCA的模板杂交而与第一 RCA产物间接杂交,从而附着于 所述第一 RCA产物。第一 RCA产物是包含第一 RCA反应的模板环(〃第一 RCA环〃)的串联重复互 补拷贝的多联体,并且提供用于第二RCA的RCA模板的锁式探针被设计来结合在整个第一 RCA产物中重复的其同源探针-结合序列的重复拷贝。换句话说,第一RCA产物将包含用于锁 式探针的重复结合位点(每一个串联重复(多联体的"单体")中至少一个)。每一个此类锁, 当环化时,可作为第二RCA反应的模板,从而导致增加的(高度线性)扩增。
[0024]本发明的方法允许第二RCA被局限于第一RCA。如将在下文中进一步解释的,这在 靶分析物的局部(空间)检测中(例如,在原位检测方法中)可具有益处。
[0025]由第二RCA反应提供的强信号放大可增强方法的灵敏度并且提供容易地检测RCA 产物或使其可视化(例如在低显微镜放大倍数下,或利用数字成像扫描法,或可能甚至无需 借助显微镜)的能力。来自增加的量的第二RCA产物的强信号还可打开在RCA基检测测定中 使用其它检测方式(例如流式细胞术)的可能性,从而增加可能用于这些测定的仪器基础。 可以甚至通过可能的第三代或进一代RCA(其全都依靠用于每一代RCA的模板来联系,所述 模板,通过结合先前的RCA反应的RCA产物,使先前的RCA产物与下一代RCA产物发生联系)来 进一步增强信号放大。
[0026] 此外,由于可在第一RCA反应过程中(即当第一RCA产物形成时,或当第一RCA反应 正在进行时)启动第二RCA反应,因此可实现更快的信号产生,从而导致更快速的测定。
[0027] 鉴于该两代以上RCA的偶联产生增强的和更快的信号放大以及使用锁式探针来提 供用于连续RCA反应的RCA模板,我们已将该新方法称为锁式超级RCA(锁式sRCA)。
[0028] 因此,在第一方面,本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方 法,其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一 RCA反应的产物,所述方法包括:
[0029] (a)提供包含重复的单体的多联体第一 RCA产物;
[0030] (b)将包含靶互补3 '和5 '末端区的可环化的寡核苷酸与所述第一 RCA产物直接或 间接杂交,以便所述寡核苷酸的3'和5 '末端并置地杂交以彼此直接或间接地连接,其中所 述靶为所述第一 RCA产物的单体或与其杂交的中间分子中的序列,并且其中所述可环化的 寡核苷酸的祀互补末端区的长度为6至16个核苷酸;
[0031] (c)将所述可环化的寡核苷酸的末端直接或间接连接以环化寡核苷酸,从而提供 用于第二RCA反应的模板,其中当所述末端间接连接时,(i)提供在可环化的寡核苷酸的3' 与5'末端之间与第一RCA产物的单体杂交,以便其可连接于各自末端的间隙寡核苷酸,或通 过聚合酶延伸可环化的寡核苷酸的杂交的3 '末端以便延伸的3 '末端可连接于杂交的5 '末 端,并且(ii)与单体直接或间接杂交的第二RCA模板的区域的总长度不长于32个核苷酸。 [0032] (d)使用(c)的所述第二RCA模板和用于所述第二RCA的引物进行第二RCA反应,其 中在所述第二RCA反应中,所述第二RCA模板(环化的寡核苷酸)保持附着于第一RCA产物,从 而第二RCA产物附着于所述第一 RCA产物。
[0033] 因此,在步骤(d)中,第二RCA产物(延伸的第二RCA引物)与第二RCA模板杂交,从而 经由或通过第二RCA模板附着于第一RCA产物。换句话说,由于其与第二RCA模板杂交,因此 第二RCA产物间接附着于第一 RCA产物。因此,第二RCA模板在第二RCA反应过程中没有从第 一 RCA产物被置换的事实促使第二RCA产物附着于第一 RCA产物。
[0034] 可同时或相继地进行步骤(a)、(b)、(c)和(d),但优选相继地进行它们。
[0035] 从本发明的上述定义将认识到的是,可环化的寡核苷酸实际上是锁式探针。即,可 环化的寡核苷酸是线性单链核酸分子,如例如图1中所描绘的,其在其3 '和5 '末端包含靶互 补区。具体地,可环化的寡核苷酸不具有二级结构,更具体地不包含分子内双链区或茎-环 结构。使用第一 RCA产物或与其杂交的中间分子作为连接模板直接或间接地将环化的寡核 苷酸的各自的5 '和3 '末端连接在一起,从而直接形成用于第二RCA反应的环状模板(即第二 RCA模板通过连接反应直接形成)。更具体地,不存在寡核苷酸的切割的间插步骤来形成第 二RCA模板。
[0036]当通过连接环化寡核苷酸(探针)时,其与已与其结合(杂交)的分子,即与第一 RCA 产物或与其杂交的中间核酸分子拓扑地连接或成链。在过去,据信可环化的锁式探针的RCA 可导致探针的置换,但我们已观察到在本发明的方法中,锁没有被置换并且保持附着于它 们的靶(例如,第一 RCA产物)。然而不希望受理论束缚,据信锁式探针与靶分子中存在的多 个结合位点(例如,多联体第一 RCA产物(或与其结合的中间分子)的串联重复单体的每一个 中的至少一个)的串联结合阻止或限制环化的和结合的(成链的)锁沿着核酸链的扩散。此 外,沿靶分子结合的多个锁的存在将阻断(即阻止或抑制)在作为模板的第一 RCA产物上的 任何不需要的延伸)。每一个结合的锁式探针实际上将起着置换阻断的作用,阻止或限制置 换下游锁式探针的任何不需要的延伸。此类不需要的延伸可以例如从未连接的锁式探针或 存在于反应混合物中的与第一 RCA产物非特异性杂交的其它核酸分子发生。
[0037]为了保持第二RCA产物至第一 RCA产物的局限化,第二RCA模板(环化的寡核苷酸) 保持(直接或间接)附着于第一 RCA产物的事实是非常重要的。如上所指出的,因此本发明的 方法的特征是使用第一 RCA产物作为模板的延伸不能发生或确实发生的任何延伸受到限制 以便不存在任何下游环化的寡核苷酸的置换。更具体地,本发明的进一步特征是使用第一 RCA产物作为模板进行的任何未连接的可环化的寡核苷酸或任何未连接的间隙寡核苷酸 (如果存在的话)的任何延伸受到限制,以避免下游环化的寡核苷酸的置换。如上所解释的, 连接的和成链的锁式探针起着阻止任何进一步延伸和任何下游探针的置换的阻断的作用。 成链的锁实际上是延伸和/或置换阻断。
[0038] 延伸还可能从非特异性杂交的分子,或从被外切核酸酶作用降解的杂交的分子发 生,从而留下能够延伸的杂交的3'末端。如将在下文中更详细描述的,在一个实施方式中, 此类延伸可通过将"外切核酸酶阻断区"并入用于本方法的核酸试剂中,以阻止外切核酸酶 消化产生能够在第一 RCA模板上引发的引物,和/或通过确保在反应混合物中不存在外切核 酸酶活性(例如,通过使用不具有外切核酸酶活性的聚合酶)来阻止或限制。此外,还如将在 下面更详细地描述的,可使用阻断性基团和/或阻断性寡核苷酸,其本身被阻止延伸和置 换,在锁式探针之间杂交。这样,确实发生的以任何第一 RCA产物为模板的延伸可被限制而 不延伸至任何下游杂交的探针中并置换所述探针。然而,此类外切核酸酶阻断区或添加的 置换块的使用不是必需的,并且在其它实施方式中不使用它们。
[0039] "可环化的"意指提供第二RCA模板的寡核苷酸以具有可连接的末端的线性分子形 式存在,所述线性分子可通过将末端直接或间接地连接在一起(即彼此连接,或连接于间插 ("间隙")寡核苷酸的各自末端或可环化的寡核苷酸的延伸的3'末端)来环化。因而可在两 个或更多个部分即两个或更多个分子(例如可环化的寡核苷酸和间隙寡核苷酸)中提供第 二RCA模板。
[0040] 在RCA之前通过连接将可环化的寡核苷酸环化,所述连接以可环化的寡核苷酸已 与其杂交的分子,即第一RCA产物或已与其杂交的中间分子为模板。可环化的寡核苷酸将在 其各自的3'和5'末端区包含对应于靶分子(即用作连接模板的第一 RCA产物或与其杂交的 中间分子)中的同源互补区(或结合位点)的互补序列,所述互补序列可以是相邻的,其中末 端彼此直接连接,或非相邻的,中间存在间插"间隙"序列,其中将发生间接连接。
[0041] 第一 RCA产物可以是初始(即最初的)RCA反应的产物,或其可以是进一轮或随后的 RCA反应的产物。第二RCA反应可以是第二轮或进一轮或随后的RCA反应。因此应理解,本发 明的方法可包括多个连续轮的RCA,例如2、3、4或更多轮,其中在每一轮中,使用与先前轮的 RCA的反应产物直接或间接杂交的可环化的寡核苷酸(锁式探针)。换句话说,本发明的方法 可包括重复步骤(3)、(13)、((3)和((1)一次或多次。
[0042]本发明的特征是第一RCA产物在方法中保持完整,即其不被切割(例如其不被切割 成单体)。此外,步骤(a)中的第一RCA产物是单链的。更具体地在步骤(a)中,以单链形式提 供第一RCA产物。因此,根据本发明不需要和不使用"开放子"或用于打开双链核酸的部分以 允许锁式探针结合的其它分子。
[0043]由于RCA产物含有多个重复(或串联)拷贝(或单体)的序列(即其为单体的多联 体),因而可结合多个探针(可环化的寡核苷酸)。每一个单体包含至少一个可环化的寡核苷 酸的结合位点。因此,本发明的方法更具体地包括将多个探针与第一 RCA反应产物(直接或 间接)杂交。如本文中所用,术语"多个"或"大量"意指两个或更多个,例如至少2个、3个、4 个、5个、6个、10个、20个、30个、50个、70个或100个或更多个。将探针与存在于第一 RCA产物 的每一个重复单位或单体(每一个重复单位或单体是用于产生第一 RCA产物的环状RCA模板 (〃第一 RCA模板〃)的互补拷贝)中的结合位点直接或间接杂交。因此,将看到,可环化的寡核 苷酸可包含与第一RCA模板中存在的序列相同的序列,例如结合位点或靶互补区。应理解, 虽然第一 RCA反应的产物的每一个重复单位或单体包含可环化的寡核苷酸(锁式探针)的结 合位点,但实际上,并非所有这些结合位点都可(或将)在探针杂交后被探针占据。许多或多 个此类结合位点被探针结合就可满足。因此,在本发明的方法中,探针可与存在于第一RCA 产物的单体中的探针结合位点杂交,或与与存在于第一 RCA产物的单体中的互补序列杂交 的中间核酸分子杂交。更具体地,探针与RCA产物的至少一个单体中的探针结合位点杂交, 或与中间核酸分子杂交,所述中间核酸分子与存在于第一RCA产物的至少一个单体中的,但 优选至少2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个、15个、20个、50个、80个或100个或更多个 单体或中间分子中的互补序列杂交。单体可包含不止一个不同的锁式探针(可环化的寡核 苷酸)的结合位点(同源靶互补区)。因此,每一个单体可包含相同或不同探针的多个结合位 点。
[0044] 探针(可环化的寡核苷酸)可与第一 RCA产物直接杂交,即其直接结合于存在于第 一 RCA产物中的与所述探针中的结合位点互补或"同源"的探针结合位点。或者,探针可以例 如通过结合于中间核酸分子来间接杂交,所述中间核酸分子本身与第一 RCA产物(直接或间 接)杂交。在此类实施方式中,探针结合于存在于中间核酸分子中的互补(或同源)结合位 点。所述中间核酸分子可通过与存在于第一 RCA产物的每一个重复单位(或单体)中的互补 (或同源)结合位点杂交而结合于第一 RCA产物。然而,如上文所示,情况也许是并非每一个 中间分子或并非中间分子中的每一个探针结合位点都将被探针占据。
[0045] 在本发明的方法中,引物是第二RCA反应所需的。其可被提供来与可环化的寡核苷 酸预杂交或其可被单独提供,例如在寡核苷酸的杂交和/或连接后。可在可环化的寡核苷酸 的区域中提供第二RCA引物的结合位点,所述区域与靶互补区不同或与其分开。可环化的寡 核苷酸/锁式探针可被视为具有通过间插区或结构域(其可被视为"骨架"结构域或区)连接 的两个靶互补末端区(或"臂")。可在骨架区中提供第二RCA引物的结合位点。
[0046] 说明本发明的代表性实施方式的示意图示于图1中。用于第一RCA的模板通过环化 (当其已经与用于第一RCA的引物杂交时,通过连接)第一锁式探针来产生。随后启动第一 RCA反应以产生第一 RCA产物。在第一 RCA中在利用聚合酶进行一定时间的滚动后,用于第二 RCA的锁式探针被连接在第一 RCA产物上,并且在该连接形成第二RCA模板后,环化的寡核苷 酸在第二RCA引物(所述引物与第二锁式探针的骨架部分杂交)存在的情况下开始滚动,以 产生第二RCA产物。如所描述的,根据重复和锁杂交长度的大小,可存在几个在第一RCA产物 的相同单体(重复)上连接的第二锁式探针。在第二RCA后,可通过利用用不同标记物(可区 分的标记物,例如不同颜色或荧光的标记物等)标记的一个或多个不同的检测探针进行标 记来检测第二RCA产物。
[0047] 本发明的方法可以是均相或非均相的。即,其可在溶液中进行而无需固相或载体 (即无需任何反应组分的固定)或其可以以固定的形式或基于固相的形式进行,特别地其中 固定第一RCA产物。第一RCA产物的固定可以以各种方式来实现。例如在原位测定中,可在使 用靶(分析物)核酸作为第一 RCA引物引发的第一 RCA反应中形成第一 RCA产物。此处,将第一 RCA产物附着于本身被固定于固体载体的靶组织样品。这可以例如在使用锁式探针检测靶 核酸时进行。或者,第一 RCA可通过被结合于固定的(或固置的)分析物靶的免疫RCA或接近 式探针的核酸域来引发。在其它实施方式中,用于第一RCA反应的引物可被简单地固定于固 体载体。非均相固定的形式的使用使得可容易地进行洗涤,从而例如允许容易地除去未结 合的和/或未连接的探针,和/或未以物理方式附着于表面的其它未反应的添加的反应组 分,或假的不期望的反应。因此可容易地连续进行非均相或基于固相的方法。
[0048] 由于本发明需要可环化的寡核苷酸与第一 RCA产物的直接或间接结合和在其上的 连接来形成第二RCA模板,因而除非可环化的寡核苷酸已与第一 RCA产物杂交,即除非第一 RCA产物存在,否则第二RCA反应不能发生。因此,第二RCA反应取决于第一 RCA产物的存在。 因此,方法的特异度可得以提高。第二RCA反应从而可被视为靶依赖性RCA反应,其中第二 RCA反应的靶是第一 RCA反应产物。
[0049] 洗涤步骤也可用于提高特异性,例如通过在探针杂交后和/或在连接步骤后包括 一个或多个洗涤步骤。这可容易地在固相或固定的形式中通过洗掉任何未结合和/或未连 接的反应物来实现。因此,在第一RCA产物不存在的情况下,可环化的寡核苷酸不具有"结合 靶"(即无第一 RCA产物或中间核酸分子),从而不因结合于其靶而被固定,并且可被洗掉。因 此,如果第一 RCA产物不存在,则模板不可用于第二RCA。
[0050] 因此,可进行本方法,以使得未结合的探针(即未与第一RCA产物直接或间接杂交 的探针(可环化的寡核苷酸))在进行步骤(d)的RCA反应之前被除去。这可以例如通过以固 相形式进行所述方法以及在探针添加和杂交的步骤后进行洗涤来容易地实现。可选择地或 此外,可在连接步骤(c)后进行洗涤,例如严格洗涤,以除去任何未连接的探针。
[0051] 或者,可通过酶促降解从样品除去未结合的和/或未连接的可环化的寡核苷酸(探 针),以在连接步骤后提高特异性。这可通过优先降解单链线性寡核苷酸的任何方法来实 现。在第一RCA产物不存在的情况下,可环化的寡核苷酸将不与RCA产物杂交(即寡核苷酸的 3 '和5 '末端将不会并置以进行连接,从而寡核苷酸将不会被环化)。这样未结合的(从而未 环化的)探针将被降解,因此如果第一 RCA产物不存在,则模板不可用于第二RCA。此外,在第 一 RCA产物存在的情况下,可通过除去任何剩余的未杂交的探针来降低背景。因此可作为清 除步骤来进行未杂交的探针的酶促降解。这样,可避免未杂交的探针的任何随后的扩增,包 括未连接的探针的扩增和通过在后来可被非特异性连接的探针(即非靶连接的探针)的RCA 的扩增。可以以这样的方式进行本方法:在进行步骤(d)的RCA反应之前除去还未与第一 RCA 产物杂交(从而未被环化)的未结合的探针(可环化的寡核苷酸)。这可通过在步骤(C)之后 添加优先降解线性寡核苷酸但不降解环化的寡核苷酸分子的组分来实现。在优选的实施方 式中,可通过具有3 '外切核酸酶活性的组分,优选通过具有3 '外切核酸酶活性的DNA聚合酶 来进行降解,尽管可以可选择地或另外地使用单独添加的外切核酸酶(例如,3'外切核酸 酶)。在特别优选的实施方式中,所述酶可以是Phi29聚合酶。这可通过在连接步骤(c)之后 并且在添加启动第二RCA所需的引物之前添加具有3'外切核酸酶活性的组分来进行。可选 择地或另外地,可在dNTP不存在的情况下进行该步骤。因此可在可环化的寡核苷酸连接后 提供具有3 '外切核酸酶活性的组分。
[0052]或者,可在步骤(b)之后并且在步骤(c)之前,即在连接步骤之前添加具有外切核 酸酶活性的组分,以降解任何剩余的未杂交的探针。当在连接步骤之前添加具有3'外切核 酸酶活性的组分时,优选地可使用具有严格单链特异性活性的外切核酸酶。
[0053]然而不希望受理论束缚,据认为,与除去未结合的和/或未连接的探针分子的3'外 切核酸降解步骤的使用相关的增强的特异性和灵敏性可通过除去未连接的探针(可环化的 寡核苷酸)来产生,所述探针可通过至少它们的3 '末端附着于第一 RCA产物,或所述探针在 样品中可以是游离的。结合于第一 RCA产物的未连接的探针能够用作用于使用第一 RCA产物 作为模板的延伸的引物。以这样的方式通过样品中的游离未连接的探针或其它DNA分子形 成的第一RCA产物的互补序列的假引发可导致US 6183960中提及的'超支化的' RCA扩增法, 并且这样产生的任何扩增产物可通过用于检测第二RCA产物的检测探针来检测,从而导致 产生的背景信号水平的升高。还预期,未连接的探针可与第二RCA产物杂交并降低检测探针 与第二RCA产物的结合效率,从而导致产生的信号水平降低。因此,3'外切核酸降解步骤的 使用可提高本发明的方法的信噪比。
[0054] 设想了可以以均相和非均相反应形式进行此类酶促降解,然而此类方法可有利地 允许未结合的(和从而未环化的)探针在以其中靶分析物不被固定的均相(即溶液相)形式 进行步骤(d)的RCA反应之前被除去。
[0055] 还应理解,可期望在添加可环化的寡核苷酸以阻止未结合的可环化的寡核苷酸 (探针)的不期望的延伸(以增强本方法的特异性)之前灭活用于产生第一 RCA产物的具有聚 合酶活性的组分。如果聚合物在连接步骤中具有活性,则可通过聚合酶的3'外切核酸酶活 性来降解未环化的寡核苷酸,否则在其被连接之前其可被聚合酶延伸。在某些实施方式中, 这可在添加可环化的寡核苷酸之前通过热灭活来实现。
[0056] 因此在一个实施方式中,本发明的方法可如下来进行:
[0057] i)第一锁式探针与靶DNA的杂交和连接
[0058] ii)第一锁式探针的滚环扩增
[0059] iii)聚合酶的灭活
[0060] iv)第二锁式核酸(可环化的寡核苷酸)在第一 RCA产物上的杂交和连接 [0061 ] V)通过外切核酸酶除去未连接的第二锁式探针
[0062] vi)使用与第二锁式探针互补的引物的第二RCA,然而锁仍然附着于第一 RCA产物 [0063]还预期的是,在另外的实施方式中,可以以这样的方式滴定用于本发明的方法的 可环化的寡核苷酸(探针)的量,以匹配形成的第一 RCA产物的量。这样,可避免过量的未结 合的探针。然而,很明显的是,在此类实施方式中,还可期望除去过量的未结合的和/或未连 接的探针以进一步增强检测测定的灵敏性。
[0064]因此,以此类方式设计和可进行所述方法,以使得在第一RCA产物不存在的情况下 第二RCA产物的产生被阻止或降至最低程度。更具体地,在本发明的方法中,在第一RCA产物 不存在的情况下,第二RCA产物的产生被阻止或降至随机水平。
[0065]应理解,当设计或进行所述方法,以使得除非第一 RCA产物存在,否则第二RCA反应 不应发生时,此类方法的本质是非特异性反应可发生,并且不能保证绝对阻止。因此,某些 不期望的非特异性或随机反应或相互作用可在样品或反应混合物中发生,并且这些反应或 相互作用可导致例如由除探针/引物外的组分或核酸分子引发的第二RCA产物的产生。这就 是随机水平上的第二RCA产物的产生的意思。
[0066] 如上文中所指出的,本发明的方法的特征是可环化的寡核苷酸(探针)不能引发使 用第一 RCA产物作为模板的延伸,或限制确实发生的任何所述延伸以避免与第一 RCA产物杂 交的任何下游探针的置换。当然应理解,该需要应用于与第一 RCA产物杂交的任何方法组分 或反应物。这可包括被使用的任何中间寡核苷酸分子。
[0067] 为了获得该特征,根据方法的精确性质,可单独地或组合地使用各种手段和步骤。 例如,在某些实施方式中,可将修饰(例如阻断基团或经修饰的残基)掺入探针(可环化的寡 核苷酸)中,所述修饰抑制聚合酶和/或外切核酸酶作用(即,其抑制延伸和/或降解),或所 述修饰抑制链置换。阻断性寡核苷酸(例如具有上述修饰)可用于防止与第一 RCA模板(或中 间分子)杂交的3'末端延伸。例如,此类阻断性寡核苷酸可与第一 RCA模板在本发明的探针 之间杂交。为了阻止任何杂交的探针的不期望的外切核酸酶消化产生能够在第一 RCA产物 上引发的引物/模板构建体,在某些实施方式中,可避免任何具有核酸外切活性的试剂的存 在,例如可使用外切核酸酶缺陷性聚合酶。可使用洗涤步骤。例如,如上文中指出的,已杂交 但未连接的任何探针可通过严格洗涤除去(按照本领域中公知的原理)。这特别适用于基于 非均相或固相的方法的情况。可使用此类方法的任何组合。
[0068] 如上文中所指出的,在其它实施方式中,可使用外切核酸酶活性。与DNA聚合酶或 DNA聚合酶活性结合的具有3'外切核酸酶活性的组分的添加可阻止已被非特异性环化(连 接)(例如,在第一 RCA产物不存在的情况下或作为其中连接以另一个分子为模板的非特异 性背景反应)的任何可环化的寡核苷酸(探针)的RCA。在利用具有3'外切核酸酶活性的组分 的此类实施方式中,期望可环化的寡核苷酸(探针)不包含外切核酸酶阻断区。
[0069] 可使用如上文所示的所谓的外切核酸酶阻断区(即用于阻断或抑制外切核酸酶活 性,特别是3'核酸外切活性的修饰)。例如,探针可在探针的3'末端与5'杂交的区之间的区 中包含此类阻断区,例如一段抗核酸酶核苷酸。
[0070] 可选择地或此外,可在杂交的可连接的5'末端上或其附近修饰探针以包含置换阻 断区。在此类情况下,确实从3'末端发生的任何延伸将不置换杂交的5'末端(探针本身的或 下游杂交的探针的)。
[0071] 用于抑制或阻断外切核酸酶和/或聚合酶作用(即用于抑制或阻断降解和/或延 伸)以及抑制或阻断置换的修饰或阻断基团在本领域中是公知的并且在文献中进行了描 述,可使用这些修饰或阻断基团中的任何修饰或阻断基团。因此,核苷酸可被修饰来包含或 掺入可抑制酶(例如聚合酶)发挥功能(例如结合)的阻断基团。例如,外切核酸酶阻断区可 包含抗核酸酶核苷酸残基的区。这些外切核酸酶阻断区可以例如是2'0-Me-RNA残基、锁核 酸(LNA)残基、肽核酸(PNA)残基、硫代磷酸(phospho th iate)修饰的核酸或掺入在核苷酸残 基之间的聚乙烯-接头骨架部分。还可包含无碱基(无嘌呤或无嘧啶,或AP)位点作为外切核 酸酶阻断区。此外,探针或探针组分可包含发夹结构作为外切核酸酶阻断区。存在几种修饰 核酸以便它们是抗外切核酸酶的和/或不用作引物的方法,并且本发明的方法无意限制于 上文所列的实例。
[0072]类似地,延伸或聚合酶阻断区可包括在上文被指示为外切核酸酶阻断区的任何经 修饰的残基或阻断区。可将抑制聚合酶的结合的任何基团或修饰掺入探针的相关区。例如, 可使用任何具有嵌入功能的基团,例如吖啶基团。
[0073]阻断性寡核苷酸可包含或掺入上文中提及的任何外切核酸酶或延伸/聚合酶阻断 区。可抑制不需要的延伸反应的阻断性寡核苷酸在文献中,例如在Olasagasti等人,2010, Nature Nanotechnology,5,798-806和Senior Thesis of Rashid,at the University of California,Santa Cruz(标题为Blocking Oligomer Design(3/10_3/ll))中进行了描述。
[0074] 置换阻断区在本领域中也是已知的,并且可使用任何报导过的或已知的置换阻断 区。置换阻断区可包含经修饰的核苷酸残基的任何区段或区,相较于未经修饰的DNA和/或 RNA,所述区段或区与DNA和/或RNA形成更稳定的杂交体。此类修饰包括LNA、PNA和2 ' -0-Me RNA残基。因此,可使用具有足够的长度或强度以避免置换的此类残基的区段或区。还可使 用无碱基(AP)位点。还可使用如在文献中报导的DNA夹。
[0075] 因此,在一个可能的实施方式中,本发明的方法包括可环化的寡核苷酸(探针)的 使用,所述可环化的寡核苷酸掺入了(或包含)一个或多个用于抑制降解、延伸和/或链置换 的经修饰的区,和/或使用阻断性寡核苷酸(其本身可掺入此类经修饰的区)。
[0076] 更具体地,在该实施方式中,如上文中所示的经修饰的区用于抑制降解、延伸和/ 或链置换。因此,经修饰的区可包含或构成外切核酸酸酶阻断区、延伸阻断区和/或置换阻 断区。经修饰的区可包含经修饰的核苷酸和/或阻断基团和/或发夹结构。经修饰的核苷酸 包括无碱基核苷酸。可以以此类方式添加包含一个或多个此类经修饰的区的阻断性寡核苷 酸以与第一 RCA产物杂交,以使得探针不能使用第一 RCA产物作为模板来进行延伸,或限制 任何所述延伸以避免与第一 RCA产物杂交的任何下游探针的置换。例如,阻断性寡核苷酸可 在多个探针之间与第一 RCA产物杂交,例如以便任意两个探针之间存在至少一个阻断性寡 核苷酸。
[0077] 在其它实施方式中,此类隔离阻断区的使用不是必需的,并且连接的和成链的探 针(环化的寡核苷酸)本身可用作阻断区来避免任何不期望的延伸或置换。
[0078] 如上文中所指出的,本发明的一个有利方面是可启动第二RCA,同时第一RCA正在 进行,或换句话说,一旦第一 RCA产物已开始形成就可启动第二RCA。这导致更快的信号产生 的有利方面。因此,相较于其中v为聚合酶的核苷酸掺入速率,相较于单个RCA的v,信号放大 可能最佳地以v 2/2进行,从而以多个新的RCA产物产生的速率进行。这可加速任何RCA依赖 性方案,并且可具有用于快速检测测定的特定值。通过进一轮的RCA启动关闭,信号强度或 速度或两者的进一步增加是可能,并且该增加与第二RCA反应产物相关联,依此类推(例如 第3代、第4代、第5代……代的RCA)。
[0079] 因此,在一个实施方式中,本发明的方法可包括产生第一RCA产物的步骤作为步骤 (a)(或进行第一 RCA反应以产生第一 RCA产物)。第一 RCA产物一开始形成就可进行步骤(b)、 (c)和(d)。因此,步骤(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)可同时或基本上同时进行。具体地,步 骤(b)可与步骤(a)同时进行。因此,在某些实施方式中,用于第二RCA反应的试剂,例如可将 所需的探针和任何另外的反应物直接添加至用于第一 RCA反应的试剂。
[0080] 在其它实施方式中,可相继地进行本方法的步骤。
[0081] 在另一个实施方式中,可在第一与第二RCA反应之间进行另外的'清除'步骤。如上 文中提及的,设想了,这可包括在开始第二RCA反应之前添加具有3'外切核酸酶活性的组分 以除去任何未结合的和/或未环化的可环化的寡核苷酸(探针)。在此类实施方式中,预期在 添加具有3'外切核酸酶活性的组分之前或与之同时不添加启动第RCA所需的引物。因此,在 第一 RCA步骤后,和在可环化的寡核苷酸杂交和连接后,可添加具有3 '外切核酸酶活性的聚 合酶(例如phi 29聚合酶)以允许降解未连接的可环化的寡核苷酸。在该清除步骤后,可添 加用于第二RCA反应的引物以启动第二RCA。可选择地或另外地,可在dNTP不存在的情况下 进行外切核酸酶消化步骤,随后添加 dNTP以启动第二RCA。因此,可将用于第二RCA反应的某 些试剂直接添加至所述试剂以进行第一 RCA反应,并且可随后添加某些试剂。或者,可在杂 交步骤(b)之后但在连接步骤(c)之前进行清除步骤。随后可进行连接步骤(c)。
[0082] 在另外的实施方式中,可使用单独的外切核酸酶进行清除步骤,可在步骤(b)之后 和/或步骤(c)之后添加所述酶。这可包括在清除步骤后,例如通过加热灭活外切核酸酶。如 上所指出的,可在连接步骤(c)之前灭活用于第一 RCA反应的聚合酶,并且可将此类各种步 骤与方法的不同实施方式组合使用。可以例如在此类(多个)灭活步骤之后添加用于第二 RCA反应的聚合酶,或聚合酶和引物。
[0083] 虽然适合用于进行清除步骤(3'外切核酸降解)的条件在本领域中是已知的,但在 代表性实施方式中,这可使用phi29聚合酶在37°C下进行约20分钟。然而合适的时间可变 化,并且设想了,可进行该步骤5至60分钟,例如5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟 或15分钟、或25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或55分钟。
[0084] 本发明的方法依赖于多个能够与第一 RCA产物杂交的探针。因此,应理解,第一 RCA 产物必须可用于探针杂交。该要求是所有RCA基检测法的特征,其中RCA产物通过将探针例 如检测探针与产物杂交来检测,并且在本领域中是公知的。因此,对于第一RCA产物可以有 利的是具有低含量的二级结构。然而,该特征可通过在有利于杂交条件下,按照本领域中公 知的原理进行所述方法来补偿。因此,例如,可在甲酰胺存在的情况下,例如在含有甲酰胺 的缓冲液中进行所述方法。
[0085] 第一 RCA产物可从任何核酸(例如DNA或RNA)环的RCA产生,或实际上所述环可具有 任何经修饰的核酸,只要其能够用作RCA反应的模板。所述环(第一 RCA模板)可以例如为报 告DNA环,即来自任何RCA基检测测定,所述测定使用或产生核酸环(环状核酸分子)作为所 述测定的报告分子。因此,第一 RCA产物可以是免疫RCA或其中产生环状核酸分子的接近式 探针测的产物,例如如上文中所论述的,或其可通过环化的锁式探针的RCA获得。或者,用于 产生第一 RCA产物的第一 RCA模板可以是环化的靶(分析物)核酸分子。使用环化衔接子(所 谓的"选择子")进行的靶核酸分子的环化由我们在W0 99/049079、W0 2003/012119和W0 2005/070630中进行了描述。
[0086]如上文中所指出的,锁式探针(可环化的寡核苷酸)的靶互补区的长度,或更具体 地第一 RCA产物或中间分子上的环化的探针的杂交区域的长度对于本发明的方法的运行是 非常重要的。探针的每一个末端上的靶互补区的长度为6~16个核苷酸。选择至少6个的最 小尺寸来确保结合的特异性,并且最大尺寸不应超过16个以允许环化的探针的高效RCA,所 述探针与其靶成链。优选地尺寸范围为6~15个、6~14个、6~13个或6~12个核苷酸,更具 体地,7~16个、7~15个、7~14个、7~13个、7~12个、8~16个、8~15个、8~14个、8~13个、 8~12个。在【具体实施方式】中,优选小于或达到13个或12个或11个或10个的尺寸。因此在优 选的实施方式中,尺寸范围为6个或7个至8个、9个、10个、11个或12个,例如6~11个、6~10 个、6~9个、6~8个或7~11个、7~10个、7~9个、7~8或8~11个、8~10个、8~9个。探针的 每一个靶互补区的长度可以相同或不同(只要其在上述范围内)。例如,探针可具有6个+6 个、6个+7个、7个+7个、6个+8个、7个+8个、8个+8个、8个+9个、7个+9个、9个+9个、10个+9个、 10个+10个、10个+11个、11个+11个、11个+12个、12个+12个等,即上述范围内的任何整数的 任意组合的靶互补区。
[0087] 杂交区的总长度可以为12~32个,更具体地12~30个、12~28个、12~26个、12~ 24个、12~23个、12~22个、12~21个、12~20个、12~19个、12~18个、12~17个、12~16个、 13~30个、13~28个、13~26个、13~24个、13~23个、13~22个、13~21个、13~20个、13~ 19个、13~18个、13~17个、13~16个、14~30个、14~28个、14~26个、14~24个、12~23个、 14~22个、14~21个、14~20个、12~19个、14~18个、14~17个、14~16个、15~30个、15~ 28个、15~26个、15~24个、15~23个、15~22个、15~21个、15~20个、15~19个、15~18个、 15~17个或15~16个。
[0088] 更具体地,杂交区的总长度不超过30个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、 21个、20个、19个、18个、17个或16个核苷酸。
[0089] 如上所解释的,杂交区在一些实施方式中不仅可由探针的靶互补区组成,而且还 可包括间隙寡核苷酸或其它间隙填充的序列(例如通过探针的3'末端的延伸产生的间隙序 列)。因此当探针末端的连接是间接的时候,游离末端与靶杂交,游离末端之间的间隔通过 "间隙"寡核苷酸来填充,以使每一个游离末端被连接于所述间隙寡核苷酸的一个末端。或 者,游离末端之间的间隔可通过例如在聚合酶反应中,使用连接模板作为延伸模板延伸游 离3 '末端来"充满"。一旦游离3 '末端已延伸至与游离5 '末端相邻,就可通过连接反应连接 两个末端。因此,上文中提及的总的杂交区可由探针靶互补区和可选地间隙填充序列组成。 [0090]因此应理解,在其中探针末端彼此间接连接的本发明的间隙填充实施方式中,间 隙的长度可为1至20个核苷酸,例如1~19个、1~18个、1~15个、1~12个、1~10个、1~8个、 1~7个、1~6个、1~5个、1~4个或从2个、3个、4个、5个或6个至上述范围的任何上限。
[0091]如在下面实施例中显示的,已用具有长度为12个、10个和8个核苷酸的靶互补区的 锁式探针特别地获得了良好结果,因此,优选的是,靶互补区的长度达到12个、11个、10个、9 个或8个核苷酸,或杂交区的长度达到24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个或16个 核苷酸长。
[0092]如上文中大体上论述的,本发明的方法允许第一RCA的进一轮局部RCA扩增,其中 第二轮或进一轮RCA扩增产物被局限于第一 RCA扩增产物。这可具有许多应用,最为明显地 用于信号放大,并因此用于许多基于检测RCA产物的检测方法或测定。因此,在此类实施方 式中,如上所定义的本发明的方法可包括检测所述附着的第二RCA产物,从而检测所述第一 RCA产物的额外或附加步骤,其中检测被局限于第一 RCA产物。
[0093] 或者认为,可看到此类实施方式提供本发明的其它方面,所述方面可被定义为用 于检测RCA反应的第一产物的方法,所述方法包括进行如本文中所定义的局部RCA反应和检 测如上所定义的所述第二RCA产物。在某些实施方式中,可允许进行局部检测(例如空间检 测),例如当第一 RCA产物被原位固定或固置时。
[0094] 如上文中所指出的,此类方法的优点包括更强和/或更快的信号放大。所述方法从 而在检测任何需要的测定靶或分析物中具有特别的效用,所述靶或分析物可以是本身可通 过RCA扩增以形成第一 RCA产物的靶/分析物核酸分子,或可通过使用或产生环状核酸分子 作为测定靶/分析物的测定报告分子或标志物的测定检测的靶/分析物核酸分子或任何其 它分子(参见上文)。此类环可以是用于产生第一 RCA产物的第一 RCA模板。
[0095] 因此本发明的方法和探针可用于检测样品中的核酸分子。所述核酸分子可以是待 检测的靶分析物或可指示靶分析物在样品中的存在。例如,所述核酸分子可附着于靶,例如 直接或间接结合于靶例如蛋白质分子的抗体:核酸缀合物的核酸域。类似地,待检测的核酸 分子可以是从接近式探针之间的相互作用产生的核酸分子,其结合于靶分析物例如蛋白 质。
[0096] 因此,可看到本发明提供用于检测样品中的分析物的方法,其中使用或产生(例如 从核酸分析物产生,或用作或产生为所述分析物的标志物)第一环状RCA模板,使用所述第 一 RCA模板进行第一 RCA反应以产生第一 RCA产物,如本文中所述进行局部第二RCA反应以产 生被局限于所述第一 RCA产物的第二RCA产物,并检测所述第二RCA产物。
[0097] 因此,可使用如本文中所描述的探针(可环化的寡核苷酸),所述探针与第一 RCA产 物直接或间接杂交。第一RCA产物可使用第一RCA模板通过第一RCA反应来产生,所述第一 RCA模板本身可以是如下物质或来源于所述物质或从所述物质产生:
[0098] (i)分析物;
[0099] (ii)直接或间接附着于分析物的核酸分子(例如探针);或
[0100] (iii)指示样品中的分析物,或样品中所述分析物的替代物(即,其的标志物)。
[0101] RCA模板,即环状或可环化的核酸分子(例如寡核苷酸),在本领域中是公知的。RCA 模板通常可包含约20~1000个核苷酸,例如26~1000个、30~1000个、30~900个、60~900 个、40~800个、50~700个、60~600个、70~500个、80~400个、90~300个或100~200个核 苷酸,例如至少20个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80 个、90个、100个、120个、150个、200个或250个核苷酸。更具体地,在本发明的方法中,探针可 以是20~150个,例如20~120个、20~100个、25~150个、25~120个、30~150个、30~120 个、30~100个、40~150个、40~120个、40~100个核苷酸。
[0102] 第一和/或第二RCA模板可包含报告域,其为可用于检测和/或鉴定RCA产物(即以 RCA模板为模板的引物延伸产物)的序列。这在本发明的多重实施方式(其中将不止一种不 同的第一 RCA产物经历例如其中在单个测定中检测不止一种分析物(例如核酸分析物)的方 法)中是特别有利的。第二RCA模板(即,从锁式探针产生的RCA模板)(例如对于从靶分析物 衍生的或指示靶分析物的第一 RCA产物是特异性的每一种探针),可包含独特的〃标志物〃或 标识序列(例如条码序列,诸如包含特定检测探针的序列的位点,即RCA产物与RCA模板互 补,并且因此与RCA产物杂交的检测探针将包含与RCA模板的部分相同的序列)以允许单独 检测和/或定量样品中的每一种分析物。因此,在多重测定中,每一种探针(或第二RCA模板) 可包含不同的报告域,并且可以例如使用可与报告域的互补序列杂交的标记有不同荧光基 团的寡核苷酸来平行(即同时)检测探针与靶分析物之间的相互作用的检测,即每一种分析 物的检测。或者,每一种标志物(和从而每一种分析物)可使用连续可视化反应来检测,其中 每一个反应以例如剥离或漂白步骤相间隔。适合于使用本发明的方法的连续可视化反应的 方法在本领域中是已知的,例如.G0ranss〇:n等人,2009(Asingle molecule array for digital targeted molecular analyses .Nucleic Acids Res·2009年1月;37(1):e7), Wahlby^A^2002(Sequential immunofluorescence staining and image analysis for detection of large numbers of antigens in individual cell nuclei.Cytometry,47( 1):32-41,2002),所述文献在此通过引用并入。在本发明的一些代 表性实施方式中,可平行检测多种分析物。在本发明的其它代表性实施方式中,可相继地检 测多种分析物。
[0103] 使用不同标记物的不同组合和/或比例的标记的组合方法(例如比例标记)在本领 域中是已知的,并且可用于增加可一次检测的或在相同反应中检测的不同分子并从而不同 分析物的数目。例如,可使用利用不同彩色标记物和/或荧光标记物和/或不同比例的不同 彩色标记物和/或荧光标记物的组合。例如,此类具有彩色标记物和/或荧光标记物的不同 组合的"颜色"编码可用于基于利用流式细胞术或显微镜进行的检测的多重测定。或者,通 过使用镧系元素同位素标记物,可使用cyToF检测。例如,可将7个不同的荧光基团分成4种 不同的类型。如果仅用一种颜色标记,则存在7种不同组合,如果用2种颜色标记,则存在21 种不同组合,如果用3种和4种标记,则存在35种不同组合,依此类推。
[0104] 用于第二RCA的引物包含与第二RCA模板的部分互补的区(在下文中进一步定义), 所述区在有利于引物的RCA模板依赖性延伸的测定的条件下形成充分稳定的双链体。引物 的长度通常为至少5个核苷酸,通常为至少6个、8个或10个,通常为至少15个或16个核苷酸, 并且在长度上可长至30个核苷酸或更长,其中引物的长度范围通常为5个至50个核苷酸,例 如6个、8个或10个至50个、40个、30个或20个,通常为约10个至35个核苷酸。
[0105] 如上文中所指出的,可使用一种或多种中间分子,例如中间分子可包含多个探针 的结合位点,或中间分子可包含一个探针的结合位点,并且对于每一种探针可使用一种中 间分子(例如当中间分子结合于存在于每一个单体中的位点时)。为简便起见,本发明主要 是针对探针与第一RCA产物之间的直接相互作用来定义的,但当在探针结合的上下文中或 针对使用第一 RCA产物作为模板的不需要的延伸参考该定义时,应理解这将类似地应用于 对中间分子的结合或在其上的延伸。此外,在检测测定法的上下文中,探针与其相互作用的 第一RCA产物或中间分子可被视为针对探针的靶核酸分子,即使本方法的目的可为探针不 与其直接相互作用的核酸分子或其它分析物的检测。
[0106] 与其靶核酸分子互补的区是指能够与靶核酸分子的至少一个区形成中间分子双 链体的探针的部份。遵从上述指定的大小范围,与靶核酸分子互补的区将足以在其中探针 具有实用性的测定条件下形成稳定的双链体。
[0107] 〃互补〃核苷酸序列将在适当的杂交条件下特异性组合以形成稳定的双链体。例 如,当第一序列的一部分可在反向平行的意义上(其中每一个序列的3'末端结合于另一个 序列的5'末端,并且一个序列的每一个A、T(U)、G和C从而分别与另一个序列的T(U)、A、C和G 对齐)结合于第二序列的一部分时,则两个序列是互补。RNA序列还可包括互补G = U或U = G 碱基对。因此,两个序列在本发明下不必具有完全的同源性来"互补"。通常当至少约85% (优选地至少约90%,最优选至少约95%)的核苷酸在确定长度的分子上共享碱基对组织 时,两个序列充分互补。
[0108] 探针/可环化的寡核苷酸可由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与沃 尔森-克里克(Watson-Crick)类型或类似类型的碱基对相互作用的合成核苷酸残基。因此, 核酸域可以是DNA和/或RNA或其任何修饰,例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。在 一些实施方式中,探针可包含外切核酸酶阻断区,以便其在以靶为模板的核酸延伸反应中 不能用作引物,即不能被聚合酶识别为引物和/或不能被降解以产生能够引发靶核酸分子 的延伸的核酸分子。
[0109] 如上文中所描述的,本发明的方法和探针可用于检测任何靶分析物,其中如果靶 分析物不是核酸分子,则第一 RCA模板(或实际上第一 RCA产物)可被视为分析物的标志物。
[0110] 〃分析物"或最终的检测测定靶或目标,可以是期望检测出的任何物质(例如分子) 或实体。分析物因而是本发明的检测方法或用途的"靶"。分析物可相应地是可能期望检测 出的任何生物分子或化合物,例如肽或蛋白质,或核酸分子或小分子,包括有机和无机分 子。分析物可以是细胞或微生物,包括病毒或其片段或其产物。分析物可以是可针对其开发 特异性结合伴侣(例如亲和结合伴侣)的任何物质或实体。此类特异性结合伴侣可以是核酸 探针(对于核酸分析物而言),并且可直接导致第一 RCA模板(例如锁式探针)的产生。或者, 如上文中所论述的,可将特异性结合伴侣偶联于核酸,其可以例如在使用或生成可为第一 RCA模板的环状核酸分子的测定中使用RCA策略来检测。因而特定目标分析物可包括核酸分 子诸如DNA (例如基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA (例如mRNA、微小RNA、 rRNA、snRNA、病毒RNA等)以及合成和/或经修饰的核酸分子(例如包括包含合成或经修饰核 苷酸或由其组成的核酸域,诸如LNA、PNA、吗啉等)、蛋白质性质分子诸如肽、多肽、蛋白质或 朊病毒或包含蛋白质或多肽组分等或其片段的任何分子。分析物可为单个分子或含有两个 或更多个分子亚单位的复合物,例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物,其可以或不可以彼 此共价结合,并且可以相同或不同。因此除了细胞或微生物以外,此类复合物分析物也可为 蛋白质复合物或蛋白质相互作用。此类复合物或相互作用从而可为同多聚体或异多聚体。 分子(例如蛋白质)的聚集体也可为靶分析物,例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分 析物还可为蛋白质或肽与核酸分子(例如DNA或RNA)之间的复合物,例如蛋白质与核酸之 间,例如调控因子(诸如转录因子)与DNA或RNA的相互作用。有利地,当分析物为核酸分子 时,可原位检测核酸,即无需从细胞取出或提取核酸。然而,分离和扩增的核酸分子也代表 适当的靶分析物。
[0111] 包括所有生物和临床样品,例如生物体的任何细胞或组织样品,或来源于其的任 何体液或制剂,以及样品诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等。还包括环境样品,例如 土壤和水样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的或它们可以以任何便利的方式进行预处 理例如以便贮存。
[0112] 代表性样品从而包括可含有生物分子或任何其它需要的分析物或靶分析物的任 何材料,包括例如食物和关联产品、临床和环境样品。所述样品可以是生物样品,其可含有 任何病毒或细胞材料,包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞 器。此类生物材料从而可包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物的细胞、植物细胞、藻类 (包括蓝绿藻)、真菌、细菌、原生动物等。代表性样品从而包括全血和血衍生产品诸如血浆、 血清和血沉棕黄层、血细胞、尿、粪便、脑脊液或任何其它体液(例如呼吸道分泌物、唾液、奶 等)、组织、活检组织、细胞培养物、细胞悬液、条件培养基或具有细胞培养成分的其它样品 等。可以以任何便利的或需要的方式(例如通过细胞裂解或分析物的纯化、分离等)预处理 样品,以准备用于本发明的方法和用途。
[0113] 靶分析物的检测取决于分析物在样品中的存在,所述分析物导致第一 RCA产物的 产生。随后按照本发明产生第二RCA产物,可检测所述第二RCA产物以检测分析物。如上文中 所论述的,第二RCA产物可导致强得多的和/或更快的信号。在一些实施方式中,第一和第二 RCA产物可有利地例如使用针对每一种所述产物的单独的经标记的检测探针来检测。从而 检测具有更强的信号的第二产物可使得能够例如在低放大倍数下进行检测。在更高的放大 倍数下的更精确定位可进一步通过检测第一产物来获得。
[0114] 因此,在添加适当的聚合酶和连接酶时,可通过第二RCA模板的滚环扩增(RCA),即 通过检测第二RCA产物和可选地第一 RCA产物来检测分析物在样品中的存在。多联体RCA产 物提供用于检测分析物的"信号"。所述信号可通过本领域已知的(关于其它实例参见下文) 和如US 7,320,860中教导的任何适当方法,例如通过将经标记的探针与报告域序列杂交来 检测,所述报告域序列在整个多联体RCA产物中重复。
[0115] 当形成第二RCA模板的探针的连接利用间隙寡核苷酸时,这可单独提供。因此,在 本发明的方法中,可将间隙寡核苷酸在探针之前、之后或与之同时添加至样品。在一些实施 方式中,可添加几种不同的间隙寡核苷酸,其中以不同的浓度添加每一种类型的间隙寡核 苷酸。每一种类型的间隙寡核苷酸可在5'和3'末端包含与连接模板域(在可环化的寡核苷 酸的末端之间)互补的共同序列和不同的间插序列,其可用作如上定义的报告分子。所得的 RCA产物可包含不同的报告域序列,这取决于哪个间隙寡核苷酸被连接至RCA模板中并且可 被单独地检测到。这可用于扩大本文中描述的测定方法的动态范围,如W02012/049316中描 述的。
[0116] 术语"检测"在本文中被广泛地用于包括确定分析物或分析物的任何测量形式的 存在(即,其存在还是不存在)的任何方法。因此"检测"可包括以任何方式确定、测量、评估 或测定分析物的存在或不存在或量或定位。包括定量和定性测定、测量或评估,包括半定 量。此类测定、测量或评估可以是相对的,例如当将检测样品中的两种或更多种不同分析物 时,或可以是绝对的。因此,当在定量样品中的(多种)靶分析物的上下文中使用时,术语"定 量〃可指绝对或相对定量。绝对定量可通过包括已知浓度的一种或多种对照分析物和/或将 检测水平的靶分析物与已知对照分析物相对照(例如通过产生标准曲线)来实现。或者,相 对定量可通过比较两种或更多种不同靶分析物之间的检测水平或量(以提供所述两种或更 多种不同分析物的每一种的相对量,即彼此相对地)来实现。
[0117] 可针对探针和其靶核酸分子的序列来选择或挑选探针的序列。因此,虽然针对它 们结合的靶分子选择靶互补区,但其余的探针的序列不是至关重要的,但当然必须包括第 二RCA引物的结合位点。然而,应选择序列以避免发生分子内杂交。一旦序列被选择或鉴定, 就可使用任何便利的方法来合成探针。
[0118] 如本文中所用,术语〃杂交〃或〃使杂交〃是指充分互补以通过沃尔森-克里克碱基 配对形成双链体的核苷酸序列之间的双链体的形成。当两个核苷酸序列共享碱基对组织同 源性时,这些分子是彼此〃互补的〃。因此,探针的域中的互补性区是指该域的能够形成分子 内或分子间双链体(即相同分子内的双链体(发夹结构)或与探针构建体的不同分子或不同 链的双链体)的部分。这些术语还用于指与沃尔森-克里克碱基配对类似的碱基对相互作 用,包括Hoogsteen碱基配对(其为还允许第三链缠绕以沃尔森-克里克模式装配的双螺旋 以形成三链体的碱基配对的罕见变型)。
[0119] 可选择被添加至样品的探针的量以在反应混合物中提供充分低的浓度的探针,以 使非靶特异性相互作用最小化,即以确保探针不随机结合于样品中的非靶分子达到任何大 的或显著的程度。例如,期望只有当探针结合其靶核酸分子(即仅在第一RCA产物存在的情 况下)时,第二RCA模板才产生,从而允许产生第二RCA产物。在代表性实施方式中,在与含有 第一 RCA产物的样品组合后,反应混合物中的每一种探针的浓度范围为约lfM至ΙμΜ,例如约 ΙρΜ 至约 InM,包括约 ΙρΜ 至约 ΙΟΟηΜ,例如 1ηΜ、2ηΜ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、50ηΜ。
[0120] 可将许多不同的探针添加至样品以进行多重测定(例如其中已产生或添加多种不 同的第一RCA产物或第一RCA模板的情况下),以平行检测多种分析物。多重测定可包括检测 样品中的数十、数百、数千或甚至数万种分析物。因此,多重测定可包含至少2种不同的探 针,即能够与不同的第一RCA产物(直接或间接)杂交,从而例如检测不同分析物的探针。例 如,多重测定可利用至少3种、4种、5种、10种、20种、30种、40种或50种探针,诸如100种、200 种、500种、1000种、10000种或更多种探针。
[0121] 在含有第一 RCA产物的样品(或反应混合物)和(多个)探针组合后,可将反应混合 物孵育足以使(多个)探针结合于样品中的其靶(第一 RCA产物或中间分子)(如果存在的话) 的一段时间。如上文中所描述的,一旦探针已(直接或间接)结合于第一RCA产物,探针就被 连接以产生第二RCA模板,并且在一些实施方式中,随后添加第二RCA引物并使其与第二RCA 模板相互作用以形成用于第二RCA的引物/RCA模板复合物。一旦引物/RCA模板复合物已形 成,就使用第二RCA模板作为用于聚合的模板来延伸引物。在一些代表性实施方式,例如原 位测定或其中将第一RCA产物固定的其它测定中,可在探针的添加与RCA产物的检测之间包 括洗涤步骤,例如可将第一 RCA产物捕获或固定在固体载体或底物上,可洗涤所述产物以除 去未附着于第一 RCA产物的未结合的或非特异性结合的探针或RCA产物。在一些实施方式 中,可在连接探针与第二RCA产物的检测之间包括洗涤步骤,以除去未连接的探针。在其它 代表性实施方式中,可在RCA产物检测之前包括清除步骤。例如,可在连接探针与添加用于 第二RCA反应的引物之间将具有3'外切核酸酶活性的组分添加至样品,以除去(消化或降 解)未被环化的可环化的寡核苷酸(未连接的探针)。
[0122] 在代表性实施方式中,可在添加另外的探针之前,预孵育探针和样品,持续范围在 5分钟至约24小时内的一段时间。优选地,所述预孵育为在范围为4°C至约50°C (例如10°C~ 40 °C或20°C~37°C)的温度下进行约20分钟至12小时。应优化在其下维持反应混合物的条 件以促进探针对其靶核酸分子的特异性结合,同时抑制非特异性相互作用。
[0123] 在样品与探针组合后,可添加(多种)间隙寡核苷酸(如果使用的话),随后使其杂 交。可选择地或此外,可将一种或多种间隙寡核苷酸与探针一起添加。
[0124] -般地,能够检测RCA产物的存在的任何便利方案可用于检测第二RCA产物和可选 地第一 RCA产物。检测方案可以需要或可以不需要分离步骤。
[0125] 如本领域中已知的,在模板指导的连接中,当两个紧密相邻的核酸与与它们互补 的第三核酸序列(即连接模板)退火或杂交时,连接酶催化它们的并置的3'-羟基与5'-磷酸 末端之间的磷酸二酯键的形成。可使用任何合适的连接酶,其中代表性的感兴趣的连接酶 包括,但不限于:温度敏感连接酶和热稳定连接酶。温度敏感连接酶包括,但不限于,噬菌体 T4 DNA连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌(E. col i)连接酶。热稳定连接酶包括,但不限 于,Taq连接酶、Tth连接酶、Ampligase_?和卩作连接酶。热稳定连接酶可获自嗜热或极端嗜 热生物,包括但不限于,原核生物体、真核生物体或古细菌(archae 1)生物体。某些RNA连接 酶也可用于本发明的方法。
[0126] 可将合适的连接酶和必需的和/或需要的任何试剂与反应混合物组合,并将其在 足以使杂交的寡核苷酸的连接发生的条件下维持。连接反应条件对于本领域普通技术人员 来说是公知的。在连接过程中,在某些实施方式中,可将反应混合物在范围为约4°C至约105 。(:、约4°C至约80 °C诸如约10°C至约70°C、约15°C至约60°C,通常地诸如约20°C至约37°C的 温度下维持范围为约5秒至约16小时,诸如约1分钟至约1小时的一段时间。在其它实施方式 中,将反应混合物在范围为约35°C至约45°C诸如约37°C至约42°C的温度下,例如在或约38 °C、39 °C、40 °C或41°C的温度下维持范围为约5秒至约16小时,诸如约1分钟至约1小时,包括 约2分钟至约8小时的一段时间。在代表性实施方式中,连接反应混合物包含50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、lmM ATP、25mg/ml BSA、0.25个单位/ml RNA酶抑制剂和 0.125个单位/ml的T4 DNA连接酶。在另一个代表性实施方式中,使用2.125mM镁离子、0.2个 单位/ml RNA酶抑制剂和0.125个单位/ml DNA连接酶。
[0127] 将明显的是,连接条件可取决于用于本发明的方法的连接酶。因此,上述连接条件 仅仅是代表性实例并且参数可按照公知的方案来改变。例如,可在高于50°C的温度下使用 可用于本发明的方法的连接酶即Ainpligase?..然而,还应理解,一个参数(例如温度)的改 变可能需要其它条件的改变来确保测定的其它步骤(例如探针与靶核酸分子的结合)不被 抑制或破坏。RCA测定法的这种操作在本领域中是常规的。
[0128] 连接步骤后的方法的下一个步骤是产生第二RCA产物,即在聚合反应中使用第二 RCA模板延伸第二RCA引物。滚环扩增(RCA)在本领域中是公知的,在Dean等人,2001 (Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification,Genome Research,11,第1095-1099 页)(其公开内容通过引用并入本文)中进行了描述。将RCA引物用于引物延伸反应中,即在 第二RCA模板上延伸RCA引物以产生第二RCA产物,其为单多联体产物。RCA引物将具有足够 的长度(如上文中所描述的),以提供在退火条件(在下文中更详细描述的)下与RCA模板的 杂交。
[0129] 除了上述核酸组分以外,主题方法中产生的反应混合物通常包含聚合酶,例如 phi29DNA聚合酶和如下文中所述的进行DNA聚合酶反应所需的其它组分。所需聚合酶活性 通常可由一种或多种不同的聚合酶提供。在一些实施方式中,所述聚合酶具有外切核酸酶 活性,例如5 '和/或3 '外切核酸酶活性。
[0130] 在制备主题方法的该步骤的反应混合物中,可以以任何便利的顺序组合各种组成 成分。例如,可同时组合所有各种组成成分以产生反应混合物。
[0131] 可使用任何便利的方案检测RCA反应(即第二RCA反应,还有可选地第一 RCA产物) 的扩增产物,其中所使用的特定方案可非特异性或特异性地检测RCA产物,如在下文中更详 细地描述的。例如,可直接检测第二RCA产物,例如可将多联体切割以产生单体,所述单体可 使用凝胶电泳,或更优选地通过与经标记的检测寡核苷酸(其与RCA产物中的报告域杂交) 杂交来检测。或者,可间接检测RCA产物,例如可通过PCR扩增所述产物,随后可检测所述扩 增产物。
[0132] 代表性的感兴趣的非特异性检测方案包括使用信号产生系统的方案,所述信号产 生系统例如通过嵌入来选择性检测单链DNA产物或双链DNA产物。用于此类实施方式的代表 性可检测分子包括荧光核酸染色(stain),诸如菲啶鑰染料,包括其单体或同二聚体或异二 聚体,当与核酸复合时其产生增强的荧光。菲啶鑰染料的实例包括乙锭同二聚体、溴化乙 锭、碘化丙啶和其它烷基取代的菲啶鑰染料。在本发明的另一个实施方式中,核酸染色是吖 啶类染料,或其同二聚体或异二聚体,诸如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙锭-叮啶异二聚体或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶或掺入所述染料。在本发明的另一个实施方式中,核酸染色是吲 哚或咪唑染料,诸如Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580(BI0PR0BES 34, Molecular Probes,Inc .Eugene,0reg.,(2000年5月))、DAPI (4,,6-二脒基-2_苯基吲噪)或 DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允许的核酸染色包括,但不限于,7-氨基 放线菌素 D、羟芪巴脒、LDS 751、选定的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金属复合物 诸如钌复合物和过渡金属复合物(例如,掺入Tb3+和Eu 3+)。在本发明的某些实施方式中,所 述核酸染色是当与核酸结合时产生增强的荧光的花青染料或花青染料的同二聚体或异二 聚体。可使用在属于Lee(1989)的美国第4,883,867号、属于Yue等人(1996)的美国专利第5, 582,977号、属于¥此等人(1994)的美国专利第5,321,130号以及属于¥116等人(1995)的美国 专利第5,410,030号(所有4个专利通过引用并入)中描述的任何染料,包括可在商标Τ0Τ0、 Β0Β0、Ρ0Ρ0、YOYO、T0-PR0、B0-PR0、P0-PR0和Y0-PR0下从Molecular Probes,Inc.,Eugene, Oreg商购获得的核酸染色。可使用在属于Haugland等人(1995)的美国专利第5,436,134号、 属于Yue等人(1997)的美国专利第5,658,751号和属于Haugland等人(1999)的美国专利第 5,863,753号(所有3个专利通过引用并入)中描述的任何染料,包括可在商标3¥81?6代611、 EvaGreen、SYT0、SYT0X、PIC0GREEN、0LIGREEr^PRIB0GREErffWMolecularProbes,Inc·, Eugene,Oreg商购获得的核酸染色。在本发明的其它实施方式中,所述核酸染色是掺入氮 杂-或聚氮杂苯并唑类(polyazabenzazolium)杂环(例如氮杂苯并嚼挫、氮杂苯并咪唑或氮 杂苯并噻唑)的单体、同二聚体或异二聚体花青染料,当与核酸结合时其产生增强的荧光, 包括可在商标SYT0、SYT0X、J0J0、J0-PR0、L0L0、L0-PR0下从Mo 1 ecular Probes,Inc ·, Eugene,Oreg商购获得的核酸染色。
[0133] 在其它实施方式中,与对于一般的核酸分子相反,对于RCA产物是特异性的信号产 生系统可被用于检测扩增。在这些实施方式中,信号产生系统可包括特异性结合于在RCA产 物中发现的序列(即报告域序列)的探针核酸或寡核苷酸,其中可用可直接或间接检测的标 记物来标记探针核酸/寡核苷酸。可直接检测的标记物是可直接检测而无需使用额外试剂 的标记物,而可间接检测的标记物是可通过使用一种或多种额外的试剂来检测的标记物, 例如当标记物是由两种或更多种组分组成的信号产生系统的成员时。在许多实施方式中, 所述标记物是可直接检测的标记物,其中可直接检测的感兴趣的标记物包括,但不限于:荧 光标记物、放射性同位素标记物、化学发光标记物等。在许多实施方式中,所述标记物是荧 光标记物,其中在此类实施方式中使用的标记试剂为焚光标记的(多种)核苷酸,例如焚光 标记的CTP(诸如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可用于标记核苷酸以产生经标记的探针核酸(即检 测探针)的荧光部分包括,但不限于:荧光素、花青染料诸如Cy3、Cy5、Alexa 555、Bodipy 630/650等。还可使用其它标记物,诸如上述那些标记物,这在本领域中是已知的。
[0134] 在某些实施方式中,用"能量转移"标记物标记特殊标记的探针核酸(检测探针)。 如本文中所用,"能量转移"是指通过利用荧光修饰基团改变荧光基团的荧光发射的方法。 能量转移标记在本领域中是公知的,此类经标记的寡核苷酸探针包括TaqMan?型探针,如 美国专利第6,248,526号(其公开内容通过引用并入本文)(以及Held等人,Genome Res. (1996)6:986-994 ;Holland等人,Proc ·Natl Acad · Sci ·USA( 1991 )88:7276-7280;和Lee等 人,Nuc.Acids Res. (1993)21:3761-3766)中描述的。检测探针的其它实例包括:蝎型探针 (如在Whitcombe等人,Nature Biotechnology(1999)17:804_807;美国专利第6,326,145号 (其公开内容通过引用并入本文)中描述的)、日出探针(Sunrise probes)(如Nazarenko等 人,Nuc.Acids Res. (1997)25:2516-2521;美国专利第6,117,635号(其公开内容通过引用 并入本文)中描述的)、分子信标(Tyagi 等人,Nature Bio techno logy (1996) 14:303-308;美 国专利第5,989,823号,其公开内容通过引用并入本文)和构象辅助探针(如在临时申请系 列第60/138,376号(其公开内容通过引用并入本文)中描述的)。
[0135] 因此,确定第二和可选地第一 RCA产物的存在可使用任何方便的方案来实现。可筛 选(即,测定、评估、评价、测试等)反应混合物的任何所得的第二和可选地第一RCA产物的存 在,以检测靶分析物在待测定的样品中的存在。根据所需灵敏度和其中正在实践所述方法 的应用,具体检测方案可变化。
[0136] 可以以许多不同的方式检测RCA产物。例如,掺入RCA产物的核苷酸可被直接标记, 例如被荧光标记地或另外地被可通过分光光度计检测的方式标记或被放射性同位素标记, 或用任何发信号的标记物标记,以便RCA产物被直接标记。在一些实施方式中,如上文中论 述的检测探针,例如荧光标记的探针、分子信标(如上文中所述的)等可被用于检测RCA产物 的存在,其中这些探针针对在RCA多联体中重复并且从而只以其整体存在于RCA产物中的序 列(报告域序列,即与RCA模板中的报告域序列相同的序列)。
[0137] 在主题方法的该检测步骤中制备的反应混合物还可包含含水缓冲介质,所述缓冲 介质包含单价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可使用任何便利的单价离子源,诸如KC1、醋 酸钾、醋酸铵、谷氨酸钾、NH 4C1、硫酸铵等。二价阳离子可为镁、锰、锌等,其中所述阳离子通 常为镁。可使用任何便利的镁阳离子源,包括M g C12、醋酸镁等。存在于缓冲液中的M g2+的量 可在0.5mM至10mM的范围内,但根据反应的类型,可使用更高或更低的量。例如,对于PCR,存 在于缓冲液中的Mg 2+的量可为约1.5mM,然而对于RCA,存在于缓冲液中的Mg2+的量可为约 10mM。可存在于缓冲液中的代表性缓冲剂或盐包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等,其中缓冲 剂的量通常在约5mM至150mM,通常约10mM至100mM,和更常见地约20mM至50mM的范围内,其 中在某些优选实施方式中,缓冲剂以足以提供范围为约6.0至9.5的pH(其中最优选为72°C, pH 7.3)的量存在。可存在于缓冲介质中的其它试剂包括螯合剂,例如EDTA、EGTA等。
[0138] 主题方法中的下一步骤是从经标记的感兴趣的RCA产物检测信号,其中信号检测 可根据所使用的具体信号产生系统而变化。在某些实施方式中,在主题测定中仅测定和使 用可检测信号(例如荧光)的存在或不存在,例如以测定或鉴定第二(和可选地第一)RCA产 物(并从而靶分析物)的存在或不存在。根据所使用的具体标记物,信号的检测可指示第二 (或第一)RCA产物的存在或不存在。
[0139] 在其中信号产生系统是荧光信号产生系统的实施方式中,信号检测通常包括检测 来自反应混合物的荧光信号的变化以获得测定结果。换句话说,评估由反应混合物产生的 荧光信号的任何调节。所述变化可以是荧光的增强或减弱(这取决于所使用的标记物的性 质),但在某些实施方式中,为荧光的增强。可使用任何便利的装置例如合适的荧光计(诸如 热稳定性比色杯或板读数荧光计)来筛选样品的荧光的增强,或例如当样品为在显微镜载 玻片上的组织样品时,可使用荧光显微镜来检测荧光。使用已知的荧光计适当地监控荧光。 将来自这些设备的信号(例如以光电倍增电压的形式存在的)传送至数据处理器板并被转 化成与每一个样品管相关的光谱。可同时评估多个管,例如96个管。因此,在一些实施方式 中,可平行检测多种分析物,然而在其它实施方式中,可相继地(例如一次一种分析物,或一 次一组分析物)检测多种分析物。
[0140] 当检测方案是实时方案(例如,如在实时PCR反应方案中使用的)时,可以以此方 式:在整个反应过程中以频繁的时间间隔,例如每3分钟一次收集数据。通过监控每一个循 环过程中来自样品的反应性分子的荧光,可以以各种方式监控扩增反应的进展。例如,可以 例如通过计算熔融峰下的面积来分析由熔融峰提供的数据,并将这些数据针对循环数作 图。
[0141] 可以例如使用预选的荧光部分(例如染料)的"拟合"来解析以该方式产生的光谱, 以形成代表每一种发信号部分(即荧光基团)的峰。可测定代表每一个信号的强度值的峰下 的面积,并且如果需要的话,表达为彼此的商。信号强度和/或比率的差异将允许在整个反 应过程中或在不同的反应条件(例如温度)下记录经标记的探针的变化。所述变化与寡核苷 酸探针与靶序列之间的结合现象或结合于靶序列的寡核苷酸探针的降解相关。差异峰下的 面积的积分将使标记作用的强度值能够被计算。
[0142] 根据样品是在引物延伸反应结束时被筛选一次还是例如在每一轮扩增反应后被 筛选多次(例如如在实时PCR监控中所进行的一样),筛选混合物的荧光的变化提供了一种 或多种测定结果。
[0143] 可以以各种方式解释如上文中所述产生的数据。在其最简单形式中,在扩增反应 的过程中或结束时来自样品的荧光的增强或减弱表示存在于样品中的靶分析物的量的增 加,例如由于与在反应混合物中检测到的RCA产物的量相关,从而表明此类事实,即扩增反 应已进行,并从而靶分析物实际上存在于初始样品中。定量也可能是通过在整个扩增过程 中监控扩增反应。定量还可包括测定反应混合物中的一种或多种核酸对照,如上文中所述 的。
[0144] 这样,可容易地筛选(或评估或测定等)反应混合物的RCA产物,并从而(多种)靶分 析物(例如核酸分析物)的存在。所述方法适合用于检测单种靶分析物以及多重分析(其中 测定样品中的两种或更多种不同的靶分析物)。在后面的这些多重情况下,可使用的探针的 不同组的数目通常在约2至约20或更高,例如多至100或更高,1000或更高等的范围内,其中 可平行或相继地检测样品中的多种分析物。
[0145]使用几种不同探针(多路技术(multiplexing))在单个反应中同时进行的许多分 析物的分析可因提高的灵敏度而得以增强,并且在某些实施方式中,也因提高的特异度而 增强,这可使用本发明的方法和探针来获得。每一个探针组可被设计来产生可用于确定最 终被探针询查的分析物的存在或不存在、量和/或RCA产物的定位。可使用已知来自文献的 用于分析核酸分子的任何已良好建立的方法(包括液相色谱、电泳、质谱、显微镜、实时PCR、 荧光探针、微阵列、比色分析诸如ELISA、流式细胞术、质谱(CyTOF)等)来检测RCA产物。
[0146] 本发明的探针和方法可如上文中所述在均相中(即溶液中)使用,或可选择地通过 使用固相来在非均相中使用,例如其中第一 RCA产物被固定在固相上,从而允许使用洗涤步 骤。这可由靶分析物的固定所致,例如在原位检测过程中。固相测定的使用提供了有利方 面,特别是对于困难样品的检测:洗涤步骤可帮助除去未结合的和/或未连接的探针等抑制 组分,以及可从不期望地大的样品体积富集分析物。可使用更高的浓度和更大量的探针,因 为未结合的分析物、探针和RCA产物可通过洗涤除去。
[0147] 可以以各种方式实现第一 RCA产物和/或分析物在固相上的固定。因此,设想了几 个固相测定的实施方式。在一个此类实施方式中,分析物首先可被固定的(或可固定的)捕 捉探针捕获,可产生第一 RCA产物以使其附着于所述分析物,例如通过用于第一 RCA产物的 引物附着于分析物(例如通过偶联于分析物的结合伴侣),然后第一 RCA产物可被随后添加 的产生用于第二RCA的模板的(多个)探针结合。或者,可简单地将第一 RCA产物固定于固体 载体。例如,可为第一 RCA产物的引物提供可固定基团或部分或装置以便固定,或可在第一 RCA之前固定所述引物。
[0148] 可以以任何便利的方式将固定的捕捉探针或第一RCA引物或第一RCA产物固定,BP 结合于载体。因此可根据选择从许多固定装置和固体载体(如在本领域中众所周知的和文 献中描述的)挑选固定的方式或装置以及固体载体。因此,捕捉探针或第一 RCA引物或第一 RCA产物可被直接结合于载体(例如通过化学交联),其可通过连接基团,或通过(多个)中间 结合基团(例如通过生物素-链霉抗生素(streptavidin)相互作用)间接结合。因此,可为捕 捉探针或第一 RCA引物或第一 RCA产物提供在载体上提供的用于固定的装置(例如亲和结合 伴侣,例如生物素或半抗原或核酸分子,其能够结合于其结合伴侣,即同源结合伴侣,例如 链霉抗生素或抗体或核酸分子)。可在结合于分析物之前或之后固定捕捉探针。此外,可将 此类"可固定的"捕捉探针与同载体一起的样品接触。类似地,可在第一 RCA等之前或之后固 定第一 RCA引物。
[0149] 捕捉探针可以例如是能够特异性结合于靶分析物的抗体或核酸分子。换句话说, 捕捉探针可以是固定的(或可固定的)包含分析物结合域的分析物特异性探针(即分析物捕 捉探针)。因此在此类实施方式中,首先利用固定的或可固定的捕捉探针捕获分析物,所述 探针仅用于将分析物固定在固相上,随后将固定的分析物经历使用第一 RCA模板或导致第 一RCA模板产生的检测方案,其中用于第一RCA的引物附着于分析物。在此类实施方式中,所 述捕捉探针可以是能够直接或间接结合分析物的任何结合伴侣。更具体地,此类捕捉探针 特异性结合分析物。
[0150] 固体载体可以是目前被广泛使用的或被提出用于固定、分离等的任何公知的载体 或基质。这些载体可采用颗粒(例如可以是磁性或非磁性的珠粒)、薄片、凝胶、滤纸、膜、纤 维、毛细管或微量滴定条、管、平板或孔等的形式。
[0151] 所述载体可以由玻璃、硅石、胶乳或聚合物材料制成。呈现高的表面积的用于结合 分析物的材料是合适的。此类载体可具有不规则表面,并且可以是例如多孔的或颗粒性的, 例如颗粒、纤维、网、烧结体或筛子。颗粒材料例如珠粒因它们的更大的结合能力而为有用 的,特别是聚合物珠粒。
[0152] 便利地,根据本发明使用的颗粒固体载体将包括球形珠粒。珠粒的尺寸不是至关 重要的,但是它们可以例如具有至少Ιμπι、优选至少2μπι的直径的量级,并且具有优选不超过 ΙΟμπι,例如不超过6μηι的最大直径。
[0153] 单分散颗粒,即在尺寸上基本上均一(具有小于5%的直径标准差的尺寸)的那些 单分散颗粒,具有它们提供非常均一的反应再现性的有利方面。代表性单分散聚合物颗粒 可通过在US-A-4336173中描述的技术来产生。
[0154] 然而,为了帮助操作和分离,磁性珠粒是有利的。如本文中所用,术语"磁性的"是 指当被置于磁场中时载体能够赋予其磁矩,即顺磁的,并因此在该场的作用下是可移动的。 换句话说,包含磁性颗粒的载体可通过磁性聚集而被容易地去除,这提供了快速、简单和高 效的在分析物结合步骤后分离颗粒的方式。
[0155] 在其它实施方式中,分析物本身可以例如通过非特异性吸附而被固定(或可固定 的)在固相上。在一个具体的此类实施方式中,分析物可存在于附着(能够附着)于固体载体 的细胞(可选地被固定和/或透化)内,例如可将包含分析物的组织样品固定在显微镜载玻 片上。
[0156] 上述方法通常导致存在于反应混合物中的靶依赖性第一RCA产物(即只在靶分析 物的存在的情况下才产生的第一 RCA产物)的检测。这导致第二RCA产物的产生,这反过来提 供了在待测定的样品中的靶分析物的量的测量。该测量可以是定性的或定量的。
[0157] 因此,用于检测一种或多种靶分析物在复杂样品中的存在的上述探针和方法用于 多种不同的应用。
[0158] 主题探针和方法可用于筛选样品的一种或多种靶分析物在样品中的存在或不存 在。如上文中所指示的,本发明提供了用于检测一种或多种靶分析物在样品中的存在或定 量所述靶分析物的量的探针和方法。
[0159] 主题探针和方法可用于检测一种或多种靶分析物在多种不同类型的样品(包括具 有大量非靶实体的复杂样品)中的存在。所述主题方法对于检测样品或复杂样品中的一种 或多种靶分析物是高度灵敏的。
[0160] 根据上文中的描述和下文中描述的代表性实例,很明显,本发明的方法和探针具 有优于现有方法的有利方面。值得注意的是,所述方法允许来自第一 RCA产物的信号的信号 放大(从而提高方法的灵敏度)以及也如上文中所指出的,更快的信号产生。提高的灵敏度 可允许仅以低的量存在的分析物被检测到。基本上,所述方法允许从RCA反应产生增强的信 号。形成更大更显著的反应产物,其可被更迅速和更容易地检测到。来自第二RCA产物的放 大的信号被局限于第一 RCA产物。这可允许分析物的高度灵敏的局部检测,例如原位检测。
[0161] 因此在根据本发明的方法中,可以以高度特异性的方式产生第一RCA产物,即第一 RCA产物,或事实上第一 RCA模板的产生可严格取决于分析物的存在(例如在锁式探针,或使 用接近式探针的测定的情况下,所述探针必须结合并相互作用以产生环状RCA模板)。有利 地,根据本方法,第二RCA取决于第一RCA产物(如在上文中论述的),但对该第二RCA步骤中 的特异性的要求不太严格(事件上其可以是远不严格)并且可耐受第二RCA产物的一定程度 的背景产生,因为在第一 RCA产物不存在的情况下,这将远低于其存在的情况(在信号强度 和尺寸方面)。在第一RCA产物存在的情况下,即当sRCA反应发生时,产生非常强的信号放 大。这在下列实施例中得以证明。
[0162] 然而不希望受理论束缚,据信两代或更多代RCA产物,当附着在一起并且被标记 (例如,利用例如针对第二RCA产物的检测探针)时,将作为单个颗粒一起在液体中游动。这 可打开使用用来检测第二RCA产物(或所述方法的sRCA产物)的其它检测方式(例如流式细 胞术或CyTOF)的可能性,从而拓宽了可用于RCA基测定中的检测的仪器基础。
[0163] 由第二RCA反应提供的强信号放大可允许信号迅速和容易的可视化(例如通过在 低放大倍数下的显微镜观察或在数字扫描图像上),并从而可允许在临床情形中对测定结 果进行快速容易地目测观察,例如用于常规用途的病理结果的观察。因此本发明的方法特 别适合于临床分析程序。
[0164] 如上文中所指出的,可检测第一和第二RCA产物,从而允许第二产物在例如低放大 倍数下被容易地检测到,同时通过使用对于第一RCA产物是特异性的检测探针,保存第一 RCA产物的更精确定位。
[0165] 这可以例如有助于鉴定人组织中的稀有的完整病毒基因组拷贝,或另外地检测稀 有的RCA产物,例如在组织的无效突变检测时。当稀有事件的容易鉴定可以有帮助时的另一 个实例是当在绝大多数非CTC细胞当中筛选循环肿瘤细胞(CTC)的存在时。sRCA反应的强信 号允许在低放大倍数下快速且容易地鉴定事件(CTC的检测),并且在更高放大倍数下可视 化的第一 RCA产物的更精确定位允许确认信号源于CTC而不是源于相邻的非CTC细胞。
[0166] 可通过在第一 RCA继续进行的同时启动第二RCA来实现的更快的信号放大也在上 文中进行了论述。因此,所述方法允许RCA依赖性检测测定被加速,这在医疗点场所(例如医 生的办公室等)中可具有价值。通过在sRCA法中进行进一轮或进一代RCA,速度和/或信号强 度的进一步增加是可能的。
[0167] 信号强度/速度的增加可允许其它检测方法超过常规基于荧光的方法,例如使用 浊度计计数、磁性计数、颗粒计数、电传感、表面传感以及基于重量的检测技术。例如在1小 时的扩增后来自第二代RCA的一种单独的sRCA产物具有数飞克的潜在重量。此类重量增加 可通过本领域中已知的方法和装置(诸如悬臂、表面等离子体方法和微量天平例如石英晶 体微量天平等)来检测。
[0168] 由于本发明的方法产生增强的被局限于第一RCA的产物的信号,因此其还赋予使 用标准流式细胞术或被分配在平面等上以进行高精度数字检测来计数由个别核酸环(第一 RCA模板)触发的个别反应产物(第二RCA产物)的能力。因此,所述方法可允许与数字PCR等 同的反应,但无需乳剂或微加工结构,或找到其中每区室存在正好1个模板的条件。
[0169] 从本发明的方法衍生的大量扩增产物将进一步允许个别DNA环的克隆,因为获自 个别环(例如第一 RCA模板)的产物可以被可视化。个别sRCA产物因而可被鉴定和分离。例 如,利用本发明的扩增方法,可在用于分离的低熔点琼脂糖中实现可视化而无需放大,并且 随后可分离产物,例如用牙签挑出,类似细菌菌落的分离。
[0170] 本发明的sRCA法提供鉴定和计数甚至非常稀有的突变的潜能,包括当使用相对易 错突变检测方法时。因此,第一 RCA产物可使用含有突变的分析物靶核酸环作为第一 RCA模 板来产生,并且突变序列在第一 RCA产物中的反复出现可通过使用用于第二RCA的等位基因 特异性(例如突变特异性)探针(即识别存在于第一 RCA产物的单体重复中的突变序列的探 针)来检测。
[0171] 稀有突变的检测对于临床诊断是非常重要的。例如,某些基因的突变(例如KRAS突 变)在诊断上可以是非常重要的,并且可用于鉴定对特定疗法(例如抗-EGFR疗法)的获得性 抗性的出现。近年来许多努力已集中在开发用于检测这类突变的方法上。本发明的方法可 为这类方法提供有用的添加。
[0172] 使用本发明的sRCA反应检测稀有突变的方法的实例可包括从靶细胞分离DNA,片 段化DNA,使用被设计来具有两个靶特异性末端(所述末端特异性结合到感兴趣的靶区并允 许靶片段被环化)的"选择者"探针来分离可含有感兴趣的靶序列(例如突变)的片段,以及 使用环化的靶片段作为第一 RCA模板进行第一 RCA反应。可将因此产生的第一 RCA产物经历 本发明的sRCA法。用于第二RCA的探针可被设计来识别(例如结合,和/或被连接)期望被检 测到的突变序列。因此,通过分离靶序列来产生第一 RCA模板,提供了产生包含多个(互补) 拷贝的靶序列的第一 RCA产物的机会。因此,可在多联体第一 RCA产物中产生增加的数目的 "革巴"。这些靶中的每一个靶可被探针(所述探针可被设计来对于期望被检测出的突变是特 异性的)结合,以启动第二RCA反应,随后可检测第二RCA产物以检测所述突变。
【附图说明】
[0173] 本发明将参考下列非限制性实施例和参考下列附图来进一步描述,其中:
[0174]里1描绘了根据本发明的代表性锁式探针sRCA反应。
[0175] 图2示出了显示连接效率对RCA产物的影响的实验的结果。利用dUTP产生第一 RCA 产物,孔1-7具有含dUTP的RCA产物,并且孔1-6具有连接的锁式探针(第二RCA探针)。孔1-2 中的锁:RCA单体比率为3 : 9,在孔3-4中为3 :1,并且在孔5-6为3 : 0.02。只用UNG或用UNG Exol/111处理来自孔1-6的样品。UNG只降解RCA产物,而exol/111处理降解所有单链或双链 寡核苷酸,并且只有环化的DNA可保持完整。在孔8中,只存在锁,并且在Exol/111处理后,其 被完全降解。在孔9-12中,只有不同浓度的锁作为浓度参照来估计不同锁:RCA单体比率下 的连接效率。
[0176] _示出了不同温度下对锁sRCA反应产物的稳定性测试的结果:不加热,65°C持续 5或10分钟,95 °C持续5或10分钟。
[0177] _示出了来自3轮RCA的结果。RCA反应产物全部用Cy3寡核苷酸进行标记,并且在 相同的曝光时间200ms下拍摄(除100X物镜图像外,其在93ms下拍摄)。如下进行总体实验: 1RCA样品:滚动100分钟;2RCA样品:第一次滚动20分钟,第一次连接20分钟,并且第二次滚 动60分钟,3RCA样品:第一次滚动20分钟,第一次连接20分钟,并且第二次滚动20分钟,第二 次连接20分钟,并且第三次滚动20分钟。所有样品的总体反应时间相同(100分钟)JRCA背 景和3RCA背景是其中不存在第一 RCA模板的对照实验,并且显示来自sRCA探针的RCA信号。 [0178] 图5比较了通过100X EPI显微镜或100X SIM获得的锁式sRCA反应的结果。并且将 它们在垂直方向上配对。
[0179] _示出了利用接近式连接测定(PLA),使用锁式sRCA在Hs578T乳腺癌细胞系中原 位检测Lgr5靶抗原的实验的结果。原位锁式探针(第二探针):兔+/_,针对相同的初级Lgr5 抗体。该第一滚动锁具有两个连接位点。在常规RCA和sRCA图中,应用正和负PLA探针,但在 sRCA背景图中,只应用正探针。在滚动设置中,第一RCA步骤花费1小时,并且随后在sRCA和 sRCA背景孔中进行30分钟连接,在连接步骤过程中,只用连接缓冲液孵育常规RCA孔。在RCA 连接步骤后,使RCA反应滚动另外1小时。利用相同的检测寡核苷酸序列和荧光团(Cy3)检测 常规RCA和超级RCA。在相同曝光时间下拍摄所有6个图像,对于DAPI,曝光时间为90ms,对于 Cy3通道,曝光时间为1500ms。上面3个图像是在20X物镜下拍摄的,下面3个图像是在10X物 镜下拍摄的。在相同位置拍摄两张来自每一个实验设置(常规RCA、sRCA、sRCA背景)的图像 (10X和20X)。
[0180] g示出了在载玻片上进行的并使用HRP读出器检测的锁式sRCA反应的结果。使用 2.5X物镜通过亮视野显微镜术拍摄图像。
[0181] _示出了在载玻片上进行的并使用HRP读出器检测的锁式sRCA反应的结果。使用 10X物镜通过亮视野显微镜术拍摄图像。
[0182] 图9呈现出显示通过流式细胞术在不同浓度的第一 RCA锁lpM、100fM、10fM和lfM下 进行的锁式sRCA产物的检测的点图。
[0183] 图10是显示来自实施例7中的流式细胞术实验的变异系数的图。棱形显示计算为 来自3个不同计数的平均数的不同输入锁浓度(以fM显示)下的事件。正方形显示基于3个计 数计算的变异系数(CV)。
[0184] 图11是显示比较锁式sRCA反应(直线曲线)与不同锁浓度(5nM、lnM、750pM、500pM、 250pM、125pM、75pM和50pM)下的常规RCA(仅一轮)的RCA生长曲线(荧光对循环数)的放大 图。在37°C将5pM的第一RCA模板滚动60分钟。第一锁的尺寸为87bp,并且假定在37°C下 phi29酶的滚动速度为2000个碱基/分钟,存在约1379个锁负链的重复。随后用ΙΟΟηΜ第二 RCA锁在37 °C下连接第一 RCA产物,进行30分钟。此后,添加 sybr和滚动混合物,并将其放入 PCR仪以测量每一分钟的荧光值。
[0185] 图12是比较结合至第一RCA产物的具有不同长度的靶互补区(8个+8个、10个+10 个、12个+12个、14个+14个、16个+16个、18个+18个和20个+20个核苷酸)的锁的在锁式sRCA 反应中的滚动效率的图。使用一系列90bp长的锁,其具有相同的背景和连接位点,锁之间的 差异为用于杂交的臂长度。最长臂为20个+20个,并且对于较短的臂,将边界碱基突变成不 匹配的碱基。将第一 RCA产物预滚动1小时,并且随后在RCA产物上连接第二RCA锁,进行1小 时。随后将滚动混合物和sybr金添加至连接混合物中,并将其放入Q-PCR仪以监测每一个反 应的生长曲线。每1分钟收集数据,持续4小时。
[0186] 图13呈现显示图12的具有不同长度的靶互补区(臂长度)的二级锁在RCA产物上的 连接效率的凝胶图像。泳道1:20+20;泳道2:18+18;泳道3:16+16;泳道4:14+14;泳道5:12+ 12;泳道6:10+10;泳道7:8+8)。
【具体实施方式】
[0187] 实施例
[0188] 锁式RCA材料和方法
[0189] 寡核苷酸
[0190] 所有寡核苷酸订购自Integrated DNA Technologies,Inc,并且所述寡核苷酸序 列列于表1中。如果适用,表中包括特定的5'和3'末端修饰。
[0191] 第1锁式连接
[0192] 通过添加 ΙΟΟηΜ引物寡核苷酸(SEQ ID N0.1)、100nM sRCA-p-s3bc锁式寡核苷酸 (SEQ ID NO .10)、IX缓冲液4(New England Biolabs )、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA连接酶 (Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)在50yL反应中进行第1 锁 式连接。将反应在37 °C下30分钟,随后在65 °C下加热灭活20分钟。
[0193] 第1RCA产物的产生
[0194] 通过添加0.5μ1的第1锁式连接混合物至50μ1的滚动混合物(由IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP或ImM含尿啼啶dNTP组、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)来进行第一RCA产物的产生。将 反应在37°C下孵育75分钟,随后在65°C下加热灭活1分钟。
[0195] 在实施例1至8中,用于sRCA的锁中的靶互补区的长度为10+10个核苷酸。
[0196] 实施例1
[0197] 本实施例研究不同锁:RCA单体比率的连接以及效率和效果。
[0198] 大致实验设置如下:通过使用含dUTP的dNTP组产生第一 RCA。然后添加不同锁浓度 与连接组分。连接后,用UNG或UNG+外切核酸酶Ι/Ill处理反应混合物以降解第一 RCA产物或 第一 RCA产物和所有未连接的线性锁。然后用6%TBE-尿素凝胶分析样品。
[0199] 将几个不同量的预产生的含尿嘧啶的第1RCA产物添加至50μ1第2锁式连接混合物 (其由 IX缓冲液4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U Τ4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bx锁式寡核苷酸(SEQ ID No. 11)组成)中以获得3:9、3:1或3:0.02的第2RCA锁:第1RCA单体。将反应物在37°C下孵 育30分钟。然后将每一个第二连接混合物分成两部分,一部分添加0.02U尿嘧啶-DNA糖苷酶 (Thermo-Scientif ic)、0· 2U内切核酸酶IV(New England Biolabs),另一部分添加0 · 02U尿 啼啶-DNA糖基化酶(Thermo-Scientif ic)、0· 2U内切核酸酶IV(New England Biolabs)、 0.4U外切核酸酶 I (New England Biolabs)和4U外切核酸酶 III (New England Biolabs)。将 反应在37°C下孵育60分钟。然后将5μ1的每一个样品与5μ1的2XNovex?TBE-尿素样品缓冲 液(Invitrogen)混合,随后在80°C下进行变性,并在加热后立即置于冰上。将10μ1的每一个 样品装载至6%ΤΒΕ-尿素凝胶(Invitrogen)的每一个孔中,并用180伏运行60分钟。然后用 IX SYBR金(Invitrogen)lXTEB缓冲液对凝胶进行染色,利用Gel DOC EZ系统(Bio-Rad)进 行成像。结果示于图2中。
[0200] 实施例2
[0201] 稳定性测试
[0202] 进行本实施例以测试锁式sRCA在高温ex 65°C和95°C下的稳定性。将ΙμL第一RCA 产物添加至50μ1第二锁式连接混合物(由IX缓冲液4(New England Biolabs)、0.2mM ΑΤΡ、 0.02U T4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)以及 ΙΟΟηΜ p-bx锁式寡核苷酸(SEQ ID如.11)组成)中。将反应在37°(:下孵育30分钟。然后将 ImM dNTP、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸和200nM sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸以及0.1U phi29 聚合酶(Thermo-Scientific)添加至反应混合物中,随后在37°C下孵育100分钟。然后将反 应混合物分成5部分,并且每一个部分经历不同加热处理条件。随后将10μ1的每一个加热样 品置于多聚L-赖氨酸载玻片上,并用ΕΡΙ焚光显微镜(Carl Zeiss)显现。结果示于图3中,该 图显示锁式sRCA反应产物可在于65 °C和95 °C下加热后被检测到。
[0203] 实施例3
[0204]实验比较使用锁式探针进行不同轮的RCA的结果,并且显示可通过锁式sRCA获得 的信号放大;对于2(2RCA)或3(3RCA)轮的RCA看到较强的信号。
[0205]用涂覆有链霉抗生素的载玻片(Surmodics)在37°C下孵育50μ1的ΙρΜ第一锁式连 接混合物30分钟,随后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗涤2次。然后将50μ1的RCA混合物 (由IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加至载玻片,并在37°C下孵 育20分钟,随后用50μ1的1XPBS+0.05%Tween 20洗涤2次。之后,将50μ1的连接混合物(由IX 缓冲液 4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U Τ4 DNA 连接酶(Thermo-Scientific) 以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bx锁式寡核昔酸(SEQ ID No.11) 组成)施加至载玻片上,并在37 °C下孵育20分钟,随后用50μ1的1XPBS+0.05 % Tween 20洗涤 2 次。之后,将 50μ1 的 RCA 混合物(由 IX 缓冲液 4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸(SEQ ID N0.6)和 0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加至载玻片上,并于37°C孵育下20分钟,随 后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗涤2次。然后将第三轮连接混合物(由IX缓冲液4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bw锁式寡核昔酸(SEQ ID NO. 14)组成)施加至载玻 片上,并于37 °C下孵育20分钟,随后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗涤2次。最后将50μ1 的RCA混合物(由 IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶 (Thermo-Scientific)、300nMsRCA-w-引物寡核苷酸(SEQ·IDN0·7)、200nMsRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸(SEQ ID N0.3)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加至载玻片 上,并在37 °C下孵育20分钟,随后用50μ1的1XPBS+0.05 % Tween 20洗涤2次。根据实验设置, 一些样品不具有2个或更多个滚动步骤,随后在最后的滚动步骤中提供200nM sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸(SEQ ID NO.3)。结果示于图4中。
[0206] 实施例4
[0207]本实验比较通过EPI和S頂显微镜进行的锁式sRCA结果的可视化。
[0208]用涂覆有链霉抗生素的载玻片(Surmodics)在37°C下孵育50μ1的ΙρΜ第一锁式连 接混合物30分钟,随后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗涤2次。然后将50μ1的RCA混合物 (由IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加至载玻片上,并于37°C下 孵育60分钟,随后用50μ1的lXPBS+0.05%TWeen 20洗涤2次。之后,将50μ1的连接混合物(由 IX 缓冲液 4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U Τ4 DNA 连接酶(Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bx锁式寡核苷酸(SEQ ID如.11)组成)施加至载玻片上,并于37°(:下孵育30分钟,随后用5(^1的1乂?83+0.05% Tween 20洗涤2分钟。之后,将50μ1的RCA混合物(由IX缓冲液4(New England Biolabs)或IX Olink缓冲液(由Olink Bioscience友好提供)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸(SEQ ID Ν0·6)、200ηΜ sRCA-d-S3-FITC寡核苷 酸(SEQ ID Ν0·2)、200ηΜ sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸(SEQ ID N0.3)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加至载玻片上,并于37°C下孵育60分钟,随后用50μ1的1XTOS+ 0.05%Tween 20洗涤2次。利用EPI焚光显微镜(Carl Zeiss)或Structured Illumination 显微镜(Carl Zeiss)获取图像。结果示于图5中。来自S頂和EPI的图像几乎相同;1RCA产物 不呈圆形,这在锁式sRCA样品中引起拉伸的形态。RCA缓冲液还可影响串滴的形状(在EPI中 比较21^缓冲液4与21^01丨1^缓冲液)。
[0209] 实施例5
[0210] 使用锁式sRCA的原位接近式连接测定(PLA)。
[0211]在本实验中,PLA是接近式连接测定,进行该测定以在如Hs578T乳腺癌细胞系中原 位检测Lgr5抗原。通过锁式sRCA检测相较于常规RCA( 1轮)的PLA产物。
[0212] 实验基本上遵照来自〇1 ink Duolink试剂盒(01 ink Bioscience)的方案。简言之, 将40μ1的0.3ng/yl LGR5N-末端抗体(Abgent)稀释物应用于细胞,在2次5分钟的1XTBS+ 0.05%Tween 20洗涤后,随后将40μ1的1:250的第二抗兔正和负探针(Olink Bioscience) 混合物的稀释物施用于细胞。然后,将4 0 μ 1的连接混合物(由1X T 4 D N A连接酶缓冲液 (Therm〇-Scientific)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA 连接酶(Thermo-Scientific)以及 0.〇2mg/ml BSA(New England Biolabs)、100nM S3l852Backpiece寡核苷酸(SEQ ID NO·8) 和lOOnM S3夹板寡核苷酸(SEQ ID如.9)组成)施加至载玻片上,并于37°(:下孵育30分钟, 随后用1XTBS+0.05 % Tween 20洗涤2次。之后,将40μ1的RCA混合物(由IX 01 ink缓冲液(由 Olink Bioscience友好提供)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)和 0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加于载玻片上,并于37°C下孵育60分钟,随 后用lXTBS+0.05%Tween 20洗涤2次。然后将第二连接混合物(由IX T4 DNA连接酶缓冲液 (Therm〇-Scientific)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)和0.02mg/ ml BSA(New England Biolabs)、100nM p-S3x padrCk寡核苷酸(SEQ ID N0.12WP100nM p-bx锁式寡核苷酸(SEQ ID NO. 11)组成)施加至载玻片上,并于37°C下孵育30分钟,随后用 1父丁85+0.05%了¥661120洗涤2次。最后将4(^1的1^4混合物(由1乂01丨1^缓冲液、1111]\1(1町?、 0.1U phi29聚合酶(Therm〇-Scientific)、300nM sRCA-w-引物寡核苷酸(SEQ ID N0.7)、 200nM sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸(SEQ ID Ν0·3)、200ηΜ sRCA-d-S3-Cy3(SEQ ID N0.4)和 0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组成)施加于载玻片上,并于37°C下孵育60分钟,随 后用lXTBS+0.05%Tween 20洗涤2次。然后用EPI荧光显微镜(Carl Zeiss)获取图像。结果 示于图6中。可见,可在根据本发明的sRCA中相较于常规RCA检测到较强的信息,而无增强的 背景,从而提供了提高的灵敏度。
[0213] 实施例6
[0214] 用涂覆有链霉抗生素的载玻片(Surmodics)在37°C下孵育50μ1的100fM/50fM/ 25fM/12.5fM/6.25fM/3.125fM第一锁式连接混合物30分钟,随后用50μ1 的 1XPBS+0.05% Tween 20洗涤2次。然后将50μ1 的RCA混合物(由 IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Therm〇-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)组 成)施加至载玻片上,并于37 °C下孵育60分钟,随后用50μ1的1XPBS+0.05 % Tween 20洗涤2 次。之后,将 50μ1 的连接混合物(由 IX 缓冲液 4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和100nM p-bx锁式寡核苷酸(SEQ ID NO. 11)组成)施加至载玻片上,并于37°C下孵育30分钟,随后用 50μ1的lXPBS+0.05%Tween 20洗涤2次。之后,将50μ1的RCA混合物(由IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Therm〇-Scientific)、300nM sRCA-χ-引 物寡核苷酸(SEQIDN0·6)和0·02mg/mlBSA(NewEnglandBiolabs)组成)施加至载玻片 上,并于37°C下孵育60分钟,随后用50μ1的lXPBS+0.05%Tween 20洗涤2次。之后,将50μ1的 检测混合物(由在IX Olink缓冲液(由Olink Bioscience友好提供)中的ΙΟΟηΜ的S3-HRP检 测寡核苷酸(SEQ ID NO.5)组成)施加至载玻片上,并于37°C下孵育60分钟,随后用50μ1的 lXroS+0.05%Tween 20洗涤2次。然后将DAB底物(Olink Bioscience)施加至载玻片上,将 混合物孵育15分钟,并随后用MQ水洗掉。利用2.5X物镜(图7)或10X物镜(图8)通过亮视野显 微镜拍摄图像。利用智能手机的照相机或具有额外微距镜头的计算机照相机可看到信号。
[0215] 实施例7
[0216] 流式细胞术检测
[0217] 将50μ1的第一RCA混合物(由lpM/100fM/10fM/lfM 1RCA连接的模板与IX缓冲液4 (New England Biolabs)、lmM dNTP,0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)-起组成)于37°C下孵育75分钟,随后在65°C下加热灭活1分 钟。之后,将〇.2mM ATP、0.02U T4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)和ΙΟΟηΜ p-bx锁式寡核 苷酸(SEQIDN0.11)添加在反应中,随后于37°C下孵育30分钟。然后将300nMsRCA-χ-引物 寡核苷酸(SEQ ID Ν0·6)、200ηΜ sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸(SEQ ID N0.3)和0.1U phi29聚 合酶(Thermo-Scientific)添加至反应混合物中,随后于37°C下孵育100分钟。然后用500μ1 C2CA缓冲液(由50mM Tris-HCI、20mM EDTA、0.1%Tween 20和 1Μ NaCl组成)稀释反应混合 物,利用LSRII流式细胞仪(BD Bioscience)分析样品。结果示于图9和10中。
[0218] 在本实验中,如图9中所示,只用FITC寡核苷酸标记sRCA串滴,这样在流式细胞术 中应当只存在FITC阳性事件,这显示于P2群体中。根据先前的实验,所有背景信号将出现在 其中FITC小于1000的区域,这样只有具有高于1000的FITC信号值的事件才会被计数为真实 信号。当运行样品时,将流式细胞仪设置至"高"流速,并将取样时间设置至1分钟。在该设置 中,ΙρΜ样品获得362,006个事件,100f Μ样品获得34,005个事件,1 Of Μ样品获得3,778事件, lfM样品获得446个事件。对于其中第一RCA锁被省略的样品,只存在1个事件。流式细胞术中 的剂量反应是完全线性的。对于检测效率,具有50ul的总体积的1 pM浓度的锁,存在3.01* 1〇7个锁分子,机器采集60uL的10倍稀释的反应混合物的样品,因此有3.612*10 6个分子流过 机器,我们检测到的数目为约362,006个,因此我们的检测效率为约10%。
[0219] 在图10显示的结果中,所有实验程序相同,并且流式细胞仪被设置至〃慢〃速率,取 样时间为1分钟。制备具有不同浓度的3个样品,并将每一个样品在流式细胞仪上运行3次, 记录数据。图10中用棱形显示的每一个事件是来自3个不同计数的平均数,并且基于3个计 数来计数CV值。在所有3个不同浓度下CV均低于5 %。
[0220] 实施例8
[0221] RCA生长曲线
[0222]本实验呈现以5pM的第一 RCA模板进行的锁式sRCA反应相较于以不同锁浓度进行 的"常规" RCA (即仅1轮)的比较。
[0223] 将50μ1第一RCA混合物(由5pM 1RCA连接的模板与IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)-起组成的)于37°C下孵育60分钟,随后在65°C下加热灭活1分钟。之后, 将(h2mM ATP、0.02U T4 DNA连接酶(Thermo-Scientific)、100nM p-S3x锁式寡核苷酸(SEQ IDN0.12)和100nMp-bx锁式寡核苷酸(SEQIDN0.11)添加在反应物中,随后于37°C下孵 育30分钟。然后添加300nM sRCA-x-引物寡核苷酸(SEQ ID Ν0·6)、1Χ SYBR金(Invitrogen) 和0.1U phi29 聚合酶(Thermo-Scientific)。同时,将 100nM p-bx锁式寡核苷酸(SEQ ID 腸.11)与1父(^1'(:1^8&86 11反应缓冲液^卩;^6111^6)、2.5111]\1]\111〇12、51](^1'(31^8&86 11 ssDNA连接酶(Epicentre)混合在一起。将反应混合物在60°C下孵育60分钟,随后在80 °C下 孵育 60 分钟。将 5nM/lnM/750pM/500pM/250pM/125pM/75pM/50pM 的自环化的 p-bx 寡核苷酸 (SEQ ID N0.11)与IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶 (Therm〇-Scientific)、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸(SEQ ID Ν0·6)、1Χ SYBR金 (Invitrogen)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)混合在一起。之后,利用MX3000Q-PCR(Stratagene)分析这些样品。循环参数为120个循环(37°C下持续1分钟)。结果示于图11 中。
[0224]直线曲线显示5pM的sRCA聚合速度。另外的曲线显示在不同锁浓度下的常规锁式 滚动曲线。每一个曲线的斜率代表滚动速度。如果我们假定Phi29聚合酶在所有样品中以相 同速度滚动,则斜率可代表每一个样品中有多少锁发生滚动。5pM sRCA产生与SnM常规锁几 乎相同的速度,因此两轮sRCA产生1000倍的信号的增强。
[0226] 实施例9
[0227] 本实验显示靶互补区(RCA产物上的锁的杂交臂)的长度如何影响第二RCA锁的滚 动效率。
[0228] 使用一系列90bp长的锁,其具有相同的骨架和连接位点,但不同在于用于杂交的 臂长度。最长臂为20+20,并且对于较短的臂,使边界碱基突变成不匹配的碱基。
[0229] 将第一 RCA产物预滚动1小时,然后使第二RCA臂在RCA产物上连接1小时。然后将滚 动混合物和sybr金添加至连接混合物中,并放置在Q-PCR仪中以监测每一个反应的生长曲 线。每隔1分钟收集数据,持续4小时。
[0230] 将50μ1第一RCA混合物(由5pM 1RCA连接的模板与IX缓冲液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶(Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)-起组成的)于37°C下孵育60分钟,随后于65°C下加热灭活1分钟。之后, 将100nM的sRCA-p-S3x20(SEQ ID N0.15)、sRCA-p-S3xl8(SEQ ID N0.16)、sRCA-p-S3xl6 (SEQIDN0.17)、sRCA-p-S3xl4(SEQIDN0.18)、sRCA-p-S3xl2(SEQIDN0.19)、sRCA-p-S3xlO(SEQ ID N0.20)、sRCA-p-S3x8(SEQ ID N0.21)分别与0.2mM ATP、0.02U T4 DNA连接 酶(Thermo-Scientific)混合,随后于37°C下孵育30分钟。获取等份,用0.02U尿嘧啶-DNA糖 苷酶((Thermo-Scientif ic)、0· 2U内切核酸酶IV(New England Biolabs)在37°C下处理60 分钟,然后在10 % TBE-尿素凝胶(Invi trogen)中分析反应混合物。然后将剩余样品与300nM sRCA-χ-引物寡核苷酸、IX SYBR 金(Invitrogen)和0.1U phi29 聚合酶(Thermo-Scientific)混合。用MX3000Q-PCR(Stratagene)分析样品。循环参数为120个循环(37°C,持 续1分钟)。
[0231] 结果示于图12中。从该图很清楚的是,臂(靶互补区)的长度越短,锁在第二RCA反 应中可滚动越快。8+8锁产生最佳结果。将10+10锁与12+12锁相比较,它们具有几乎相同量 的连接的锁,但10+10滚动更快。20+20锁的曲线几乎是平的,确实显示了第二RCA以极低的 几乎不可察觉的水平发生。18+18锁具有略微较高的背景,因此信号似乎比实际情况强。通 常的做法是此时评估图如该图以忽略前几个循环和测量从其的增加。事实上,为了更好的 结果评估,不是看如图12中显示的终点测量,而是如Nilsson等,2002,30(14) ;e66中描述 的,可制备生长曲线的导数。然而,结果显示了长度与RCA反应效率之间的关系。结果显示对 于使用锁式探针的成功且高效的RCA,所述探针应当具有小于20或小于18的臂长(靶互补区 的长度)。可用达到16的臂长获得第二RCA,但利用较短的臂长可提高效率。因此,结果支持 达到或小于14,或更具体地达到12或小于12的臂长可产生较好的结果。
[0232] 进行进一步实验以评估不同锁的连接效率的结果示于图13中。这显示臂的长度也 影响连接效率,并且较短的锁具有略微更好的连接效率。
[0233] 实施例10.
[0234] 下面提供用于进行本发明的方法的方案,其中在可环化的探针连接后,进行除去 未结合的和/或未连接的探针(可环化的寡核苷酸)的清除步骤(3'外切核酸酶降解-步骤 IV)。
[0235] I-杂交和连接
[0239] III-第二锁杂交和扩增酶连接

【主权项】
1. 一种用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法,其中第二RCA反应的产物附 着并从而局限于第一 RCA反应的产物,所述方法包括: (a) 提供包含重复单体的多联体第一 RCA产物; (b) 将包含靶互补3'和5'末端区的可环化的寡核苷酸与所述第一RCA产物的单体直接 或间接杂交,以便所述寡核苷酸的3'和5 '末端并置地杂交以彼此直接或间接地连接,其中 所述靶为所述第一 RCA产物的单体或与其杂交的中间分子中的序列,并且其中所述可环化 的寡核苷酸的祀互补末端区的长度为6个至16个核苷酸; (c) 将所述可环化的寡核苷酸的末端直接或间接连接以环化所述寡核苷酸,从而提供 用于第二RCA反应的模板,其中当所述末端间接连接时,(i)提供在所述可环化的寡核苷酸 的3'与5'末端之间与所述第一RCA产物的单体杂交,以便其可连接于各自末端的间隙寡核 苷酸,或通过聚合酶延伸所述可环化的寡核苷酸的杂交的3'末端以便延伸的3'末端可连接 于杂交的5'末端,并且(ii)与所述单体直接或间接杂交的第二RCA模板的区域的总长度不 长于32个核苷酸;和 (d) 使用(c)的所述第二RCA模板和用于所述第二RCA的引物进行第二RCA反应,以形成 第二RCA产物,其中在所述第二RCA反应中,所述第二RCA模板保持附着于所述第一RCA产物, 从而所述第二RCA产物附着于所述第一 RCA产物。2. 根据权利要求1所述的方法,其中所述可环化的寡核苷酸与所述第一 RCA产物直接杂 交。3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中步骤(a)包括产生第一 RCA产物。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中重复步骤(a)、(b)、(c)和(d) -次或多 次。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述可环化的寡核苷酸的靶互补区的 长度为6~15个、6~14个、6~13个、6~12个、6~11个或6~10个核昔酸。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述可环化的寡核苷酸的靶互补区的 长度为7~12个、7~11个、7~10个或7~9个核苷酸。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述第二RCA模板的杂交区域的总长 度不长于30个、28个、26个、24个、20个、19个、18个、17个或16个核苷酸。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中在所述可环化的寡核苷酸的杂交之后 或其连接之后提供用于所述第二RCA反应的引物。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述方法是均相的。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中,以基于固相的形式进行所述方法。11. 根据权利要求10所述的方法,其中,固定化所述第一RCA产物。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述方法包括在所述可环化的寡核 苷酸的杂交之后或其连接之后的一个或多个洗涤步骤。13. 根据权利要求12所述的方法,其中,在步骤(c)之后但在步骤(d)之前进行严格洗涤 的步骤以除去未连接的寡核苷酸。14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中,阻断性寡核苷酸在所述可环化的 寡核苷酸之间与所述第一 RCA产物杂交。15. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中,在所述可环化的寡核苷酸的连接 之后提供具有3'外切核酸酶活性的组分。16. 根据权利要求15所述的方法,其中,在于步骤(d)中添加所述引物之前提供所述具 有3 '外切核酸酶活性的组分。17. 根据权利要求1至16中任一项所述的方法,所述方法进一步包括检测所述附着的第 二RCA产物。18. -种用于检测样品中的分析物的方法,其中第一环状RCA模板从核酸分析物产生, 或用作或产生为所述分析物的标志物,所述方法包括使用所述第一 RCA模板进行第一 RCA反 应来产生第一 RCA产物,进行如根据权利要求1至17中任一项中所定义的局部第二RCA反应, 以及检测所述第二RCA产物,和任选的所述第一 RCA产物,从而检测所述分析物。19. 根据权利要求18所述的方法,其中所述第一 RCA产物通过免疫RCA或接近式探针测 定产生。20. 根据权利要求18或19中任一项所述方法用于检测样品中的不止一种分析物,其中 提供不同的可环化的寡核苷酸用于每一种分析物,并且每一种所述可环化的寡核苷酸包含 不同的报告域以检测所述第二RCA产物,或相继地检测所述分析物。21. 根据权利要求17至20中任一项所述的方法,其中,通过使用核酸染色或通过使用经 标记的核苷酸以掺入所述RCA产物中,来使用与所述RCA产物特异性杂交的经标记的检测寡 核苷酸检测所述RCA产物。22. 根据权利要求17至21中任一项所述的方法,其中,使用液相色谱、电泳、质谱、显微 镜检查、实时PCR、焚光探针、微阵列、比色分析诸如ELISA、流式细胞术、质谱(CyTOF)或利用 浊度计计数、磁性计数、颗粒计数、电传感、表面传感以及基于重量的检测技术来检测所述 RCA产物。
【文档编号】C12Q1/68GK105980579SQ201480073057
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年11月14日
【发明人】乌尔夫·兰德格伦, 陈磊
【申请人】欧凌科生物科技公司
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