一种甾醇内酰胺化合物马勃内酰胺及其在制备抗补体药物中的用图
【专利摘要】本发明属中药制药领域，涉及一种甾醇内酰胺化合物及其在制备抗补体药物中的用途。本发明从马勃的子实体中分离得到甾醇内酰胺化合物马勃内酰胺，该化合物为B环内酰胺的麦角甾醇，经抗补体活性评价试验，结果证实所述的甾醇内酰胺化合物马勃内酰胺其对补体系统经典途径和旁路途径激活均有较强的抑制作用，其CH50值为0.032±0.007mg/ml，AP50值为0.067±0.009mg/ml。所述化合物可用于制备补体抑制剂。
【专利说明】
一种甾醇内酰胺化合物马勃内酰胺及其在制备抗补体药物 中的用途
技术领域
[0001] 本发明属中药制药领域，涉及一种留醇内酰胺新化合物马勃内酰胺及其在制备抗 补体药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了补体系统的过度激活会引发系统性红斑狼疮（SLE)、类风湿性关 节炎（RA)、急性呼吸窘迫综合征（ARDS)等多种重大疾病。抗补体药物研究多年来一直是世 界药学研究的热点和重点。然而目前对此类疾病尚缺乏较为理想的治疗药物，因此临床上 急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。从天然产物中研究开发补体抑制剂是近年来一个 受到越来越多关注的重要研究领域，其具有成本低、毒性低等特点。国内外学者已从包括海 洋生物在内的多种天然产物中分离得到多种具有补体系统抑制作用的单体化合物，为抗补 体药物的研究与开发提供了广阔的前景。
[0003] 马勃又名马灰包、灰包子等，是一种常见的以药用为主的大型真菌，具有消肿、 止血、清肺、利咽、解毒等作用。2010年版《中国药典》规定，马勃为灰包科真菌脱皮马勃 (Lasiosphaerafenzlii Reich.)、大马勃（Calvatiagigantea(Batsch ex Pers. ) Lloyd)或 紫色马勃（Calvatia lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd)的干燥子实体。研究表明的已有的 化学成分中主要活性成分为留醇，此外还含有萜类、脂肪酸及其酯、氨基酸、多糖等，具有抗 菌、抗炎、止咳、抗肿瘤、抑制自由基等药理活性。
[0004] 本申请的发明拟提供一种从马勃中分离得到留醇内酰胺新化合物，命名为马勃内 酰胺，该化合物结构新颖独特，为B环内酰胺的麦角留醇结构，其结构和生物活性均未见报 道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种留醇内酰胺化合物马勃内酰胺及其在制备抗补体药物 中的用途。
[0006] 本发明应用现代药理研究方法，从马勃子实体的乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位中 分离得到一种留醇内酰胺新化合物马勃内酰胺，并对分离得到的单体化合物进行抗补体活 性评价，结果证实其对补体系统经典途径和旁路途径激活均有较强的抑制作用。
[0007] 本发明所述的马勃内酰胺具有以下化学结构：
[0008]
[0009] 本发明所述的化合物通过下述方法制备：
[0010] 取马勃原料粉碎，乙醇回流提取，合并提取液并浓缩得浸膏，加水混悬，分别以等 石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并萃取液并浓缩至干，乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱 分离、Sephadex LH-20柱色谱和反相HPLC等手段纯化，分离得到化合物马勃内酰胺。
[0011] 所述化合物马勃内酰胺：白色粉末，分子式C2SH41N02, EI-MS m/z: 423 [M]+。 ^-NMR (400MHz, CDC13) δ Η： 7. 45 (1Η, s, ΝΗ), 5. 76 (1Η, s), 5. 57 (1Η, s), 5. 25 (1Η, d d, J = 15. 2Hz, 7. 4Hz), 5. 18 (1Η, dd, J = 15. 2Hz, 8. 3Hz), 1. 30 (3Η, s), 1. 04 (3Η ,d，J = 6·6Ηζ), 0.94 (3H,d,J = 6·8Ηζ), 0.85 (6H,d,J = 6·6Ηζ), 0,66 (3H,s)。 13C-NMR(100MHz, CDC13) δ c:35. 2(C-1)，33· 0(C-2)，198. 0(C-3)，115. 1 (C-4)，161. 6(C-5)， 166. 7(C-6)，119. 0(C-7)，156. 5(C-8)，46. 2(C-9)，40. 4(C-10)，23. 4(C-11)，39. 2(C-12)， 45. 9 (C-13)，58. 2 (C-14)，25. 8 (C-15)，33. 0 (C-16)，56. 3 (C-17)，12. 4 (C-18)，22. 2 (C-19)， 40. 4 (C-20)，21. 0 (C-21)，134. 8 (C-22)，132. 7 (C-23)，42. 8 (C-24)，33. 0 (C-25)， 19. 6 (C-26)，19. 9 (C-27)，17. 6 (C-28)。
[0012] 本发明制得的马勃内酰胺进行了体外抗补体经典途径试验和体外抗补体旁路途 径试验，经体外抗补体活性试验测定，结果表明其对补体系统的经典途径和旁路途径激活 均有较强的抑制作用，其CH 5。和AP5。值分别为0· 032±0· 007mg/ml、0. 067±0· 012mg/ml。阳 性对照肝素 CH5。和AP 5。值分别为0. 026±0. 005mg/ml、0. 054±0. 016mg/ml。所述的马勃内 酰胺可用于制备补体抑制剂。
【附图说明】
[0013] 图1是马勃中马勃内酰胺的提取分离流程图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1制备马勃内酰胺
[0015] 取药材马勃子实体25kg，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h， 合并提取液并浓缩得浸膏〇.85kg，加水（4L)混悬，分别以以等体积石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物160g;将乙酸乙酯萃取 部位经硅胶（200-300目）柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脱， 得到10个流份（Fr. 1-10)，其中流份Fr.6(14g)再经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇， 30:1,20:1，10:1,5:1,3:1)、S印hadex LH-20 柱色谱（氯仿-甲醇，1:1)和 HPLC(甲醇-水， 20:80-80:20,梯度洗脱）等手段纯化，分离得到化合物马勃内酰胺；
[0016] 所述化合物马勃内酰胺：白色粉末，分子式C2SH41N0 2, EI-MS m/z: 423 [M]+。 ^-NMR (400MHz, CDC13) δ Η： 7. 45 (1Η, s, ΝΗ), 5. 76 (1Η, s), 5. 57 (1Η, s), 5. 25 (1Η, d d, J = 15. 2Hz, 7. 4Ηζ), 5. 18 (1Η, dd, J = 15. 2Hz, 8. 3Ηζ), 1. 30 (3Η, s), 1. 04 (3Η ,d，J = 6·6Ηζ), 0.94 (3H,d,J = 6·8Ηζ), 0.85 (6H,d,J = 6·6Ηζ), 0,66 (3H,s)。 13C-NMR(100MHz, CDC13) δ c:35. 2(C-1)，33· 0(C-2)，198. 0(C-3)，115. 1 (C-4)，161. 6(C-5)， 166. 7(C-6)，119. 0(C-7)，156. 5(C-8)，46. 2(C-9)，40. 4(C-10)，23. 4(C-11)，39. 2(C-12)， 45. 9 (C-13)，58. 2 (C-14)，25. 8 (C-15)，33. 0 (C-16)，56. 3 (C-17)，12. 4 (C-18)，22. 2 (C-19)， 40. 4 (C-20)，21. 0 (C-21)，134. 8 (C-22)，132. 7 (C-23)，42. 8 (C-24)，33. 0 (C-25)， 19. 6 (C-26)，19. 9 (C-27)，17. 6 (C-28)。
[0017] 实施例2体外抗补体经典途径试验
[0018] 取补体（豚鼠血清）0. 04ml，加入巴比妥缓冲液（BBS)配制成1:10的溶液，用BBS 对倍稀释成 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640 和 1:1280 的溶液；取 1:1000 溶血素、2% 羊红细胞（SRBC)各0. lml及各浓度补体0. 2ml溶于0. 2ml BBS中，混匀，37°C水浴30min 后放入低温高速离心机，在4000rpm、4°C条件下离心5min。分别取每管上清0. 2ml于96孔 板，在405nm测定其吸光度；实验同时设置全溶血组（0. lml 2% SRBC、0. lml溶血素溶于 0. 4ml三蒸水），以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为 X轴，溶血百分率为Y轴作图，选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常 溶血所需的临界补体浓度，取临界浓度的补体与供试品混匀，按上述方法于405nm下测定 吸光度，实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组，将供试品吸光度值扣除相应供试 品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算 50%抑制溶血所需供试品的浓度（CHJ，结果为0. 032±0. 007mg/ml，阳性对照肝素015。值 为 0· 026±0· 005mg/ml。
[0019] 实施例3体外抗补体旁路途径试验
[0020] 取补体（人血清）0.2ml，加入AP稀释液（巴比妥缓冲液，pH = 7.4,含5mM Mg2+，8mM EGTA)配制成 1:5 的溶液，并对倍稀释成 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 和 1:640的溶液；取各浓度补体0. 15ml、AP稀释液0. 15ml及0. 5 %兔红细胞（RE)0. 20ml，混 勾，37°C水浴30min后置于低温高速离心机，在4000rpm、4°C条件下离心5min。分别取每管 上清0. 2ml于96孔板，在405nm测定吸光度；实验同时设置全溶血组（0. 20ml 0. 5 % RE溶 于0. 3ml三蒸水），以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率，以补体稀释度 为X轴，溶血百分率为Y轴作图；选择达到相似高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正 常溶血所需的临界补体浓度，取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，按上述方法于405nm 下测定其吸光度，实验同时设置供试品对照组、补体组和全溶血组，将供试品吸光度值扣除 相应供试品对照组吸光度值后计算溶血率，以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作 图，计算50%抑制溶血所需供试品的浓度（APJ，结果为0. 067±0. 009mg/ml，阳性对照肝 素 AP5。值为 0· 054±0· 016mg/ml。
[0021 ] 本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。
【主权项】
1. 下式结构的酱醇内酷胺化合物马勃内酷胺，2. 按权利要求1所述的酱醇内酷胺化合物马勃内酷胺，其特征在于，通过下述方法制 备： 取药材马勃子实体，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次化，合并提取液并浓缩得浸 膏，加水混悬，分别W等体积石油酸、乙酸乙醋和正下醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干， 得乙酸乙醋萃取物；将乙酸乙醋萃取部位经硅胶200-300目，柱色谱分离，依次W二氯甲 烧-甲醇其中50:1-0:1，梯度洗脱，得到10个流份（化.1-10)，其中流份化.6再经硅胶柱色 谱其中，二氯甲烧-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3: USe地adex LH-20柱色谱其中，氯仿-甲 醇，1:1和HPLC其中，甲醇-水，20:80-80:20，梯度洗脱、纯化，分离得到化合物马勃内酷胺。3. 权利要求1所述的酱醇内酷胺化合物马勃内酷胺在制备抗补体药物中的用途。4. 按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的酱醇内酷胺化合物马勃内酷胺对补 体系统的经典途径抑制。5. 按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的酱醇内酷胺化合物马勃内酷胺对补 体系统的旁路途径激活抑制。
【文档编号】A61P37/02GK105985402SQ201510052295
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月1日
【发明人】陈道峰, 范明松, 黄成钢
【申请人】复旦大学