一种类海马抗菌肽hkplpl-2的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种类海马抗菌肽hkplpl-2，其包含源于大海马的抗菌肽hkplp保守区域GIVHAGKT-NH2的序列。主要对抗菌肽hkplp进行同源比对，分析出保守区域后，以hkplp为主体，与抗菌肽piscidin-like antimicrobial peptide precursor[Epinephelus bleekeri]的保守区域IHRRR-NH2杂合，设计并合成了hkplpl-2，序列为：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG。本发明的有益效果是：本发明所述的抗菌肽，具有高效广谱抑菌作用，低毒性。可作为抗生素替代品使用。
【专利说明】一种类海马抗菌肽hkpIp 1-2
[0001] 专利申请号：
技术领域 [0002] ：本发明为一种类海马抗菌肽hkplpl-2。
【背景技术】 [0003] ：近年来随着抗生素的滥用，抗药菌越来越多，耐药性日益严重。据资 料显示，在美国临床上分离到的金葡菌有95 %对青霉素耐药，50 %以上对甲氧西林耐药 (Frindkin SK, Gaynes RP. Antimicrobial resistance in intensive care units. Clin Chest Med. 1999, 20 (2) :303-316) ;2012年我国临床检测发现，金葡菌和凝固酶阴性葡萄 球菌中甲氧西林耐药株（MRSA和MRCNS)的检出率平均分别为47. 9%和77. 1% (2012年中 国 CHINET 细菌耐药性监测 Chin J Infect Chemother，2013,13 (5) :321-330)。这种情况 逐渐严重威胁着人类的生产生活，从而导致人们对此潜在威胁意识的觉醒及食品安全级别 意识的提高，产生了替代旧抗生素且绿色环保、安全抗耐药的新一代抗生素的迫切需要。
[0004] 抗菌肽是生物体内免疫防御系统的重要组成部分，是一类小分子肽，被称为安全 的天然抗生素，具有抗菌谱广、无耐药性、热稳定好、水溶性高、无毒无残留等优点。据统计， 目前我国尚有多达20种人畜共用或畜禽专用的抗生素作饲料添加剂，除此之外，抗菌肽还 被并将被广泛用于化妆品、食品保鲜剂、药物、转基因表达等与人类生产生活当中。将抗菌 肽产品开发成新的代替传统抗生素的产品，将给我国的相关行业注入一针强心剂，推动我 国相关行业不断向前发展。
[0005] 抗菌肽 hkplpl-2 序列：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG ;分子式：C113H177N37023,分子量 丽[AV] :2421.8 ;不含有稀有氨基酸和外源化学成分，具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀 菌等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高 压处理对其抗菌活性没有影响。可以在产品保存过程中持续发挥其功能，保持产品品质，延 长贮存期限。Hkplpl-2可以作为新一代的添加剂，是很好的传统抗生素替代品，能有效得解 决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。
【发明内容】
[0006] ：本发明的目的在于提供一种人工构建的抗菌肽序列。我们在具有很好 的抗菌活性的抗菌肽hkplp原有序列的基础上，我们对其进行人工改造设计，根据同源性 比对，分析出保守序列 GIVHAGKT。与抗菌肽plapp (piscidin-like antimicrobial peptide precursor
【发明内容】
[Epinephelus bleekeri])的保守序列IHRRR进行杂合，设计出十种人工抗菌 肽，通过筛选，最终获得序列：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG。
[0007] 本发明的方法包括如下步骤：
[0008] 步骤⑴本发明利用生物信息学方法对抗菌体hkplp进行BLAST比对，分析并选 出保守区域PI :GIVHAGKT ;
[0009] 步骤（2)选择与其功能相近的抗菌肽plapp的保守区域P2 :IHRRR，与hkplp进行 杂合设计；
[0010] 步骤（3)采用化学合成法合成hkplpl系列抗菌肽十组；
[0011] 步骤（4)采用平板培养法对合成抗菌肽hkplpl系列设计抗菌肽进行筛选，并对效 果明显的抗菌肽进行对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5a、沙门氏菌、动物致病大肠杆菌和 医院临床病例分离的大肠埃希菌、溶血葡萄球菌的抗菌实验如图1所示，结果显示抗菌肽 hkplpl-2对以上各菌均有良好的抗菌活性。
[0012] 步骤（5)中采用倍比稀释的方法配制不同浓度的hkplpl-2溶液，加入到培养菌液 中培养16h后测0D 63。值，确定人工合成hkplpl-2对不同菌株的最小抑菌浓度MIC。 【附图说明】：
[0013] 图为合成抗菌肽hkplpl-2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5 α、沙门氏菌、动物致 病大肠杆菌和医院临床病例分离的大肠埃希菌、溶血葡萄球菌的抗菌实验结果，图中表 示氨苄青霉素的抗菌活性；〇为阴性对照ddH 20 ;2、3、4为人工合成抗菌肽的抗菌活性。 【具体实施方式】：
[0014] 以下给出实施例对本发明进行具体描述，但需指出的是本发明不限于具体实施 例，实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明范围的限制。
[0015] 具体实施例说明：
[0016] 实施例1 :Fmoc-Arg(pbf)-氨基树脂的制备
[0017] 将氨基树脂Fmoc-Rink Amide 10. 03g，替代度0. 84mmol/g，加入到固相反应器中， 加入DMF浸泡，使其充分溶胀30min，抽干，加20 %哌啶/DMF溶液脱Fmoc 5min、15min，用 DMF、DCM、MeOH洗涤干净。取 1L lg Fmoc-Arg(Pbf)-OH，2.24gH0Bt，6. 14gHBTU用 DMF溶解后 加入到反应器中平衡5min，加入6. 0ml DIPEA室温反应1小时，抽干，先后用DMF、DCM、MeOH 各洗涤3次，干燥称重17. 12g Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide树脂，检测取代度为0. 67mmol/ g°
[0018] 实施例2 :hkplpl-1-氨基树脂的制备
[0019] 将上述树脂放于接肽瓶中，加入20%哌啶/1)1^溶液脱？111〇〇51^11、151^11，用01^、 DCM、MeOH洗涤干净。然后按序列GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG-My^]顺序依次接Fmoc保护 的氨基酸，反应体系摩尔比为Fmoc-AA :DIC. HOBt按1 : 1 : 1投放，在此例中Fmoc-AA按 树脂量的3倍加入，每次DIC加4. 10g左右，HOBt加4. 27g左右。期间依次20%哌啶/DMF 脱除Fmoc保护基团2次，第一次反应5min，第二次反应15min ;每一步氨基酸缩合反应一次 2-4小时，均采用Kaise Test检测反应是否缩合完全，如显色反应呈阳性重复缩合该氨基 酸，序列缩合最后直接脱除Fmoc保护基团，DMF、DCM、MeOH洗涤几次。
[0020] 实施例3 :hkplpl-l粗品的制备
[0021] 他?1?1-1氨基树脂用了?4:118:?11611〇1按体积比95:2.5:2.5的混合溶液处理 肽树脂3-4小时，把肽从树脂上切下来及切除侧链保护基，浓缩至干后用冰乙醚析出固体， 离心干燥得粗品29. 51g。
[0022] 实施例4 :hkplpl-l成品的制备
[0023] Hkplpl-Ι粗品用1%醋酸溶液溶解后，离心取上清过G10柱，收集抗菌肽hkplpl-1 峰浓缩干燥得成品17. 71g。纯度大于60%，总收率达54%。
[0024] 实施例5 :按实施例1至4合成其余hkplpl系列的多肽。序列如下：
[0025] hkplpl-2 ：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG
[0026] hkplpl-3 ：GLIFKGIVHAGKT LHRVIHRRG
[0027] hkplpl-4 ：GLFIKGIVHAGKT LHRVIHRRG
[0028] hkplpl-5 ：GLIKFGIVHAGKT LHRVIHRRR
[0029] hkplpl-6 ：GLIFKGIVHAGKT KHRVIHRRR
[0030] hkplpl-7 ：GLIFKGIVHAGKT HLRVIHRRR
[0031] hkplpl-8 ：GILKFGIVHAGKT LHRVIHRRR
[0032] hkplpl-9 ：GILKFGIVHAGKT IKRVIHRRR
[0033] hkplpl-10 ：GLIFHGIVHAGKT LKRVIHRRR
[0034] 实施例6 :hkplpl系列筛选
[0035] 从YPD平板上挑取PCR鉴定为阳性的单菌落接种于lOOmlBMGY培养基，30°C振荡 培养至〇D_2~6,去上清，加入20mlBMMY培养基重悬菌体，30°C振荡培养96小时，每隔24 小时取lml样品于Eppendorff管中，取上清用于抗菌活性检测。
[0036] 将琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50°C左右，用无菌操作法吸取60 μ 1的 金黄色葡萄球菌（0D600 = 0. 3)，加入20ml琼脂培养基中，迅速混勾，倾倒入直径为9cm的 无菌平面皿内，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2. 7_的圆孔，分别在孔中加入用磷酸 盐缓冲液配制的合成hkplpl，无菌水和100mg/ml Amplicin。将平皿倒置于37°C培养过夜， 次日观察结果。结果见表1。
[0037] 表1金黄色葡萄球菌Hkplpl系列多肽筛选
[0038]
[0039] 实施例7 :合成抗菌肽hkplpl-2抗菌谱的测定
[0040] 从YPD平板上挑取PCR鉴定为阳性的单菌落接种于lOOmlBMGY培养基，30°C振荡 培养至〇D_2~6,去上清，加入20mlBMMY培养基重悬菌体，30°C振荡培养96小时，每隔24 小时取lml样品于Eppendorff管中，取上清用于抗菌活性检测。
[0041] 将琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50°C左右，用无菌操作法吸取60 μ 1的 生测菌（0D600 = 0. 3)，加入20ml琼脂培养基中，迅速混勾，倾倒入直径为9cm的无菌平面 皿内，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2. 7mm的圆孔，分别在孔中加入用磷酸盐缓冲液 配制的合成hkplpl-2,无菌水和100mg/ml Amplicin。将平皿倒置于37°C培养过夜，次日 观察结果。
[0042] 人工合成的抗菌肽hkplpl-2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5 α、沙门氏菌、动物 致病大肠杆菌和医院临床病例分离的大肠埃希菌、溶血葡萄球菌的抗菌实验如图1所示， 该抗菌肽对以上各菌均有良好的抗菌活性。
[0043] 实施例8 :人工合成hkplpl-2最小抑菌浓度（MIC)的测定
[0044] MIC :将测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为约5X 106CFU/ml，加入96孔培 养板中，测试孔每孔加入菌液90 μ 1，然后加入倍比稀释的不同浓度的合成抗菌肽溶液， 10 μ 1/孔。阳性对照为100 μ 1/孔的菌液，阴性对照为相应的100 μ 1培养基。然后于37°C 慢摇培养约16h，用酶标仪测0D63。。抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果见表2。
[0045] 表2重组抗菌肽HKPLPL-2的MIC
[0046]
[0047] 实施例9 :人工合成抗菌肽hkplpl-2抗菌活性单位确定
[0048] 我们将lmg纯度不低于95%的固相化学合成的抗菌肽hkplpl-Ι的抗菌活力定义 为1000U。因此人工合成的抗菌肽hkplpl-2的抗菌活力不低于630U/mg。
[0049] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，本发明所属技术领域的 技术人员可以做出若干推演或替换，都应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种类海马抗菌肽hkplpl-2的化学合成方法及其部分抗菌谱功能，主要包括以下 步骤： 1) 以Fmoc-氨基树脂为载体，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸， 获得hkplpl-2-氨基树脂，期间依次脱除Fmoc保护基团； 2) 用三氟乙酸混合溶液把肽从树脂上切下，处理干燥得粗品； 3) 粗品过G10柱纯化，浓缩干燥获得成品； 4) 测定人工合成的抗菌肽hkplpl-2的抗菌谱； 5) 测定人工合成的抗菌肽hkplpl-2的最小抑菌浓度（MIC)。2. 根据权利要求1所述方法，其特征是：固相合成连接氨基酸过程中，Fmoc保护基团脱 除剂用20%哌啶/DMF，Fmoc-AA按缩合量的2-5倍量加入，其中Fmoc-AA、缩合剂比例按摩 尔比1 : 1投放，缩合反应每次2-4小时。3. 根据权利要求1和2所述方法，其特征是：在氨基酸连接过程中，每一步氨基酸缩合 均采用Kaise Test检测反应是否缩合完全，如显色反应呈阳性重复缩合该氨基酸。4. 根据权利要求1和2所述方法，其特征是：缩合剂体系采用DIC+A或A+B+C，其中A 为HOBt或H0At，B为HBTU、HATU、PyBOP或TBTU，C为DIPEA或TMP，可以采用排列组合的方 式相互组合。5. 根据权利要求1中2)所述方法，其特征是：三氟乙酸混合溶液为 丁卩八：118:?11611〇1按体积比95:2.5:2.5，反应时间为3-4小时。6. 根据权利要求1中2)所述方法，其特征是：处理干燥是指切割液浓缩或吹至干后用 冰乙醚析出固体，离心干燥。7. 根据权利要求1中3)所述方法，其特征是：用1 %的醋酸溶液处理hkplpl-2粗品， 离心取上清过G10柱。8. 根据权利要求1中3)所述方法，其特征是：收集的hkplpl-2过柱液经浓缩后干燥。9. 根据权利要求1中4)所述内容，其特征是：用平板培养法表明人工合成的hkplpl-2 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D 31、大肠杆菌DH5 α、沙门氏菌、动物致病大肠杆菌和医院 临床病例分离的大肠埃希菌、尿肠球菌、溶血葡萄球菌均有良好的抗菌活性。10. 根据权利要求1中5)所述内容，其特征是：采用倍比稀释的方法配制不同浓度的 hkplpl-2溶液，加入到培养菌液中培养16h后测0D63。值，确定人工合成hkplpl-2对不同菌 株的最小抑菌浓度MIC。
【文档编号】C07K7/06GK105985407SQ201510060607
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】梁东, 张广献, 詹朝宇, 刘瑞兰
【申请人】广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司