电容传感器及使用方法
【专利摘要】使用具有电极和传感器表面和信号处理器的电容传感器检测液体样品内的分析物。干燥所述样品以降低其液体成份，干燥后进行电容测量，优选地，干燥前也测量。所述样品可以包括颗粒，所述分析物是颗粒的一部分或连接至颗粒，与不存在颗粒时相比，所述颗粒提供电容变化的主要部分。在另一实施例，所述颗粒是退化的，进行加热时，形成整体质量，增加电容变化的程度。
【专利说明】
电容传感器及使用方法
【背景技术】
[0001]本发明涉及电容传感器，设置为检测和定量通过传感器表面的液体样品中的分析物。
[0002]这种电容传感器是已知的，例如在“Adsorpt1n of Blood Proteins on MetalsUsing Capacitance Techniques，，，Stoner等，The Journal of Physical Chemistry,Vol.74,N0.5 ,March 5，1970中所描述。其描述了两个工作电极，其上吸附了血液蛋白质，从而改变电极之间的电容。显示第三(参比)电极浸在液体中，以控制DC电压。虽然此设置看似对目标血液蛋白质有效，值得注意的是，为获得足够的可外部测量的电容(微法)，所述工作电极较大(.05cm2)，并且由贵金属(金，铂，汞)制造以降低腐蚀、氧化或与液体溶液的反应。参比电极由镀铂构成。因此，所得到的装置显得较大、由昂贵的贵金属和贵重金属制造，显然不适合于小型化、便携和大容量低成本制造。还可以看出，其不适合于测量纳米组件，例如珠、纳米颗粒，或DNA和RNA分子的较小(毫微微法拉或阿法)电容。这样的灵敏度是例如，生物分析物，如DNA的直接定量所需的。由于那篇文章，许多在此期间的出版物，例如US8105478，提出了如金电极、氯化银参比电极并集成于含电荷放大器电路硅衬底上的变形。但是，这些材料昂贵，并且对于大容量低成本的标准CMOS半导体技术是不易得到的。所述参比电极材料的颗粒甚至可能干扰待测分析物。
[0003]Morena-Hagelsieb等人的文章Sensitive DNA electrical detect1n based oninterdigitated A1/A1203 microelectrodes"，Sensors and Actuators B: Chemical,vol.98,n0.2-3,15March 2004，pp.269-274中描述了检测DNA的多种基于电学的方法。
[0004]US2013/0189687(Panasonic Corp)描述了一种用于测量焦磷酸和SNP分型的方法。这是一种电化学传感器，测量毫微安培水平的电流。
[0005]JP2004061144(Japan Science and Tech Corp)描述了一种利用磁场传感器的抗原-抗体反应检测方法。
[0006]W088/10272(NicholSOn)描述了一种保存体液样品的方法。这包括干燥血液样品，以便于运输，然后再水合样品用于测试。
[0007]本发明的一个目的是提供一种传感器，其更紧凑和便携，和/或更耐用，和/或制造成本更低，和/或对纳米级目标组分的存在具有更高的灵敏度。另一个目的是避免参比电极和昂贵的贵金属。另一个目的是消除腐蚀和电极漂移问题;并确保传感器不降解或干扰分析物材料。
【发明内容】
[0008]根据本发明，提供了一种使用电容传感器检测液体样品中分析物的方法，所述电容传感器具有电极和传感器表面，以及与所述电极连接的处理器，所述方法包括以下步骤:
[0009]使样品与所述传感器表面接触，
[0010]测量样品的电容，和
[0011 ]使用所述测量提供关于分析物的数据。
[0012]在一个实施方式中，该方法包括干燥样品和测量干燥样品的电容的步骤。
[0013]在一个实施方式中，该方法进一步包括以下步骤:
[0014]干燥前测量样品的电容，
[0015]取得来自干燥前和干燥后进行的所述测量的分析数据。
[0016]在一个实施方式中，所述样品包括颗粒，并且所述分析物是所述颗粒的一部分或附着至所述颗粒，并且所述颗粒提供电容变化的主要部分。
[0017]在一个实施方式中，所述颗粒是附着至分析物分子的珠。优选地，所述分析物分子是目标核酸(NA)分子链，例如DNA或RNA。
[0018]在一个实施方式中，所述传感器具有CMOS构造(architecture)，其中CMOS层提供电极和信号处理电路(10)。优选地，所述电极(3，4)被保护层(5)覆盖。在一个实施方式中，电极被氮化物覆盖。
[0019]在一个实施方式中，所述传感器具有平坦的顶部表面，无例如键合线(bond wire)的特征。在一个实施方式中，所述传感器包括TSV芯片。在一个实施方式中，保护层厚度在1μm至3μηι范围内。
[0020]在一个实施方式中，所述传感器包括传感电容器(Cs)和参比金属-绝缘体-金属(MM)电容器(Cr)，并且所述电容器形成二阶Sigma-Delta开关电容调制器A/D转换器(12)的前端(U)，所述转换器提供一位数字输出位流，代表传感电容器和参比电容器之间的电荷平衡，并且包括用于平均所述位流以提供数字输出字的滤波器(filter)(13)。
[0021 ] 在一个实施方式中，所述样品通过包含在CMOS结构(structure)的层内的加热器干燥，CMOS结构在顶部包括电极。在一个实施方式中，所述信号处理器监测样品液体蒸发的速率，以提供分析物的特征标志。在一个实施方式中，所述样品是奶，该方法确定蛋白质和/或酪蛋白浓度。
[0022]在一个实施方式中，所述传感器包括固定在传感器表面上的探针，所述探针经选择以附着至样品中的目标NA分析物，并且在所述附着后进行测量。优选地，所述传感器具有镍涂层以选择性地结合his标签蛋白。在一个实施方式中，所述表面具有硫醇自组装单层(SAM)以结合DNA或PNA探针。
[0023]在一个实施方式中，所述方法包括提供用于结合分析物的PNA探针的步骤。
[0024]在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤:
[0025]提供位于传感器表面上的PNA探针，并通过暂时停止信号处理器并在传感器的多个电极上设置正电压将DNA分子吸引到传感器表面，和
[0026]一旦目标DNA分子结合至PNA探针，则向所述电极施加负电压以排斥任何非特异性结合的DNA分子，而特异性结合的目标DNA分子由于Watson-Crick互补结合能而保持束缚在表面，和
[0027]恢复信号处理器运转以测量电容。
[0028]在一个实施方式中，信号处理器调制电极驱动频率并允许在表面进行分析物的光谱分析，以协助区分大颗粒和小颗粒，或结合分子和未结合分子。优选地，进行所述调制以监测改变穿过所述分析物施加的电场的效果。在一个实施方式中，进行所述监测以监测电荷分离的能力，以及这种重分布发生有多快，其取决于分子的大小以及它们结合的强度，并且其中松散结合的电荷响应较高频率的电场，反之亦然。
[0029]在一个实施方式中，选择具有约10至14的K值的珠，在一个实施方式中，所述珠是铁氧体和聚苯乙烯的复合材料。
[0030]在一个实施方式中，电极设置为提供分析物、阴性和参比传感器，并且用阳性流体或含有已知量的待测珠的缓冲液校准;包含相同流体或具有待确定的未知量的珠的缓冲液的分析物通道；以及包含相同流体或不存在目标珠的缓冲液的阴性通道。优选地，所述珠包括包在蜡材料内的顺磁材料。
[0031 ]在一个实施方式中，所述方法包括至少部分地熔化传感器表面上的珠直到它们形成蜡层，并在所述熔化后测量电容的步骤。在一个实施方式中，通过多层CMOS传感器结构内的加热器的运转熔化所述珠。
[0032]在一个实施方式中，所述方法包括施加磁场将所述珠吸引到传感器表面的步骤。
[0033]在一个实施方式中，所述方法包括步骤:将目标核酸分子吸引到传感器表面，以使它们作为配体籍由NA与珠上的第一互补探针和固定在传感器表面上的第二互补探针的Watson-Crick配对束缚磁珠至表面，然后以一个水平施加磁场，以使珠最初籍由NA-PNAWatson-Crick结合能保持结合，加热样品直至温度达到特征性的NA-探针解链温度，在该温度下，一些键断裂，一些珠在磁吸引下被拉开，并实时监测电容变化。
[0034]在一个实施方式中，目标NA和探针具有单个碱基对差异。
[0035]在一个实施方式中，传感器表面具有多个不同的传感器区域，每一个都具有不同的固定化探针，并且进行差动传感(differential sensing)。
[0036]在一个实施方式中，所述样品是这样，珠通过野生型序列束缚至第一探针区域，并且通过突变型序列束缚至第二传感器区域上，有未附着珠的阴性对照传感器区域，并且磁体拉开达到溶解温度时被释放的珠。
[0037]在另一方面，本发明提供了一种包括传感器的传感装置，所述传感器包括传感器表面之下的电容电极，以及与所述电极连接的处理器，其中所述装置包括工具，用于:
[0038]使样品与所述传感器表面接触，
[0039]测量所述样品的电容，和
[0040]采用所述测量以取得关于分析物的数据。
[0041]在一个实施方式中，传感器具有CMOS构造，其中CMOS层提供电极和信号处理电路。在一个实施方式中，电极被保护层覆盖，所述保护层优选具有范围为Iym至3μπι的厚度。
[0042]在一个实施方式中，所述电极被氮化物覆盖。在一个实施方式中，传感器具有平坦的顶部表面，无例如键合线的特征。在一个实施方式中，传感器包括TSV 1C，其平坦的顶部表面是传感器表面。在一个实施方式中，传感器包括在CMOS层内的表面加热器。
[0043]在一个实施方式中，传感器包括传感电容器(Cs)和参比金属-绝缘体-金属(MIM)电容器(Cr)，并且所述电容形成二阶Sigma-Delta开关电容调制器A/D转换器的前端，所述转换器提供一位数字输出位流，代表传感电容器和参比电容器之间的电荷平衡，并且包括用于平均所述位流以提供数字输出字的滤波器。
[0044]在一个实施方式中，所述传感器包括固定在传感器表面上的探针，所述探针经选择以附着至样品中的目标NA分析物，并且在所述附着后进行测量。在一个实施方式中，所述传感器具有镍涂层以选择性结合his标签蛋白质。在一个实施方式中，所述表面具有硫醇自组装单层(SAM)以结合DNA或PNA探针。
[0045]在一个实施方式中，电极设置为提供分析物、阴性和参比传感器，并且用阳性流体或含有已知量的待测珠的缓冲液校准;包含相同流体或具有待确定的未知量的珠的缓冲液的分析物通道;以及包含相同流体或不存在目标珠的缓冲液的阴性通道。
[0046]在一个实施方式中，所述传感器表面具有多个不同的传感器区域，每一个都有不同的固定化探针，并且进行差动传感。在一个实施方式中，传感器安装在适于插入血管的导管内。在一个实施方式中，所述装置包括容纳所述传感器的密封的一次性盒，并进一步包括无线收发器。
[0047]在一个实施方式中，所述装置包括磁体，以控制样品中磁珠的流动。在一个实施方式中，所述设备包括用于接收所述盒的台式装置。
[0048]在一个实施方式中，所述传感器仅包含两个传感电极，无参比电极。
[0049]发明详述
[0050]将从以下几个实施方式的描述更清楚地理解本发明，实施方式参照附图仅以示例的方式给出，其中:
[0051]图1(a)显示本发明的CMOS半导体集成电路(IC)传感器，提供交叉指型电容电极；图1(b)显示CMOS IC的横截面图；图1(c)显示电容传感器之一的两个电极(A和B)的横截面；图1(d)是传感电容器和形成Sigma-Delta转换器的差分前端的参比电容器的电路示意图；
[0052]图1(e)显示CMOSIC的TSV翻转的横截面，分析物滴分配于传感器上；
[0053]图1(f)显示圆形传感器的顶视图照片；图1(g)显示在传感器上的0.4μ1滴；图1(h)显示液滴蒸发后有颗粒在传感器上的传感器；图1 (j)显示电极之间传感器上的一些颗粒的特写SEM图像(大约10，000X);图l(k)是放大5000X的SEM图像，显示传感器上的平均直径约2μπι的约200个珠；
[0054]图1(1)是穿过传感器的横截面图，显示环绕传感器表面的突起区域，例如疏水性聚酰亚胺层；
[0055]图2(a)和(b)图解传感器的“湿”操作，其中图2(b)图显示电容相对于盐度；
[0056]图2(c)和2(d)图解盐溶液干燥或蒸发后传感器的“干”操作，其中图2(d)显示电容相对于干燥盐量；
[0057]图3为进行DNA定量的电容传感器的电容相对于质量的结果图；
[0058]图4显示安装在流动通道内的TSV CMOS 1C；
[0059]图5是电极表面的纳米级视图，显示SAM和德拜层；
[0060]图6显示束缚到传感器表面上自组装单层(SAM)的顺磁珠(珠和探针非等比例，为了图解显示较大)；
[0061]图7(a)和7(b)是显示本发明包含传感和参比电容传感器的CMOS半导体集成电路的示意性平面和侧面视图；
[0062]图8(a)至(d)是显示分析物相对于阴性对照的湿电容测量的示意图；
[0063]图9(a)至(d)显示分析物相对于阴性对照的干电容测量；
[0064I图10 (a)显示顺磁珠，图10(b)显示变性的顺磁珠，图10 (C)示意性显示实施加热后传感器表面上后者珠的降解；
[0065]图11显示磁力施加到束缚至传感器表面的珠；
[0066]图12(a)至(C)是示意性显示用于解链曲线分析的电容变化相对于温度的系列图；
[0067]图13(a)和(b)是显示具有四个传感器区域的传感器的平面图和侧视图，图13(c)为具有16个传感器区域的变形的平面图；
[0068]图14是微流体盒传感器的透视图；
[0069]图15是显示具有手持部和装配到其上的台式读取器的传感器的透视图；
[0070]图16是具有传感器IC阵列的传感器系统的透视图；
[0071]图17显示在导管内的传感器；
[0072]图18是显示对于加入的流体样品滴，检测到的随着时间电容增加的图；
[0073]图19是显示检测到的电容增加相对于增加数量的珠的图。
[0074]实施方式
[0075]参考图1(a)，其显示本发明CMOS传感器I的平面图，包含传感电容器Cs形成的交叉指型电极2，和用于外部信号连接的接合垫2(a)。为了简化说明，该图非等比例。在本实施方式中，实际电极的尺寸是ΙΟμπι宽，5μιηι间距，总手指长度15000μιηι。
[0076]图1(b)显示ICI的横截面，为了简化，同样也非等比例。其具有6层金属互连，电极形成于顶层(“Metal-6”)。显示键合线2(b)附着于结合垫。显示了一个CMOS晶体管，代表集成于芯片上的电路。这包括温度传感器，加热器结构例如金属螺旋或衬底二极管，模数转换器，衬底和金属互连金属(MEVI)电容器，包括用于控制A/D开关电容器电路的逻辑的信号处理器，用于存储传感器的校准系数的非易失性存储器以及用于传感器线性化、补偿和信号处理的微控制器；以及任选存在的射频收发器。该标准CMOS半导体工艺的制造方法是已知的，例如US5514616所描述，其显示了所有关键步骤，包括晶体管源极/漏极形成、栅沉积、钨接触、CVD氧化物沉积、抛光、铝金属沉积和氧氮化物钝化。
[0077]图1(c)是一对交叉指型电极3和4(A和B)的特写图，其上有氮化物保护层5。如虚线电场线所示，电极之间的电容由衬底和氮化物内的固定部分，以及空中或氮化物上方的分析物中的可变部分组成。该可变部分用作传感器信号转换器。在该实施方式中，电极3和4由2μπι厚的铝形成。该铝手指被保护于2μπι氮化物层5下。这消除了如电极腐蚀、氧化、和传感器漂移的影响。还显示出了惰性表面，其不污染或弄脏待测分析物或颗粒。
[0078]参考图1(d)，所述传感电容器Cs，和参比金属-绝缘体-金属(ΜΠ0电容器Cr构成二阶开关电容器Sigma-Del ta调制器A/D转换器12的前端11 (如现有技术中已知的，例如Malcovati，图2，VLSI Symposium Digestl995)。调制器产生一位数字输出位流14，代表传感和参比电容器之间的电荷平衡。该位流由滤波器元件13过滤并被平均，以产生20-24比特分辨率的数字输出结果。电极与分析物(μπι)的接近很少或没有导致寄生干扰电容。所得到的高分辨率模拟-数字转换器能够检测由于各种分析物颗粒的不同介电常数引起的传感电容可变元件内的毫微微法和阿法变化。该电路自包含于节点A和B之间，无需如现有技术(例如先前引用的Stoner(1970))中电容传感器所需要的那样，参比电极浸入分析物溶液中。本实施方式中，所述调制器开关电容频率为32KHz，但在本领域已知这可在宽范围的频率内变化。
[0079]图1(e)显示选择实施方式CMOSIC(8)的横截面，其中，通过硅通孔(TSV)15将IC的I/o连接从IC前带至后。TSV是半导体工业中降低IC整体高度的最近创新。从裸片(尽管仍为晶圆形式)背面蚀刻通孔开口直至裸片前的金属互连层。然后铜电镀晶圆的背侧以填充通孔，从而将金属互联层的A/D转换器信号从IC前(顶)带至IC的后面(背部)。这具有消除键合线和IC顶部的外形变化的优点。这提供了没有扰动的平滑表面，促进分析物流体或如图所示的分配液滴流动穿过IC表面的电容传感器。US8513061更详细地描述了典型的TSV制造工
-H-
O
[0080]图1(f)至1(h)是操作中圆形传感器实施方式的实际图像(100X放大)。图1(f)显示测定开始时的传感器。图1 (g)显示传感器表面上有珠的液滴，图1 (h)显示干燥后传感器表面，传感器上的珠可见。图l(j)和l(k)还显示了如下文更详细描述的传感器上干燥的珠。
[0081]图1(1)是穿过传感器25的横截面图，显示突起区域27环绕传感器表面，例如疏水性聚酰亚胺层。层27作为目标以引导和保持液滴在传感器上，便于手动或自动液滴吸移应用。所述疏水性聚酰亚胺层27厚3-5μπι，并且其在1-2μπι氮化物衬底26上。有利的是，该传感器只包括两个传感电极，无参比电极。
[0082]图2显示本发明根据以下测定步骤进行盐度“湿”测量:
[0083].创建饱和盐水溶液，S卩26重量％或2608/1
[0084].稀释该小瓶，至20%、15%、10%、5%、2.6%、1.3%的溶液。
[0085].施加0.4μ1的1.3%溶液液滴30在CMOS IC8上的电容传感器上，如图2(a)或图1(g)的图像所示。这是20:1稀释，因此该液滴包含大约6yg盐。记录电容读数。
[0086].就在液滴蒸发前，用约10μ1 2.6%溶液冲洗，留下该新浓度的一个液滴在传感器上;记录电容读数。
[0087].重复其它每个增加浓度。
[0088].图2(b)显示得到的“湿”电容读数，30分钟水平轴线上20阿法/分隔(六个顺序液滴，以5分钟的间隔施加)ο所述电容变化对应于盐浓度从1.3%增加至完全饱和的26 %。这种变化是由于电极附近溶液的介电常数(K)被溶解入溶液并置换水分子(K?80)的盐分子(K?6)改变。注意氮化物层保护电极不受盐溶液的漂移和腐蚀。
[0089].洗涤和漂洗CMOS IC 8的表面以除去所有的盐。
[0090]图2(c)和2(d)显示本发明的另一特性，根据以下测定，对于不同盐浓度的“湿”和“干”电容读数:
[0091 ] ?重复以上“湿”测定，用1.3 %溶液液滴开始，但这次允许液滴蒸发，以提供干燥沉积物31。在室温下0.4μ1液滴大约需要3或4分钟蒸发。剩余盐颗粒31的“沉积”层，如图2(c)所示。然后记录“干”电容读数。
[0092].添加下一滴，使之蒸发，然后重复增加浓度的液滴。
[0093].图2(d)显示“干”电容读数，35分钟的时间段，70阿法/div。添加了三个液滴，SP35分钟内三个“湿-干”周期。每一盐浓度的倍增都增加电容-但是随着盐沉积层变得更厚，量减小，例如第一 6yg层100aF，第四层60aF。电容增加是由于K(盐)=6，相对于K(空气)=1。干燥层厚度都小于100纳米厚。所有都可检测，为了额外精确度，这些“干”读数对湿读数给予“交叉检验”。
[0094].由于电容传感器是连续实时测量，它可以监测液滴的蒸发速率，以及随后所述沉淀层完全干燥的时间。这提供了关于分析物材料和特性的有价值的“指纹”信息，例如蔗糖颗粒蒸发和干燥比盐颗粒花费长得多的时间。
[0095]图3显示电容传感器以类似的方式进行DNA定量。在该实施例，准备每毫升I毫克(lOOOng/μΙ)的Atlantic Cod DNA，然后其0.4μ1液滴施加至传感器(S卩400ng)，并让其蒸发。“湿”和“干”测量电容，即在蒸发前和后测量。清洗传感器，对300ng、200ng、10ng、50ng和25ng重复测量。结果显示于图3，其中纵轴每分隔100阿法。
[0096]应该理解这种使用低成本CMOS半导体传感器的“湿和干”方法和装置能够用于“现场”定量各种流体和颗粒，例如水质监测，或总的乳固体。
[0097]图4显示安装在流动通道51内的具有TSV CMOS IC 8的传感器SO13TSV IC 8的光滑表面大大简化并促进流体流过传感器，本实施例中是奶流动。由于奶品质和动物健康的原因，现代乳品生产对了解全乳中蛋白质和酪蛋白含量具有特定兴趣。用吸附的粘膜蛋白结合层功能化传感器表面。这选择性结合奶流中的乳蛋白。然后，用空气冲洗通道，比较“干”测量电容与结合之前的初始“干”电容。该差异是奶蛋白含量的直接测量。
[0098]以类似的方式，通过传感器的特定的表面功能化，本发明可实现复杂介质中流动的许多特定组分的定量。例如，用镍-涂层选择性结合his标签蛋白，或用硫醇自组装单层(SAM)结合DNA或PNA探针。图5是电极表面纳米级放大，显示PNA探针束缚至传感器表面上的SAM。其显示电极-溶液界面处形成德拜双层。电极上的正电荷排斥离子溶液中的阴离子，在溶液中产生耗尽区(类似于形成于半导体P-N处的“耗尽区”)。所述双层通常宽Inm;在所示实施例，9μπιΧ100μπι电极具有双层电容Cdi_40pF。通过施加电压调节耗尽宽度(从而Cdi)。电极上较大的正电压加宽耗尽层，从而降低Cdi。当正电压吸引类似纳米尺寸的DNA分子时，DNA分子结合到互补的PNA探针，进一步有效地加宽了耗尽层，进一步降低电容。这使得DNA分子(K = 5)相对于水的背景介电常数(K = SO)容易检测得多。
[0099]DNA分子带负电荷，因此它们还可以通过暂时停止32KHz Sigma-Delta调制器，并在传感器的A和B电极上都设置正电压而将它们吸引到所述表面。在该实施例中优选PNA探针没有电荷，使其更容易为目标DNA分子接近并结合至PNA探针。一旦结合，便施加负电压到A和B电极。这排斥任何非特异性结合的DNA分子，而特异性结合的目标DNA分子由于Watson-Crick互补结合能而保持束缚在表面。然后32ΚΗζ调制器恢复A和B电极的开关电容操作以测量电容。
[0100]除了捕获和定量目标DNA，该方法/实施方式也适用于捕获RNA、微小RNA，和扩增子核酸，例如来自上游扩增反应如PCR、LGA或RPA。可以使用去离子水冲洗掉盐、未结合的引物、dNTPs和酶，而不去除结合到PNA探针的捕获的核酸。因此，所述干式传感器测量不受非特异性沉积材料的影响。该方法提供了一种简单的具有成本效益的选择，替代昂贵的基于激光和光学的核酸检测方法。
[0101]图17显示一种实施方式，其中TSV芯片350安装在适于插入血管或组织液的导管351内，例如用于捕获和检测循环微小RNA。这些在血液中循环的无细胞核酸正在成为重要的疾病检测生物标志物，但是难以用常规方法评估。所述传感器表面暴露，使得当用互补的PNA探针功能化时，在30至60分钟时间过程中，直接捕获目标微小RNA。然后取出传感器导管，洗涤(如果需要的话)以除去蛋白质和其它非特异性的材料，然后干燥，使得可以干电容读数。这大大有助于快速患者监测和早期疾病检测。
[0102]在另一实施方式中，调制器频率不同，例如从1Hz到10MHz。这使得可以在表面进行分子的光谱分析，以协助区分大颗粒和小颗粒，或区分结合分子和未结合分子。当穿过分子施加电场时，分子上的电荷倾向于分离并与电场对齐。电荷分离的能力，以及这种重分布发生有多快，取决于分子的大小以及它们结合的强度。松散结合的电荷响应较高频率的电场，反之亦然。因此，通过分析频率响应中的特征峰和谷，本发明能够通过光谱和阻抗分析确定关于测量的分析物分子的有用的额外信息。
[0103]基于铁氧体珠的扩增:
[0104]顺磁珠特别适用于分子生物学，例如从裂解溶液提取出目标DNA。图6显示2.8μπι顺磁链霉亲和素包被的珠60，在来自上游样品制备测定的去离子水(DI)中流动或磁吸引至传感器。附着至其的是生物素化PNA第一探针Probe I，在Watson-Crick杂交中目标DNA结合到生物素化PNA探针。在传感器8表面上，DNA结合至第二PNA探针Probe 2，即，所述珠现在束缚至以目标DNA作为配体的传感器表面。该夹心测定结构是高度特异性的，因为只有目标DNA存在并被两个序列特异性探针结合，所述珠才能够被束缚。珠的数量成为分析物内存在的目标DNA分子数量的直接的成比例的指示物。对于作为铁氧体和聚苯乙烯的组合物的顺磁珠，K大约为10-14。这明显低于“湿”电容测量中背景水的Κ = 80(例如在图1(g)所示液滴中)，且显著高于“干”电容测量中空气的K=K如图1(h)所示传感器表面的干燥珠)。这连同它们大得多的尺寸，使得珠比小DNA分子更容易电容式测量。或者换个措辞，电容传感器能够检测非常小的DNA量，如将在下一页进一步解释的。
[0105]图7(a)显示具有三个交叉指型电极电容传感器Cs2、Csl和CRef的传感器100:参比和两个传感结构。图7(b)显示在这三个传感器上的三个分析物液滴:
[0106].阳性流体或含有已知量的待测珠的缓冲液；
[0107].包含相同流体或具有未知量的待确定的珠的缓冲液的分析物通道;和
[0108].包含相同流体或不存在目标珠的缓冲液的阴性通道。
[0109]图8(a)显示阴性通道(101)，其中流体中不存在目标珠。导电流体具有很高的介电常数，例如对于水K = 8 O，作为电容“短路”，因此电极A和B之间等效电容为2 X Cmm，如图8(b)所示的等效电路。假定氮化硅的相对介电常数(K)=7，氮化物厚度2μπι，电极指尺寸为9μmXlOOym，我们得到C鍾樵=7 X εQ X 900/2 = 28fF。为了简化，在该计算中德拜电容可以忽略，因为相较于所示2μπι绝缘氮化物层和2.8μπι珠，在氮化物表面的德拜层是微不足道的(?Inm耗尽绝缘层)。
[0110]图8(c)显示在引入的流体中或束缚在电极之上的氮化物表面上的有珠的分析物通道(或阳性通道)(105)。该颗粒悬浮液在传感器表面有效形成珠层并置换水。这在所示实施例中形成串联电容C珠(2.8μπι珠)，见图8 (d)等效电路。通过Sigma-De I ta A-D转换器测量得到分析物和阴性传感器之间的电容差异，在该实施例中为5fF。通过与阳性通道内已知浓度的珠的电容比较，分析物通道的电容指示存在于分析物通道内的珠的数量或量，即目标DNA分子的数量。可能存在于流体内的离子、蛋白质和其它分子遍及所有三个传感器，因此对其清零。
[0111]可以理解，随着颗粒变小，例如纳米珠或DNA颗粒，颗粒层的串联电容变大，使分析物和阴性通道之间的差动电容(differential capacitance)进一步降低，例如降至阿法。通过额外的平均或改进的位流数据的滤波，这仍然可以被Sigma-Delta转换器检测到。或者通过蒸发流体并进行如图9所示的珠的“干”电容测量，这对珠的数量提供了交叉检验，以实现额外的精确度。
[0112]图18是实时图，显示在50分钟时间段内，施加到传感器的五个连续液滴，如上所述湿式和干式电容测量(并且类似于上述湿式和干式盐度测定)。纵轴显示每个连续加入珠的电容增加(每分隔0.3毫微微法拉)。图19绘制了这些相对于珠的数量的电容增加。在该特定实施方式中，可检测下限为200个珠。图l(k)是在该检测限的传感器上的大约200个珠的SEM图像。不同于霍尔效应和其他磁传感器，不管珠落在传感器的哪里，由于传感器表面所有点的电容边缘场，它们将总被检测到。
[0113]变性珠信号扩增:
[0114]图10(a)显示标准顺磁珠150的构造。它们通常具有铁氧体核，包裹在聚苯乙烯内，在一些分析中，具有链霉亲和素层。
[0115]图10(b)显示珠155，其中顺磁珠包裹在蜡中，以提高在流体中的可测量性。蜡在45°(:以上的温度熔化(例如蜂蜡或石蜡)。在流体内测量过程中，我们使用芯片上或芯片下的加热器，加热传感器芯片至?55°C。该温度开始使蜡熔化并变形，如图10(c)所示。这沿排除液体的传感器表面产生低介电常数的集成珠的有机体156。这显著地改变表面的电容。通过在蜡中包括其它材料，例如诸如盐的溶解物，则实现了更进一步的电容变化。这具有低介电常数(K?6)，珠变形后溶解到溶液中。这种流体介电常数的变化进一步协助电容检测。
[0116]当待测颗粒最接近电极时，所述传感器具有最大灵敏度。以下是本发明增加灵敏度的几个变形:
[ΟΙ17].降低氮化物厚度，例如从2μηι至约Ιμπι
[0118].增加电极厚度，例如至2μπι至约3μπι，以在表面产生峰/谷形貌。这样的形貌增加分子结合至表面的效力，并增加位于电极“之间”的珠的电容，如图8(c)和9(c)以及图l(j)的图像。微调电极宽度和间距以适应珠直径，可以最大化该灵敏度。
[0119].对于磁珠，将磁体放置在传感器IC下面，以把磁珠吸引至传感器表面。磁力搅拌也有助于PNA-DNA结合。
[0120]这些改进与更高的过采样和Sigma-Delta转换器内更多滤波的综合效应，使检测限降低了一个数量级，至大约20珠或更少。每个珠周围用至少数十PNA探针功能化，以确保借助于磁力搅拌结合和束缚至传感器表面，显然，这种简单的CMOS电容传感器可以直接检测几百个DNA分子，S卩，不用PCR、RPA，或任何其它类型的扩增。这意味着酶、聚合酶、染料和荧光团可以从上游的样品制备化学中省略，从而大大简化和缩短总测定时间，降低到一小时或更少，并且不需要复杂的激光器或光学检测设备。
[0121]单碱基错配和解链曲线分析:
[0122]在该测定中，目标核酸(DNA或RNA)分子作为配体束缚磁珠至如图6所示的电容传感器表面上的SAM。这是由于NA与珠上第一互补探针和固定于传感器表面的第二互补探针的Watson-Crick配对。我们在此测定中使用PNA探针;它们有利地使得低离子溶液位于传感器上方，简化电容测量。
[0123]然后，在珠的上部或沿着珠旁引入头部200上的磁体201，如图11所示。最初珠由于NA-PNA Watson-Crick结合能而保持结合。然后通过芯片上或芯片下的加热器加热表面。当温度达到特征性的NA-PNA解链温度时，一些键断裂，一些珠(202)在磁吸引下被拉开。这产生如图12(a)所示的实时电容变化。在该实施例，正确结合的16bp PNA探针在65°C解链。
[0124]对于具有单个碱基对差异的已知变体，所述NA通过匹配的其余15bp仍然可以部分地结合到PNA探针。然而如图12 (b)所示，这种构象的熔化温度低15 °C。高分辨率内置电容传感器、磁力在束缚的顺磁珠上产生的张力以及PNA探针的高特异性的组合在解链曲线分析中产生非常好的特异性和灵敏度。
[0125]这些特征使本发明能够用于基因分型。其中结合的目标NA序列同质，随着温度升高，探针将在相同温度下从目标NA分离(或“解链”)。然而，如果捕获的目标NA不同质，有可能探针的解链不同。明显的例子是群体中，探针结合的一个位置上，DNA有已知变异，即单核苷酸多态性(SNP)。对于被测试的个体，其DNA可能包含最常见的序列(“野生型”)或仅含变异(“突变体”)(纯合的)或两者的组合(杂合的)。在例如电容对温度信号的实时分析中，将观察到三个不同的模式。对于纯合野生型，在特征性温度下，当野生型断裂时，将观察到图中的变化-图12(a)。对于纯合突变，将观察到图中相似的变化，但是将发生在较低的温度-图12(b)。最后，对于杂合体，将观察到两个不同的峰，纯合子图的混合模式-图12(c)。也可以观察到偏离于纯合野生型序列的任何未知突变。
[0126]在有多个传感器和SAM的变化形式中，我们具有通过野生型序列束缚至第一传感器上的第一 SAM的珠，以及通过突变型序列束缚至第二传感器上的珠。没有附着珠的阴性对照SAM在第三传感器上。磁体将达到解链温度时释放的珠拉开。该差动传感方法能够同时检测并观察未知突变。
[0127]以类似的方式，扩展到具有多个SAM和多个探针的多个传感器表面能够进行多重测定，并同时检测多探针类型的束缚。例如，图13(a)显示了流动通道250内具有四个传感器表面252的传感器IC251。它们被四种不同的探针功能化(或“点缀”)，每一种与四种核酸病毒互补，并被设计成靶向四种核酸病毒，图13(b)。所述四个电容传感器可以如图13(c) (260)所示子分割并交织，以平均任何“聚集”或不相等的珠的运动模式。孵育和结合任意目标核酸后，如图11所示，磁铁拉开任何未结合的NA。所得到每一传感器的结合珠-电容测量指示任何目标NA是否存在于分析物。
[0128]可以理解，本发明提供一种传感方法和传感装置，其中以低成本、简单和耐用的方式大大提高对例如NA的分析物的灵敏度。
[0129]图14显示本发明密封的一次性盒300,合并TSV 1C 303和射频收发器，合并在具有入口301的流动通道302内。所述盒由注模热塑性聚合物制成，如ZeonortmSTopastm。其含有孔，其中目标核酸分子附着于磁珠上的探针，作为NA样品制备测定的一部分。通过释放传感器表面上的气泡，或者替代地去除传感器表面上的密封条以允许蒸发来实现分析的“干”测量。在该实施方式中，外部磁体305用于控制顺磁珠向包埋于通道末端的TSV传感器1C的流动。[〇13〇]图15(a)显示台式装置312的透视图，用于接收图14的盒300。其通过USB或12V车用电源出口供电，以便于便携式现场诊断测试。图15(b)是装置312的扩展截面图。它包含 Peltier加热器314、电磁体313,以及感应供电和无线读取器电路315。通过加热器314加热和冷却盒300，用于NA的特定解链和与探针结合。所述电磁体使珠沿流动通道移动至TSV 1C 303,用于在传感器表面的测量。所述感应无线读取器给TSV传感器IC(类似于RFID芯片和读取器)供电。然后，传感器1C进行测量并将结果传送到台式读取器312,用于通过控制和显示电子器件318处理和显示。
[0131]图16显示替代选择的传感器320,具有96个本发明的TSV传感器1C，安装在与标准 96孔SBS印迹相同的8X12阵列内。这使得如图所示的机器自动液滴操作成为可能，促进高容量高通量的样品测试。
[0132]可以理解，本发明提供各种实施方式的传感器，其紧凑、便携、耐用，并且制造成本低。它们还对纳米级目标成份具有灵敏度。还将理解，它们避免对参比电极和昂贵贵金属的需要。而且，它们不具有与电极相关的腐蚀和漂移问题。
[0133]本发明并不限于所描述的实施方式，而是可以在构造和细节上变形。例如，虽然大多数实施方式涉及分析物作为诸如磁珠的颗粒的一部分或附着于诸如磁珠的颗粒，所述分析物也可以溶解于样品流体的溶液中，从而改变介电性能。在这种情况下，干燥步骤将引起分析物分子沉积出，形成沉淀层。所述处理器可以采取任何合适的形式，并且可以实际上是远离传感器部件，在这种情况下，可以无线连接。
【主权项】
1.一种使用电容传感器(I)检测液体样品中分析物的方法，所述电容传感器具有电极(3)和传感器表面(5)，以及与所述电极连接的处理器(10)，所述方法包括步骤: 使样品(20，31)与所述传感器表面接触， 测量样品的电容，和 使用所述测量提供关于分析物的数据。2.如权利要求1所述的方法，包括干燥样品和测量干燥样品的电容的步骤。3.如权利要求2所述的方法，进一步包括步骤: 干燥前测量样品的电容，和 取得来自干燥前和干燥后进行的所述测量的分析数据。4.如权利要求1或2或3所述的方法，其中所述样品包括颗粒(60)，并且所述分析物是所述颗粒的一部分或者附着至所述颗粒，并且所述颗粒提供电容变化的主要部分。5.如权利要求4所述的方法，其中所述颗粒是附着至分析物分子的珠。6.如权利要求5所述的方法，其中所述分析物分子是目标核酸(NA)分子链，例如DNA或RNA07.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述传感器具有CMOS构造，其中CMOS层提供电极和信号处理电路(10)。8.如权利要求7所述的方法，其中所述电极(3，4)被保护层(5)覆盖。9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述电极被氮化物覆盖。10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述传感器具有平坦的顶部表面，无例如键合线的特征。11.如权利要求1O所述的方法，其中所述传感器包括TSV芯片。12.如权利要求8至11任一项所述的方法，其中所述保护层厚度在Ιμπι至3μηι的范围内。13.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述传感器包括传感电容器(Cs)和参比金属-绝缘体-金属(MIM)电容器(Cr)，并且所述电容器形成二阶Sigma-Delta开关电容器调制器A/D转换器(12)的前端(11)，所述转换器提供一位数字输出位流，代表传感电容器和参比电容器之间的电荷平衡，并且包括用于平均所述位流以提供数字输出字的滤波器(13)。14.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述样品通过包括在CMOS结构的层内的加热器干燥，CMOS结构在顶部包括电极。15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述信号处理器(10)监测样品液体蒸发的速率，以提供分析物的特征标志。16.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述样品是奶，并且所述方法确定蛋白质和/或酪蛋白浓度。17.如权利要求4-16任一项所述的方法，其中所述传感器包括固定于传感器表面上的探针，所述探针经选择以附着至样品中的目标NA分析物，并在所述附着后进行测量。18.如权利要求17所述的方法，其中所述传感器具有镍涂层以选择性地结合his标签蛋白。19.如权利要求17所述的方法，其中所述表面具有硫醇自组装单层(SAM)以结合DNA或PNA探针。20.如前述任一项权利要求所述的方法，包括提供用于结合分析物的PNA探针的步骤。21.如前述任一项权利要求所述的方法，包括步骤: 提供位于传感器表面上的PNA探针，并通过暂时停止信号处理器(10)并在传感器的多个电极上设置正电压将DNA分子吸引到传感器表面，和 一旦目标DNA分子结合至PNA探针，则向所述电极施加负电压以排斥任何非特异性结合的DNA分子，而特异性结合的目标DNA分子由于Watson-Crick互补结合能而保持束缚在所述表面，和 恢复信号处理器运转以测量电容。22.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述信号处理器调制电极驱动频率并允许在表面进行分析物的光谱分析，以协助区分大颗粒和小颗粒，或者区分结合分子和未结合分子。23.如权利要求22所述的方法，其中进行所述调制以监测改变穿过所述分析物施加的电场的效果。24.如权利要求23所述的方法，其中进行所述监测以监测电荷分离的能力，以及这种重分布发生有多快，其取决于所述分子的大小以及它们结合的强度，并且其中松散结合的电荷响应较高频率的电场，反之亦然。25.如权利要求5-24任一项所述的方法，其中选择具有约10-14的K值的珠。26.如权利要求25所述的方法，其中所述珠是铁氧体和聚苯乙烯的复合材料。27.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述电极设置为提供分析物、阴性和参比传感器，并且用阳性流体或含有已知量的待测珠的缓冲液校准;包含相同流体或具有未知量的待确定的珠的缓冲液的分析物通道；以及包含相同流体或不存在目标珠的缓冲液的阴性通道。28.如权利要求5至27任一项所述的方法，其中所述珠(150)包括包在蜡质材料内的顺磁材料。29.如权利要求28所述的方法，包括至少部分地熔化传感器表面上的珠(155)直至它们形成蜡层，并在所述熔化后测量电容的步骤。30.如权利要求29所述的方法，其中通过多层CMOS传感器结构内的加热器的运转熔化所述珠。31.如权利要求5至30任一项所述的方法，包括施加磁场(201)将所述珠吸引到传感器表面的步骤。32.如权利要求5至33任一项所述的方法，包括步骤:将目标核酸分子吸引到传感器表面，以使它们作为配体籍由NA与珠上的第一互补探针和固定在传感器表面上的第二互补探针的Watson-Crick配对束缚磁珠至表面，然后以一个水平施加磁场，以使珠最初籍由NA-PNA Watson-Crick结合能保持结合，加热样品直至温度达到特征性的NA-探针解链温度，在该温度下，一些键断裂，一些珠(202)在磁吸引下被拉开，并实时监测电容变化。33.如权利要求32所述的方法，其中所述目标NA和所述探针具有单碱基对差异。34.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述传感器表面具有多个不同的传感器区域，每一个具有不同的固相化探针，并且进行差动传感。35.如权利要求34所述的方法，其中所述样品是这样，珠通过野生型序列束缚至第一探针区域，并通过突变型序列束缚至第二传感器区域上，有未附着珠的阴性对照传感器区域，并且磁体拉开达到溶解温度时被释放的珠。36.一种包括传感器(I)的传感装置，所述传感器包括位于传感器表面之下的电容电极(3，4)，以及与所述电极连接的处理器(10)，其中所述装置包括工具，用于: 使样品与所述传感器表面接触， 测量所述样品的电容，和 采用所述测量以取得关于分析物的数据。37.如权利要求36所述的装置，其中所述传感器具有CMOS构造，其中CMOS层提供电极和信号处理电路(10)。38.如权利要求36或37所述的装置，其中所述电极(3，4)被保护层(5)覆盖，所述保护层优选具有Iym至3μηι范围内的厚度。39.如权利要求38所述的装置，其中所述电极被氮化物覆盖。40.如权利要求36至39任一项所述的方法，其中所述传感器具有平坦的顶部表面，无例如键合线的特征。41.如权利要求40所述的装置，其中所述传感器包括TSV1C，其平坦的顶部表面是传感器表面。42.如权利要求36至41任一项所述的装置，其中所述传感器包括CMOS层内的表面加热器。43.如权利要求36至42任一项所述的装置，其中所述传感器包括传感电容器(Cs)和参比金属-绝缘体-金属(MIM)电容器(Cr)，并且所述电容形成二阶Sigma-Delta开关电容调制器A/D转换器(12)的前端(11)，所述转换器提供一位数字输出位流，代表传感电容器和参比电容器之间的电荷平衡，并且包括用于平均所述位流以提供数字输出字的滤波器(13)。44.如权利要求36至43任一项所述的装置，其中所述传感器包括固定于传感器表面的探针，所述探针经选择以附着至样品中的目标NA分析物，并在所述附着后进行测量。45.如权利要求44所述的装置，其中所述传感器具有镍涂层以选择性地结合his标签蛋白。46.如权利要求44所述的装置，其中所述表面具有硫醇自组装单层(SAM)以结合DNA或PNA探针。47.如权利要求36至46任一项所述的装置，其中电极设置为提供分析物、阴性和参比传感器，并且用阳性流体或含有已知量的待测珠的缓冲液校准;包含相同流体或具有未知量的待确定的珠的缓冲液的分析物通道;以及包含相同流体或不存在目标珠的缓冲液的阴性通道。48.如权利要求36至47任一项所述的装置，其中所述传感器表面具有多个不同的传感器区域，每一个具有不同的固相化探针，并且进行差动传感。49.如权利要求36至48任一项所述的装置，其中所述传感器安装在适合插入血管的导管内。50.如权利要求36至48任一项所述的装置，其中所述装置包括容纳传感器的密封的一次性盒，并进一步包括无线收发器。51.如权利要求36至48或50任一项所述的装置，包括磁体(305)以控制样品中磁珠的流动。52.如权利要求50或51所述的装置，包括用于接收所述盒(300)的台式装置(312)。53.如权利要求36至52任一项所述的装置，其中所述传感器仅包括两个传感电极，无参比电极。
【文档编号】C12Q1/68GK105980581SQ201480075412
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月10日
【发明人】T·卡明斯, B·欧法雷尔
【申请人】阿尔查技术有限公司