抗npt ii蛋白的单克隆抗体及其应用
【专利摘要】本发明公开了特异性识别转基因植物中抗生素类安全筛选标记NPT II(新霉素磷酸转移酶基因，neomycin phosphotransferase gene II)单克隆抗体及其制备方法和用途，目的是为免疫学方法检测天然转基因物种(玉米、水稻、棉花等)中是否存在筛选标记NPT II蛋白提供关键试剂材料。制备该抗体的抗原为由经化学合成的特征性多肽片段经半胱氨酸与KLH载体蛋白偶联后免疫小鼠，最终获得的抗体均属于IgG1亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得。对天然转基因水稻材料的免疫印迹(Western Blotting)检测和酶联免疫吸附测定(ELISA)，该抗体具有很好的特异性，可以用于对转基因材料的定性与定量检测。
【专利说明】
抗NPT I I蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及识别转基因植物的抗生素类筛选标记新霉素磷酸转移酶基因 (neomycin phosphotransferase gene II)的单克隆抗体制备方法以及采用两种单克隆抗 体组装为ELISA检测试剂盒的方法，以及该试剂盒在水稻和棉花等转基因植物检测中的用 途，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002] 随着转基因产品的不断涌现，随之而来的问题就是转基因产品的安全评价及测 定。在转基因品种的培养和后期鉴定中，离不开针对转化的筛选标记和报告基因，最常用的 筛选标记包括抗生素抗性类筛选标记基因和抗除草剂基因，这类抗性筛选标记基因有可能 会通过基因漂移造成基因污染，对环境产生不利影响（魏伟，马克平.如何面对基因流和基 因污染[J].中国农业科技导报，2002,4(4): 10-15)。另外，含有该种标记基因的转基因食 物有可能不会被人类的肠道系统吸收利用，还很有可能产生毒副作用。所以，为降低生物安 全风险，减少对环境和生物的潜在危害，目前对转基因植物的筛选标记主要包括GUS报告 基因的生物化学染色方法，NPT II基因的G418抗生素抗性筛选以及CP4EPSPS -类抗除草 剂基因的抗性筛选方法，其中NPT II基因被用在众多转基因植物转化用载体的构建中，该 基因的蛋白产物因此也会出现在转基因植物的植株、叶片及籽粒中。为降低此类抗生素抗 性蛋白对环境和生态的不利影响，转基因植物已经逐渐向非抗生素抗性筛选过渡，比如以 PMI基因编码的磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI)替代抗生素抗性，最 终实现更安全的无标签（Marker-free)筛选鉴定体系。
[0003] 对于包含NPT II蛋白转基因植物的鉴定，通常都采用PCR的方法对植物进行检 测，(Varsha et. al. , Development of a multiplex Polymerase Chain Reaction method for specific detection of Genetically Modified Cotton Events MON 531and MON 15985. International Journal of Basic and Applied Sciences，2012，Vol :45-52)，申 请号为CN200410023293的发明专利"含NPT-II标记基因转基因水稻的快速检测"方法公 开了一种利用不同G418抗生素浓度进行转基因植物筛选的方法，该方法对于生长的植物 是有效的，但对于经加工的粮食制品，因为加工过程的影响，很难检测到完整的核酸分子， 因此，检测转基因目的蛋白也是一种重要的方法。
[0004] 制备特定蛋白的夹心检测用抗体通常的方法为利用重组蛋白或选择在空间和 序列组成上具有免疫原性和亲水性的抗原肽经与载体蛋白偶联后进行动物免疫。重组 蛋白的方法简单易行，但因优势抗原的存在，筛选过程较为繁琐，且难以筛选到配对良好 的抗体，而以多肽作为抗原时，经结构和序列分析后选择恰当区域的多肽分别合成与免 疫则可提高实验的成功率，并可能制得高灵敏度的检测抗体。研究论文Development of a chemiluminometric immunosensor array for on-site monitoring of genetically modified organisms(Hye-Jee Jang，Il-Hoon Cho Hee-Soo Kim，Jin-Woo Jeon, Se-Young Hwang，Se-Hwan Paek，Sensors and Actuators B:Chemical，2011，155(2) :598 - 605)中 提供了利用重组蛋白制备NPT II抗体的方法，并将之用于免疫传感器检测。申请号为 CN201310365343发明专利"转基因作物中新霉素磷酸转移酶（NPT II )双抗体夹心ELISA 定量检测方法"公开了以重组蛋白为免疫原，分别免疫新西兰大白兔和小鼠制备多克隆抗 体及单克隆抗体，并将其组装为单抗-多抗夹心ELISA试剂盒的方法。众所周知，因多克隆 抗体自身的非均一组成特征，其特异性要比单克隆抗体差，且不能连续生产，不同批次免疫 动物制备的多抗易产生批间差，造成测定结果不稳定。因此，通过独特的抗原设计，制备NPT II的高特异性和高亲和力单克隆抗体是检测和鉴定带有NPT II标签转基因植物的得力工 具。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种针对转基因植物中常用筛选标记NPT II基因产 物NPT II蛋白的单克隆抗体杂交瘤的制备方法。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一对特异性好、亲和力高，可用于双抗夹心ELISA检 测的抗NPT II单克隆抗体72450-3和72449-13,这两个抗体能特异结合NPT II重组抗原 和转基因植物材料中的NPT II蛋白成分。
[0007] 本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于以水稻为代表的转基因生物的检 测方法。
[0008] 解决技术问题所采用的技术手段
[0009] 本发明首先利用合成的多肽抗原制备了两株分泌抗NPT II抗体的杂交瘤细胞株， 所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
[0010] 1)按照序列表中Seq ID No:l所示的NPT II蛋白的氨基酸序列进行分析，依据在 细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择了两段在空间上互不 影响、具有良好免疫原性的多肽片段进行化学合成，合成的多肽其C端具有 Cys残基，可通 过该Cys与载体蛋白KLH偶联，免疫Balb/c小鼠。
[0011] 2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞 与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融 合细胞生长克隆。
[0012] 3)以重组NPT II蛋白为抗原，应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技 术筛选和鉴定后，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。
[0013] 上述技术方案中，步骤3)中，制备重组NPT II蛋白的方法可以按照本领域技术人 员熟知的DNA和蛋白质表达操作技术进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和 表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，重组蛋白的纯化。 具体地，可参考《分子克隆实验指南（第三版）》（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等 译，2009年，科学出版社）。
[0014] 本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的两株杂交瘤细胞株及其抗体 72450-3和72449-13。其中72450-3的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No: 5和SEQ ID No :7所示，72449-13为SEQ ID No :9和SEQ ID No :11所示。两株抗体均为 鼠源IgGl亚型单克隆抗体。
[0015] 本发明从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种：
[0016] 1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离 纯化所需单克隆抗体；
[0017] 2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗 体。本发明用腹水法制备的抗体经Protein A/G柱亲和层析纯化得到的NPT II单抗，用 ELISA技术测定72450-3和72449-13分泌的抗体亲和常数分别为1. 79 X 109和2. 27 X 10 9。
[0018] 本发明的这两株抗体可以共同或单一地对生物样品中的NPT II蛋白进行免疫学 检测。可以应用的免疫学检测方法包括但不限于利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸 附检测（ELISA)、免疫印迹（Western Blot)、流式细胞术（FACS)、免疫组织化学（IHC)检 测或者免疫PCR检测方法。在免疫学检测中，该抗体可单独或与通过化学键偶联，静电吸 附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP)，碱性磷酸酶（AP)，生物 素（Biotin)，异硫氰酸荧光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。免疫印记 (Western blotting)实验显示这两株抗体均能特异识别重组的NPT II蛋白以及天然水稻 叶片材料中的转基因筛选标记基因 NPT II。
[0019] 本发明中的单克隆抗体，可以用作检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。 本发明的这两株抗体还可以共同或单一地对含NPT II标签的生物样品进行基于免疫学的 生物分离中。该基于免疫学的分离方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流 式细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。
[0020] 本发明的优点及有益效果
[0021] 本发明获得的可由杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体72450-3和72449-13,能识别重 组和天然NPT II蛋白，具有极强特异性和敏感性。能用于转基因植物的检测与筛查。
[0022] 因两种抗体的免疫原为特殊设计，位于NPT II蛋白不同空间位置，且其序列具备 适当的β -转角等二级结构，因此不仅可单独使用，也便于组合为双抗夹心ELISA试剂盒。
【附图说明】：
[0023] 图1 :在大肠杆菌中表达和纯化的NPT II重组蛋白。U :未诱导的对照；S:诱导菌 的超声上清；Pe:诱导菌的沉淀；Pu:经镍柱纯化后的NPT II蛋白；Marker为分子量蛋白， 表达产物的大小约为35kDa，使用12% SDS-PAGE凝胶。
[0024] 图2.单克隆抗体72450-3以免疫印迹法检测重组NPT II蛋白和水稻叶片蛋白的 结果。Re-NPT-II:纯化的重组大肠杆菌NPT II蛋白，带有His标签；Rice-:非转基因水 稻叶片蛋白；不含NPT II蛋白；Rice+:转基因水稻叶片，含NPT II蛋白；HSP:以HSP蛋白 作为内参蛋白用于确定非转基因和转基因水稻蛋白的载量一致。.
[0025] 图3 :单克隆抗体72450-3对非转基因和转基因水稻叶片蛋白的免疫印迹检测结 果，样本1-4为转基因水稻材料，其中1 :根部蛋白提取物；2 :茎部蛋白提取物；3:叶片蛋白 提取物；4 :穗子蛋白提取物，Μ为分子量标记物；5-8为非转基因水稻kasalath的蛋白样 本，其中5 :根部蛋白提取物；6 :茎部蛋白提取物；7:叶片蛋白提取物；8 :穗子蛋白提取物。 一抗为lmg/ml的单克隆抗体，按1 :1000稀释，二抗为HRP酶标羊抗鼠，稀释比例1:5000。
[0026] 图4 :单克隆抗体72449-13对非转基因和转基因水稻叶片蛋白的免疫印迹检测结 果，样本1-4为转基因水稻材料，其中1 :根部蛋白提取物；2 :茎部蛋白提取物；3:叶片蛋白 提取物；4 :穗子蛋白提取物，Μ为分子量标记物；5-8为非转基因水稻kasalath的蛋白样 本，其中5 :根部蛋白提取物；6 :茎部蛋白提取物；7:叶片蛋白提取物；8 :穗子蛋白提取物。 一抗为lmg/ml的单克隆抗体，按1 :1000稀释，二抗为HRP酶标羊抗鼠，稀释比例1:5000。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可 以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
[0028] 实施例1重组PMI蛋白的制备
[0029] 一、基因克隆和表达纯化
[0030] 根据npt ii基因的序列设计PCR引物，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行扩 增（图1)，将扩增产物定向插入到pET30a(+)载体相应的酶切位点上，构建重组表达载 体pET30a-npt载体，双酶切后得到约5. 4k的pET30a(+)线性片段和约790bp的插入片 段，根据测序结果选择无碱基突变的质粒，获得npt II基因的原核表达载体。将重组载体 pET30a-npt II转入表达菌中，挑取单菌落后培养放大，按1:100的比例将单菌落培养的过 夜菌转接至l〇〇ml LB培养基，加入终浓度为50 μ g/ml的卡那霉素，37°C振荡培养至0D6。。 为0.6~0.8。加入0. lmol/L的IPTG，25°C震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白 带有组氨酸标签，细菌超声破碎后离心分离上清和沉淀，用Ni 2+-NTA亲和层析柱纯化，进行 SDS-PAGE分析.由图1可见，在大肠杆菌的上清和沉淀中均能清楚地观测到目的条带，纯化 后获得了分子质量约为38kDa。
[0031 ] 实施例2杂交瘤细胞系的建立
[0032] -、免疫
[0033] 将按照序列表中Seq ID No :2及Seq ID No :3的氨基酸序列化学合成的两条多 肽NPT II-p印1和ΝΡΤΠ -ρ印2分别与KLH载体蛋白（Thermo公司）偶联。交联后的多肽 用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华 实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60 μ g/只。每14天加强免 疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化，剂量为30yg/只。第3次加强免疫 后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠 以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50 μ g/只。
[0034] 二、细胞融合
[0035] 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 (ATCC)以5:1比 例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37°C水浴中，在1分钟内缓慢加入lml的 PEG1500(Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置lmin后，加入10ml无血清的頂DM(Sigma 公司），混勾，离心lOOOrpm，5min。弃上清后，加入10ml血清（PAA公司）小心的将细胞吹 打起来，并加入5ml混合10 X HAT (Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2. 1 % 硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。 将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37°C 5% 0)2培养箱中培养。
[0036] 三、阳性杂交瘤筛选及保存
[0037] 融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入 事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37 °C 5 % 0)2培养箱中培养。
[0038] 四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
[0039] 3天后，细胞量大约占底面积2/3,取100 μ 1上清用免疫原和合成多肽分别进行 ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200 μ 1含饲养细胞和1% HT (Sigma公司）的完全 培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和 HT)的24孔板培养。五天后取100 μ 1上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔 板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。
[0040] 实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体
[0041] 一、腹水制备
[0042] 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数~5X 105,1ml。悬浮的细胞腹 腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4°C离心4000rpm， lOmin。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4°C或-20°C保存。二、单克隆抗体的纯化
[0043] 用HiTrap rProtein A FF(GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。 SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20°C。
[0044] 实施例4单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定
[0045] 一、亚类鉴定
[0046] 用lOOmM PBS(pH7. 4)稀释包被羊抗鼠 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司）至 0. 5 μ g/ml，每孔加 100 μ 1，4°C，过夜。倾空液体，用含 0. 05 % Tween 的 PBS (PBS-T)洗 3 次， 每孔加入200 μ 1封闭液（含2% BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T 清洗3次。每孔加入0. lml杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封 闭液1 :1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ，λ )抗体或1 :2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM， IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3, IgA)抗体（Southern Biotech 公司）0· lml 每孔分别加入适当的 孔中，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含0· 15%ABTS(Southern Biotech公司）和0. 03%氏02的柠檬酸缓冲液（PH4. 0)进行显色反应，10-20min内测定 405nm波长下的0D值。结果显示，本发明单克隆抗体72450-3和72449-13均为IgGl型鼠 源单克隆抗体。
[0047] 二、亲和常数测定
[0048] 包被重组NPT II蛋白，包被浓度为2μg/ml，100μ1/孔，4°C包被过夜，PBS-T洗3 次。每孔加200 μ 1封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从 1 :200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的 羊抗鼠二抗1 :20000稀释，每孔100 μ 1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100 μ 1含 0· 1 % TMB (Sigma公司）和0· 03% Η202的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50 μ 1 0· 5Μ 硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出0D值对应抗体稀释倍数的曲 线，找出彡1/2"平台0D值"对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出72450-3和72449-13 分泌的抗体亲和常数分别为1. 79X 109和2. 27X 10 9。
[0049]
[0050] 实施例5本发明单克隆抗体的应用效果
[0051] 以纯化的重组NPT II作为抗原，同时从转基因和非转基因水稻kasalath叶片、 根、茎和穗中提取蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体识别特异性及在检测 转基因植物中的应用效果。免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样5-10ng，进行12%聚 丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上 (1^111?〇^公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的185-1'封闭液中4°(：过夜。加入单克隆抗 体70450-3及70449-13(1 :1000稀释）4°C孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1 :5000稀释 的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加 入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统 (Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
[0052] 实验结果如图2可见，72450-3可特异性识别重组NPT II蛋白和转基因水稻中的 NPT II蛋白成分，而不识别非转基因的水稻。图3和图4结果可见，72450-3和72449-13 均能特异性地识别转基因水稻中的NPT II蛋白，在转基因水稻的不同部位，NPT II分布的 情况也有不同，其中根部含量最低，几乎不可检出，茎部次之，而叶片和穗子中的蛋白含量 很高。
[0053] 实施例6抗体的可变区序列测定
[0054] 培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株 的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集1〇 6以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤 细胞总 RNA，取 9 μ L 总 RNA，加入 2. 5 μ L oligo (dT) 12 - 18primer (10mM)，及 5 μ L dNTPs， 混合均匀，70°C保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加 入 5yL RT buffer(5X)，2.5yL DTT(O.IM)及 lyL 逆转录酶，42°C 反应 1 小时。70°C 孵 育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20°C。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增， 在50 yL反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按 照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合 成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV. B1直至MHV. B12的11条引物为上游引物， 可分别与重链下游引物MHC. F组合用于扩增重链可变区基因。
[0067] 用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10条引物为上游 引物，可分别与轻链下游引物MKC. F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。
[0079] 其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1 μ L和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94°C 40秒，52 °C 40秒，72 °C 40秒，进行20至25个循环， 最后72 °C延伸3分钟，产物可置于4°C备用或直接电泳。取20 μ L PCR产物进行电泳分析， 在1. 5%琼脂糖凝胶上分离切胶回收，克隆至Τ载体测序。
[0080] 实施例7 ΝΡΤ II的单克隆抗体用于ELISA的效果
[0081] 与CP4 EPSPS多克隆抗体配对，用重组的ΝΡΤ II蛋白为标准品，检测两种NPTII 单克隆抗体72450-3和72449-13用于双抗夹心ELISA的效果。实验步骤如下：
[0082] 将单克隆抗体72450-3,100 μ 1/孔，4°C包被过夜，包被的抗体浓度为1 μ g/ml至 5 48/1111均是有效的。用1%834在37°(：，封闭211。取纯化后的即1'11蛋白用？831'稀释 成 10 μ g/ml、1 μ g/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml、100pg/ml、10pg/ml 的蛋白稀释液，以 100 μ 1/孔（2个重复）加入不同的孔作为标准曲线，同时加入转基因水稻及非转基因水稻 叶片中提取的蛋白质，37°C孵育lh。每孔加入100 μ 1稀释的经HRP标记的72449-13单克 隆抗体作为检测抗体，该抗体的原始浓度为lmg/ml，稀释500-1000倍使用，此时其终浓度 为lμg/ml至2μg/ml，37°C孵育lh。以上每步完成后均用0.05% PBST清洗酶标板5-8 次，吸水纸彻底拍干。每孔加100 μ 1 TMB显色液，反应3-5分钟，加入50 μ 1终止液终止反 应。测定405nm波长下读取各孔0D值。
【主权项】
1. 一种结合NPT II蛋白的免疫组合物，其特征在于包含由小鼠杂交瘤细胞系72450-3 和/或72449-13分泌的单克隆抗体。2. 权利要求1所述的两种单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原分别具有SEQ ID No :2和 SEQ ID No :3所示的氨基酸序列，该多肽经化学合成后与KLH载体蛋白偶联，用于免疫小 ￡3 邱U3. 权利要求1所述的72450-3单克隆抗体，其重链可变区的DNA编码序列和氨基酸序 列分别为SEQ ID No:4和SEQ ID No:5,其轻链可变区的DNA编码序列和氨基酸序列分别 为 SEQ ID No :6 和 SEQ ID No :7。4. 权利要求1所述的72449-13单克隆抗体，其重链可变区的DNA编码序列和氨基酸序 列分别为SEQ ID No:8和SEQ ID No:9,其轻链可变区的DNA编码序列和氨基酸序列分别 为 SEQ ID No :10 和 SEQ ID No :11。5. 权利要求1所述的单克隆抗体，其为小鼠 IgGl亚型单克隆抗体。6. 权利要求1所述的单克隆抗体，其可单独或与其它缀合物连接完成含NPT II蛋白的 生物样本的免疫学检测和生物分离。7. 权利要求6所述连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AP)、生物素 (Biotin)、异硫氰酸荧光素（FITC)、Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖。8. 权利要求5所述的免疫学检测方法包括利用抗体直接和抗原结合的酶联免疫吸附 检测（ELISA)、免疫印迹（Western Blot)、流式细胞术（FACS)、免疫组织化学（IHC)检测或 者免疫PCR检测方法。9. 权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于可作为检测试剂用于转基因植物检测双 抗夹心ELISA试剂盒的制备。10. 权利要求9所述的转基因植物NPT II蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于抗体的 包被浓度为1 μ g/ml到5 μ g/ml浓度范围，检测抗体的使用浓度为1 μ g/ml-2 μ g/ml浓度 范围。
【文档编号】C07K16/40GK105985438SQ201510097938
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月5日
【发明人】尹长城, 刘国振, 兰金苹, 武鹏程, 郭美岑, 史佳楠, 韦汉福, 荣瑞娟, 郝育杰, 李莉云, 吴 琳, 刘斯奇
【申请人】北京华大蛋白质研发中心有限公司