一种高选择性超灵敏分析二价铁离子的荧光探针的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种高选择性超灵敏分析二价铁离子的荧光探针。具体地，本发明的探针为一种包含N-O功能团的苯并噻唑乙烯二甲基苯胺类化合物，其可作为二价铁离子荧光探针用于二价铁离子的检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：高选择性地识别二价铁离子；可以快速对二价铁离子实现响应；可以实现对二价铁离子的超灵敏分析；性质稳定，可以长期保存使用；有利于在生理水平条件下对二价铁离子进行检测；以及具有较强的抗干扰能力。
【专利说明】
一种高选择性超灵敏分析二价铁离子的荧光探针
技术领域
[0001] 本发明涉及一种包含N-0功能团的苯并噻唑乙烯类化合物作为二价铁离子荧光探 针，其可在生理水平条件下对二价铁离子高选择性超灵敏识别应用，或者其可测定样品中 二价铁离子的浓度。
【背景技术】
[0002] 作为人体中的必须元素和最丰富的过度元素，铁离子在生命系统中扮演着非常重 要的角色。铁离子的氧化还原反应在氧气输送、抗血素合成、酶反应、新陈代谢和电子转移 等生命体内的一些生理活动中起着关键作用。一旦生命体内的铁离子含量不能维持在正常 的生理水平范围内，生命体便会发生许多病变，包括癌症、肝炎、肾功能衰竭、心血管疾病、 老年痴呆和帕金森综合症等。铁是人体不可缺少的微量元素，它是构成血红蛋白、肌红蛋白 及多种酶的重要成分，如果体内缺少铁，可影响血红蛋白、肌红白蛋的合成，可使某些酶，如 细胞色素c、核糖核苷酸还原酶、琥珀酸脱氢酶等的活性降低。这些酶与生物氧化、组织呼 吸、神经递质的分解与合成有着密切关系，因此，铁的缺乏可引起很多生理上的变化，从而 导致免疫力低下、智力降低和机体抗感染能力降低，影响机体体温调节能力，神经机能紊 乱，工作效率降低等各种疾病，最常见的是缺铁性贫血。
[0003] 鉴于此，发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测二价铁离子的分析 方法是极其重要和有意义的。现如今已报导的检测二价铁离子的分析方法包括光谱分析 法，无汞法、分光光度法、硝化络合分光光度法、荧光探针检测等方法。在这些众多的检测方 法中，荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。然而，目前报道的荧光探针 仍存在一些问题，包括选择性不够好、响应速度不够快、合成复杂以及水溶性不够好等。由 于生命体内的其他金属离子如钠离子，钾离子，钙离子，镁离子，铝离子，三价铁离子和铜离 子等其他金属离子，它会对二价铁离子的检测构成潜在干扰，因此，发展高选择性探针成为 急需解决的课题。生物体内的铁离子含量只占0.004%，这给生命体内二价铁离子的检测带 来很大困难，因此发展能够高灵敏性检测生命体内二价铁离子的分析方法是必要的。总之， 发展高选择性、高灵敏度、合成简单的、水溶性好的二价铁离子荧光探针是本领域技术人员 急需解决的。
【发明内容】
[0004] 本领域急需一种制备简单、水溶性好的高选择性超灵敏二价铁离子荧光探针，从 而能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测二价铁离子。为此，本发明合成了一类 新颖的二价铁离子的荧光探针，其合成简单、水溶性好、选择性高、灵敏度高、能够快速识别 二价铁离子。本发明的探针可在生理水平条件下进行二价铁离子的测定。
[0005] 具体而言，本发明提供了一种二价铁离子荧光探针，其为包含N-0功能团的苯并噻 唑乙烯类化合物，其结构如下：
[0007]优选的，本发明的荧光探针是：
[0009] 本发明还提供了二价铁离子荧光探针的制备方法，其是通过将对应于本发明的探 针的相应的苯并噻唑乙烯苯胺类化合物与间氯过氧苯甲酸通过在室温搅拌3小时而合成制 得。优选的，本发明的对应于本发明的探针的相应的苯胺类化合物是苯并噻唑乙烯二甲基 苯胺化合物。
[0010] 本发明还提供了用于检测样本(例如血液样本）中二价铁离子浓度的检测制剂或 试剂盒，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明 书。还优选地，本发明的试剂盒还包含用于测定样本中的二价铁离子浓度的缓冲剂。
[0011] 本发明还提供了检测样本(例如血液样本）中二价铁离子浓度的方法，其包括将本 发明的探针与待测样本接触的步骤。
[0012] 本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如血液样本）中二价铁离 子浓度的制剂中的用途。
[0013] 本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如血液样本）中二价铁离 子浓度的试剂盒中的用途。
[0014] 本发明的二价铁离子荧光探针可与二价铁离子进行作用，产生荧光光谱的变化， 从而实现对二价铁离子的定量检测
[0015] 具体而言，本发明的二价铁离子荧光探针分别与三价铁离子、钾离子、钙离子、镁 离子、钠离子、铝离子以及人体内的其他离子进行作用均不能导致荧光光谱的明显改变，从 而实现对二价铁离子的选择性识别，进而可任选地用于排除这些三价铁离子、钾离子、钙离 子、镁离子、钠离子、铝离子、铅离子以及人体内其他离子的存在对二价铁离子的定量测定 的干扰。
[0016] 本发明的二价铁离子荧光探针的水溶性较好，从而可有利于生理水平条件下对二 价铁离子的检测。
[0017] 可选择地，本发明的二价铁离子荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
[0018] 进一步的，本发明的二价铁离子荧光探针是快速高选择性二价铁离子荧色探针， 且合成简单，有利于商业化的推广应用。
【附图说明】
[0019]图1是探针(5yM)加入Fe2+(5yM)在不同体系下的荧光光谱。
[0020]图2是探针(5yM)加入Fe2+(5yM)响应时间的测试结果。
[0021]图3是不同浓度Fe2+ (0-8yM)对探针(5yM)焚光光谱的影响。
[0022]图4是不同浓度Fe2+ (0 - 2yM)对探针(5yM)荧光光谱满足良好的线性关系。
[0023]图5是不同金属离子分析物(20yM)以及过氧化氢(200處）、谷胱甘肽(200處）、谷胱 甘肽（ImM)对探针(5yM)荧光光谱的影响。
【具体实施方式】：
[0024]本发明提供了上述快速高选择性二价铁离子荧光探针的合成路线、方法及其光谱 性能。
[0025]本发明的二价铁离子荧光探针是一类包含N-0功能团的苯并噻唑乙烯类化合物， 其具有以下结构通式
[0027] 上式中：Ri，R2，R3，R4，Rs，R6，R7，Rs为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基， 磺酸基，酯基，羧基;心心心仏儿心此和办可以相同或不同。
[0028]该类二价铁离子荧光荧光探针的合成路线和方法如下：
[
[0030] 具体地，本发明的荧光探针可以通过如下方法制备，将一定摩尔比（例1:1-1:1.5) 的苯并噻唑乙烯苯胺类化合物(例如苯并噻唑乙烯二甲基苯胺化合物)和碳酸氢钠溶于二 氯甲烷中，冷却到零摄氏度后加入间氯过氧苯甲酸，三者的摩尔比为（1:1.1:1.1)然后在室 温(例如25°C)下搅拌一段时间（例如3h)，然后利用高压栗进行抽滤，得到滤饼，滤饼成为我 们的粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将滤饼用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/ v，l:5)进行重结晶得到纯品。
[0031] 因此，本发明还提供了间氯过氧苯甲酸在制备用于检测二价铁离子的荧光探针中 的用途。
[0032]本发明还提供了包含N-0功能团的苯并噻唑乙烯类化合物在制备用于检测二价铁 离子的荧光探针中的用途。
[0033]本发明的尚选择性超尚灵敏识别^价铁尚子焚光探针的显者特征是能够尚选择 性超灵敏识别二价铁离子以及在其他高浓度自然氨基酸和人体内的其他离子的存在下能 够准确对二价铁离子进行定量分析。
[0034] 下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的， 应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。
[0035] 实施例1
[0037](方案1)将331mg( lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和84mg( lmmol)碳酸氢 钠溶于15mL二氯中，冷却到零摄氏度，再加入173mg(lmmol)间氯过氧苯甲酸在室温下搅拌 3h，然后利用高压栗进行抽滤，得到滤饼，滤饼成为我们的粗产品。如果要得到较纯的产品， 可以将滤饼用二氯甲烷和石油醚的混合体系（例如v/V，1:5)进行重结晶得到纯品。得到红 色纯净产品284.5mg，产率为82 %。
[0038](方案2)将331mg(lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和92.4mg(l. lmmol)碳 酸氢钠溶于15mL二氯中，冷却到零摄氏度，再加入190.3mg(l. lmmol)间氯过氧苯甲酸在室 温下搅3h，然后利用高压栗进行抽滤，得到滤饼，滤饼成为我们的粗产品。如果要得到较纯 的产品，可以将滤饼用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v，1:5)进行重结晶得到纯品。 得到红色纯净产品312.3mg，产率为90%。
[0039](方案3)将331mg(lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和126mg( 1.5mmol)碳酸 氢钠溶于15mL二氯中，冷却到零摄氏度，再加入259.5mg( 1.5mmol)间氯过氧苯甲酸在室温 下搅拌3h，然后利用高压栗进行抽滤，得到滤饼，滤饼成为我们的粗产品。如果要得到较纯 的产品，可以将滤饼用二氯甲烷和石油醚的混合体系(例如v/v，1:5)进行重结晶得到纯品。 得到红色纯净产品294.6mg，产率为85%。
[0040](方案4)将331mg(lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和168mg(2mmol)碳酸氢 钠溶于15mL二氯中，冷却到零摄氏度，再加入346mg(2mmol)间氯过氧苯甲酸在室温下搅拌 3h，然后利用高压栗进行抽滤，得到滤饼，滤饼成为我们的粗产品。如果要得到较纯的产品， 可以将滤饼用二氯甲烷和石油醚的混合体系（例如v/V，1:5)进行重结晶得到纯品。得到红 色纯净产品305.3mg，产率为88 %。
[0041 ](方案5)将331mg( lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和92.4mg( 1. lmmol)碳 酸氢钠溶于15mL二氯中，冷却到零摄氏度，再加入190.3mg(l. lmmol)间氯过氧苯甲酸在室 温下搅拌8h，然后利用高压栗进行抽滤，得到滤饼，滤饼成为我们的粗产品。如果要得到较 纯的产品，可以将滤饼用二氯甲烷和石油醚的混合体系（例如v/v，1:5)进行重结晶得到纯 品。得到红色纯净产品322.7mg，产率为93%。
[0042] 4 匪R(400MHz，DMS0)S(*10-6) :3.039(s，6H)，7.55-7.58(m，7H)，7.89-7.91(m， 4H).
[0043] 实施例2
[0044](图1)是探针(5yM)加入Fe2+(5iiM)在不同体系下的荧光光谱。体系包含无水乙醇和 超纯水按不同比例配成。
[0045] 通过图1，我们发现无水乙醇:水(3:7)体系是最适合测定的体系。
[0046] 实施例3
[0047](图2)是探针(5yM)加入Fe2+(5yM)响应时间的测试结果。首先，移取50yL的探针储 备液（lmM)放进10mL比色管中，向其加入3mL无水乙醇，然后再加入O.lmL的HEPES溶液(pH 7.4，500mM)，用超纯水定容至10mL，最后再加入5yL的二价铁离子储备液(10mM)，快速摇匀， 计时测定，其中所使用的探针是实施例1中所制备的探针。测试结果显示响应时间为15min。 结果如图2所不。
[0048] 实施例4
[0049](图3)不同浓度Fe2+(0 - 8福)对探针（5福)荧光光谱的影响；（图4)不同浓度Fe2+ (0 - 2yM)对探针（5yM)荧光光谱满足良好的线性关系。上述测定是在无水乙醇：水(3:7)体 系(5mM HEPES，pH 7.4)下进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测 试都是在25°C下二价铁离子加入作用15min后测得的。
[0050]可以看出，伴随着探针溶液中Fe2+浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且在0_2yM的 Fe2+浓度范围内，Fe2+的浓度和荧光强度成线性关系。目前，大多数已报道的生命体血液中 二价铁离子的含量小于10uM正好落入本发明的探针的检测范围内。因此，本发明的探针能 较精确地确定待测血液样本中二价铁离子的含量。
[0051 ] 实施案例五
[0052]图5不同金属离子分析物（20福）以及H202(200yM)、谷胱甘肽（200福）、谷胱甘肽 (lmM)对探针(5虚)进行选择干扰。
[0053]分析物包括:半胱氨酸CYS、谷胱甘肽GSH、钾离子K+、钙离子Ca2+、钠离子Na+、镁离 子Mg2+、铝离子A13+、锌离子Zn2+、三价铁离子Fe3+、铅离子Pb 2+、镍离子Ni2+、铜离子Cu2+、银离 子Ag+，钴离子Co 2+、镉离子Cd2+。所有测试条件是在无水乙醇比水(3:7) (5mM HEPES，pH 7.4) 中完成，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱都是在25°C下分析物加入作 用15min后测得的。具体地，移取50yL的探针储备液（lmM)放进10mL比色管中，然后加入3mL 无水乙醇，再移取相应体积的上述分析物储备液(50mM)加入荧光管内，然后移取0. lmL的 HEPES溶液(pH 7.4,500mM)，最后用超纯水定容至10mL。摇匀，静置15min，即可测定。结果如 图5所示。
[0054]从图5可以看出，生物体内存在的常见金属离子与过氧化氢不会明显干扰探针对 二价铁离子的定性与定量检测。
[0055]虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前 提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之 内。
【主权项】
1. 化合物，其具有W下结构其中：Ri，R2，R3，R4，Rs，Rs，化，Rs为独立地选自由氨原子、直链或支链烷基、直链或支链烧 氧基、横酸基、醋基和径基组成的组;且其中的Ri,化，化，R4,化，Re, R?和Rs可W相同或不同。2. 根据权利要求1所述的化合物，其为如下结构的化合物：3. 用于检测样本中二价铁离子含量的制剂，其包含具有W下结构的化合物：其中：Ri，R2，R3，R4，Rs，Rs，化，Rs为独立地选自由氨原子、直链或支链烷基、直链或支链烧 氧基、横酸基、醋基和径基组成的组;且其中的Ri，化，化，R4，化，Rs，R?和Rs可W相同或不同。4. 根据权利要求3所述的制剂，其中所述的化合物是：5. 根据权利要求3所述的制剂，其中所述的样本是血液样本。6. 制备权利要求1或2中所述的化合物的方法，其包括如下步骤:将一定摩尔比的苯并 嚷挫乙締二甲基苯胺化合物和碳酸氨钢溶于二氯甲烧中，冷却到零摄氏度后加入间氯过氧 苯甲酸，然后在室溫下揽拌一段时间，然后利用高压累进行抽滤，得到滤饼，即目标化合物 的粗产品；任选地，将滤饼用二氯甲烧和石油酸的混合体系进行重结晶得到纯品。7. 根据权利要求6所述的方法，其中苯并嚷挫乙締二甲基苯胺化合物和碳酸氨钢的摩 尔比为 1:1-1:1.5。8. 根据权利要求6所述的方法，其中苯并嚷挫乙締二甲基苯胺化合物、碳酸氨钢和间氯 过氧苯甲酸的摩尔比为1:1.1:1.1。9. 根据权利要求6所述的方法，其中揽拌的时间为1-8小时。10. 根据权利要求9所述的方法，其中揽拌的时间为3小时。
【文档编号】C09K11/06GK105985299SQ201510760179
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年11月10日
【发明人】舒伟, 柳彩云, 朱宝存, 唐成城, 王作凯, 王雅伟
【申请人】济南大学