赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，所述保护剂的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其盐和赖氨酸或其盐的一种，两种或多种混合物；所述保护剂的各成分在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为0.2％～5％。
【专利说明】
赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种改善赖氨酰肽链内切酶稳定性的冻干及 贮存保护剂以及酶溶液保护剂。
【背景技术】
[0002] 赖氨酰肽链内切酶（Lysyl Endopeptidase，Lep)，EC3.4.21.50,分子量约为30KD， 属于丝氨酸蛋白酶家族成员之一，能特异切割肽链中赖氨酸残基或氨乙基半胱氨酸C端的 肽键，能显著提高酶切转化率和纯度，故常用于蛋白质序列分析中的质谱分析和Lys-X的化 合物酶催化合成。目前表达Lep的野生菌有铜绿假单胞菌，促溶无色杆菌和产酶溶杆菌。产 酶溶杆菌产酶比无色杆菌活性高，本发明所用菌株为促溶无色杆菌M497-1(ATCC 21456)， 从美国模式菌种保藏中心购得。酶的发酵和纯化步骤参考文献方法(Masaki T，Tanabe M， Nakamura K，et al. Studies on a new proteolytic enzyme from Achromobacter lyticus M497-1I.Purification and some enzymatic properties[J].Biochimica Et Biophysica Acta，1981，660(1) :44-50)。纯化得到Lep之后，对其冻干处理是长期保存此酶 的重要方法。但冻干过程牵涉到复杂的相变过程，在冻结、冻融干燥、储存过程中，存在多种 诱导蛋白变性的因素，又因该酶自身的氨基酸序列中含有赖氨酸残基，因此在冻干和溶液 保存时，易失活或自身酶切，故需要开发新的方法以提高其稳定性。
[0003] 专利CN102973526A公开人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程中的保护剂，包括使用蔗 糖、赖氨酸、酪氨酸、天冬氨酸的一种进行保护。
[0004] 专利CN101893639A公开了稳定血清α-羟丁酸脱氢酶和乳酸脱氢酶活性的方法，使 用了牛血清蛋白、海藻糖(或蔗糖）、甘露醇和甘氨酸作为保护剂进行冻干。
[0005] 尽管添加糖类和氨基酸作为保护剂用于制备酶制剂已属公知技术，但是由于酶结 构组成的千差万别，目前尚没有一种可以直接套用的保护剂组成进行各种酶的保护，因此， 针对具体酶而言为改善其稳定性，仍需要大量的试验进行保护剂的筛选。文献检索表明：目 前尚没有已经公开一种稳定的赖氨酰肽链内切酶混合物和方法。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，解决赖氨酰肽链内切酶在冻干过程中和溶液状态保 存时的自身酶解问题，最大程度地提高酶的稳定性，满足长期贮存的需要。
[0007] 本发明提供了一种赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，所述保护剂的成分包括 蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其盐和赖氨酸或其盐的一 种，两种或多种混合物;所述保护剂的各成分在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇. 2% ~5% 〇
[0008]其中，优选地，所述的保护剂的pH为4~10。
[0009]其中，优选地，所述的保护剂还包括roS缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓 冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
[0010]优选地，所述的保护剂选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其盐的一种。
[0011]优选地，所述的保护剂pH为5或10。
[0012] 进一步优选地，所述的保护剂选择如下混合物，
[0013] 蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物；
[0014] 蔗糖、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物；
[0015] 蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物；
[0016]蔗糖、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐的混合物；
[0017] 右旋糖酐、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物；
[0018] 右旋糖酐、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物；
[0019] 右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物；
[0020]右旋糖酐、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐的混合物；
[0021 ]乳糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物；
[0022]乳糖、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物；
[0023]乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物；
[0024]乳糖、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐的混合物；
[0025]蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物；
[0026] 右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物；
[0027] 海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物。
[0028] 优选地，所述的混合物的成分在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为1%。
[0029] 进一步优选地，所述的保护剂选自如下优选地的混合物，
[0030] 乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其盐的混合物；
[0031] 蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其盐的混合物；
[0032] 蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物；
[0033] 右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物。
[0034]优选地，所述的保护剂pH为5-10。
[0035] 优选地，所述的保护剂选自的混合物，所述由两种成分组成的混合物中的成分在 酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇 .2%，0.5%，1%，2.5%或5 %。
[0036] 其中，优选地，所述蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖在酶冻干溶液中的质量体 积百分浓度为0.5%，甘氨酸或其盐在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为1%;所述右旋 糖酐和甘氨酸或其盐的混合物，右旋糖酐在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇. 5%，甘 氨酸或其盐在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇. 5%。
[0037] 本发明还涉及一种赖氨酰肽链内切酶的冻干剂，其特征在于，包括如下组分:如上 所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，所述保护剂成分在酶冻干溶液中的质量体积 百分浓度为〇. 2 %~5% ;和赖氨酰肽链内切酶，所述的赖氨酰肽链内切酶酶冻干溶液中的 质量体积百分浓度为〇. 0001 % -〇. 02 %。
[0038] 优选地，所述的冻干剂的pH为4~10。
[0039] 另一方面，一种赖氨酰肽链内切酶的贮存溶液，包括如下组分：
[0040] 如上所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，所述保护剂成分在酶冻干溶液 中的质量体积百分浓度为0.2%~5% ;
[0041 ]和赖氨酰肽链内切酶，所述的赖氨酰肽链内切酶在酶贮存溶液中的质量体积百分 浓度为0.0001 %-0.02 %。
[0042] 所述的保护剂选用蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其盐在酶 贮存溶液中的质量体积百分浓度为1 %。
[0043] 上述混合物，是所述物质包含两种或多种成分的组成物。
[0044] 上述的两种成分组成的混合物，包括但不限于上述的蔗糖和甘氨酸或其盐的混合 物，右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物及海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物。
[0045] 上述的酶冻干溶液，是赖氨酰肽链内切酶的冻干前的最终溶液。上述的酶贮存溶 液，是赖氨酰肽链内切酶贮存时的溶液。
【附图说明】
[0046] 图1是十肽底物在赖氨酰肽链内切酶的酶切产物的液相分析。
[0047]其中，底物峰保留时间为14.3min;酶切底物后，产物1保留时间分别是6.8min，产 物21保留时间是3.3min。
【具体实施方式】
[0048]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明 的【具体实施方式】做详细的说明。
[0049] 所述的"包括"表示本发明的保护剂除了含有所述成分如蔗糖，海藻糖，乳糖等或 组合物等，还可以包含一些用于调整保护剂pH的物质，如用于调整保护剂pH的缓冲液等。
[0050] 根据本申请的某些实施方式，所述保护剂包括蔗糖，甘氨酸或其盐，甘露醇等单一 成分，也包括由蔗糖、甘氨酸或其盐、赖氨酸或其盐、聚乙二醇4000和右旋糖酐其中三种成 分组成的混合物，及包括由甘氨酸或其盐、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷其中两种成分组成的混 合物;例如，保护剂为蔗糖，海藻糖，甘氨酸或其盐，甘露醇，右旋糖酐，聚乙二醇4000，乳糖， 赖氨酸或其盐及蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖、甘露醇和赖氨酸或其盐的混 合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐 的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物，右旋糖酐、甘露醇和赖氨酸或其盐 的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和 赖氨酸或其盐的混合物，乳糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物，乳糖、甘露醇和赖氨酸或 其盐的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和赖氨 酸或其盐的混合物，以及蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合 物，海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物;其中优选地，蔗糖，甘露醇，甘氨酸或其盐，乳糖、聚乙 二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖和甘氨 酸或其盐的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物。其中混合物各成分的比例，可由混 合物中的各成分在酶冻干溶液的浓度决定。
[0051] 在本申请的某些实施方式中，在赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存溶液中，包括上述 的保护剂，其中保护剂的成分在酶冻干溶液中的溶度(质量体积)为〇.2%~5%，例如0.2% ~1%，0.3%~1%，0.4%~1%，0.5%~1%，0.6%~1%，0.7%~1%，0.8%~1%，0.9% ~1%，0.2%~0.5%，0.3%~0.5%，0.4%~0.5%，0.2%~2.5%，0.3%~2.5%，0.4% ~2·5%，0·5%~2·5%，0·6%~2·5%，0·7%~2·5%，0·8%~2·5%，0·9%~2·5%，1% ~2·5%，1·5%~2·5%，2%~2·5%，0·2%~5%，0·3%~5%，0·4%~5%，0·5%~5%， 0.6%~5%，0.7%~5%，0.8%~5%，0.9%~5%，1%~5%，1.5%~5%，2%~5%， 2.5%~5%，优选地0.2%~0.5%，0.5%~1%，0.2%~2.5%，0.5%~2.5%，0.2%~ 5%，1%~2.5%，1%~5%，2.5%~5%。具体实施时，采用如上所述的三种成分混合物或 两种成分的混合物，如蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖、甘露醇和赖氨酸或其 盐的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和赖氨酸 或其盐的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物，右旋糖酐、甘露醇和赖氨酸 或其盐的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和 赖氨酸或其盐的混合物，乳糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物，乳糖、甘露醇和赖氨酸或 其盐的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和赖氨 酸或其盐的混合物，以及蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合 物，海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物，其涉及成分蔗糖，左旋糖酐，乳糖，聚乙二醇4000，甘 露醇，甘氨酸或其盐和赖氨酸或其盐，在酶冻干溶液中的浓度为1 %，又如蔗糖和甘氨酸或 其盐的混合物，右旋糖酐和甘氨酸的混合物，海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物，所涉及的蔗 糖、甘氨酸或其盐、右旋糖酐和海藻糖在酶冻干溶液中的浓度为〇 .2%，0.5%，1%，2.5%， 5%〇
[0052] 在某些实施方式中，在赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂中，在赖氨酰肽链内 切酶冻干及贮存保护溶液中，所述的冻干及贮存保护剂和冻干及贮存保护溶液的pH为4~ 10,例如5~10,6~10,7~10,8~10,9~10,5~9,5~8,5~7,5~6,6~8,6~7,6~8,6~9， 7~8，7~9，8~9，其优选地，pH为5~10。具体实施时，通过在赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存 保护剂中或在赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护溶液中添加 pH缓冲液以调节其pH，例如pH 为5-8的roS缓冲液，pH为7-9的巴比妥钠-盐酸缓冲液，pH为4-5的乙酸-乙酸钠缓冲液，pH为 7-10的Tris-Hcl缓冲液和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
[0053] 实施例中，采用的赖氨酰肽链内切酶的酶切反应体系如下，
[0054] 在1.5ml EP管加入20μ1十肽底物，再加入60μ1 0.1mol/L的pH9.5Tris缓冲液，震 荡10s，30°C水浴孵育5min，然后加入4μ1待测酶液，于30°C水浴反应20min后立即加入16μ1 10 % TFA进行终止，然后进行HPLC分析。
[0055] 十肽底物:N-Tyr-Tyr-Ala-Lys-Tyr-Phe-Gly-Arg-Phe-Phe-C。
[0056] 十肽底物和酶切产物液相分析如图1所示。
[0057]十肽底物峰保留时间为14.3min，酶切底物后，产物1保留时间分别是6.8min，产物 21保留时间是3.3min。试验中以单位时间内产物1的产生量来评价酶活。该产物的量可以通 过产物1峰面积进行计算。
[0058] 具体实施时，赖氨酰肽链内切酶的终浓度为(W/V)为0.0001 %~0.02%。
[0059] 实施例1
[0060]蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其盐保护剂分别配制为20%的浓度，并在_20°C保存备用。 本实施例采用3种缓冲液浓度，分别为5/20/50mmol/L的PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液，每一 种浓度都包含7个pH值，PH4/5/6/7/8/9/HLPH值为4/5/6/7时用roS缓冲液调节，pH值为8/ 9/10时用Tris-HCl缓冲液调节。取84x3只西林瓶，每只西林瓶按表格加 100μΙ的对应保护 剂，100μΙ的赖氨酰肽链内切酶溶液，1800μ1对应缓冲液，不加保护剂的为对照组，对照组即 每瓶添加 100μΙ的赖氨酰肽链内切酶溶液，1900μ1对应缓冲液，然后摇匀，冻干。冻干后，取 出用2ml超纯水溶解，按上述酶切反应体系进行反应，然后用液相分析结果。结果处理时，取 冻干前酶活检测为100%。单个保护剂结果如表1所示：
[0061]
[0062] 表 1
[0063] 结果由表1所示，参照表1可知：
[0064] 1)在添加保护剂蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的冻干溶液及未添加保护的赖氨酰 肽链内切酶冻干溶液，未添加保护剂的冻干酶在pH 4-5下酶活约为冻干酶活的30%，在 PH6-10下，酶活约为冻干酶活的50-70%;在添加保护剂蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐，冻干 后的酶活约为冻干酶活的50-90%。
[0065] 2)通过比对蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐作为保护剂的冻干酶活，蔗糖的冻干保 护效果最优，甘氨酸次之，甘露醇再次。
[0066] 3)通过比对蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐作为保护剂的冻干后形态相比，甘氨酸 或其盐的冻干后的形态最优，甘露醇次之，蔗糖再次。
[0067] 4)其中，pH 5或10下，冻干酶活较优。
[0068] 实施例2
[0069]在实施例1基础上，增加了右旋糖酐，乳糖，聚乙二醇4000，赖氨酸或其盐这几种保 护剂。每种保护剂依然配制为20%浓度，_20°C保存备用。复合保护剂添加方式如上述表格， 根据实施例1结果，缓冲体系优选pH5，50mmo 1/LPBS和pHl 0，50mmo 1/LTr i s-HCl。取26x3只西 林瓶，每只西林瓶按表格各加 100μΙ的对应保护剂，100μΙ的赖氨酰肽链内切酶溶液，Ι600μ1 对应缓冲液，不加保护剂的为对照组，对照组即每瓶添加1〇〇μ1的赖氨酰肽链内切酶溶液， 1900μ1对应缓冲液，然后摇匀，冻干。冻干后，取出用2ml超纯水溶解，按上述酶切反应体系 进行反应，然后用液相分析结果。结果处理时，取冻干前酶活检测为100%。复合保护剂结果 如表2所示：
[0071] 表2
[0072] 结合由表2所示，可知，
[0073] 1)在保护剂存在的条件下，赖氨酰肽链内切酶的冻干后的酶活，添加保护剂的冻 干保持在80%~110%，明显优于未添加保护剂的冻干酶活。
[0074] 2)在如上的三种成分混合物的保护剂中，乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其盐及其盐 的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐及其语言的混合物的冻干后酶活较优。 [0075] 3)在如上三种成分混合物的保护剂中，添加有聚乙二醇4000的混合物的酶活优于 添加有甘露醇的混合物;针对酶冻干形态相比，含有聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的结果 较优;同时，在pH为10的条件下，酶活结果优于pH为5的混合物。
[0076] 实施例3
[0077]在实施例2基础上，增加了海藻糖这一保护剂，配制为20 %浓度，-20 °C保存备用。 本实验探索蔗糖、右旋糖酐、海藻糖和甘氨酸或其盐终浓度为0.2%，0.5,1 %，2.5%和5% 五个浓度的复合保护剂对酶活影响。保护剂添加按照上述表格，根据实施例1和2结果，本次 实验缓冲液用pH10,50mmol/L Tris-Hcl缓冲液。取76x3只西林瓶，每只西林瓶按表格加100 μL的赖氨酰肽链内切酶溶液，然后从〇. 2 %蔗糖、0.2 %甘氨酸或其盐开始编号1，0.5 %蔗 糖、0.2%甘氨酸或其盐编号6,依次到5%海藻糖、5%甘氨酸或其盐编号75。0.2%的保护剂 需向冻干体系中加20yL，0.5 %的保护剂需向冻干体系中加50yL，1 %的保护剂需向冻干体 系中加 l〇〇yL，2.5 %的保护剂需向冻干体系中加250μ1，5 %的保护剂需向冻干体系中加500 yL，其余用缓冲液补充。不加保护剂的为对照组76号，对照组即每瓶添加 100μΙ的赖氨酰肽 链内切酶溶液，1900μ1对应缓冲液，然后摇匀，冻干。冻干后，取出用2ml超纯水溶解，按上述 酶切反应体系进行反应，然后用液相分析结果。结果处理时，取冻干前酶活检测为100%。复 合保护剂结果如表3所示：
[0079] 表 3
[0080] 在本实施例中，采用两种组分混合物作为保护剂，即蔗糖和甘氨酸或其盐的混合 物，右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物，海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物，表3显示，不同浓 度保护剂成分对冻干酶活具有不同程度的保护作用;其中，复合保护剂冻干形态相比，添加 1 %右旋糖酐和1 %甘氨酸或其盐作为保护剂时，酶液冻干后形态完整，无塌陷。在冻干酶活 方面，其中，甘氨酸或其盐的浓度为1 %时，冻干酶活优于其浓度为0.5%和0.2 %。蔗糖和右 旋糖酐浓度为〇. 5 %时，冻干酶活较优。海藻糖浓度为1 %时，冻干酶活优于浓度为0.5 %和 0.2%的酶活。在各保护剂浓度为2.5%和1%，其酶活活性接近(结果相关不大），同时各保 护剂浓度为5 %时，其酶活的活性接近浓度为2.5%的活性，但浓度为5%的酶活活性较差。 其中，浓度(冻干溶液)为〇. 5%的蔗糖和浓度(冻干溶液)为1 %的甘氨酸或其盐的混合物的 冻干酶活较优，浓度(冻干浓度)为〇. 5 %的右旋糖酐和浓度(冻干浓度)为0.5 %的含有甘氨 酸成分的混合物的冻干酶活较优。
[0081 ] 实施例4
[0082]除考察这些保护剂对冻干过程中酶的稳定性的影响外，还研究了这些保护剂对于 提高溶液贮存状态下酶的稳定性的效果。配制20%蔗糖和20%的甘氨酸，_20°C保存备用。 配制PH5-7的PBS和pH8-10的Tris-HCl缓冲液，缓冲液浓度均为50mmol/L。取12x3只西林瓶， 每只西林瓶加 100μΙ的赖氨酰肽链内切酶溶液，100μΙ蔗糖，100μΙ甘氨酸，1700μ1对应缓冲 液。不加保护剂的为对照组，对照组即每瓶添加1〇〇μ1的赖氨酰肽链内切酶溶液，1900μ1对 应缓冲液。保存于4°C，并分别于第0(1、7(1、14(1、21(1、28(1取出进行酶活分析。按上述酶切反应 体系进行反应，然后用液相分析结果。结果处理时，取第〇d的酶活为100%，酶溶液稳定性数 据结果如表4所示：
[0085] 表 4
[0086] 在本实施例提供赖氨酰肽链内切酶的贮存溶液，采用蔗糖和甘氨酸或其盐组成的 混合物，其蔗糖和甘氨酸或其盐在酶贮存溶液中的浓度为1%，其中加有保护剂的酶的保存 效果优于未添加保护剂的效果，保护剂在pH为5-10的范围下具有较好的保存效果。
[0087] 本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域 技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发 明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明 的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案 的保护范围。
【主权项】
1. 赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述保护剂的成分包括蔗糖，海 藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其盐和赖氨酸或其盐的一种，两种 或多种混合物;所述保护剂的各成分在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇. 2%~5%。2. 如权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的保护 剂的pH为4~10。3. 如权利要求1或2所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的 保护剂还包括PBS缓冲液、Tri s-Hc 1缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液和 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。4. 如权利要求1-3任一项所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所 述的保护剂选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其盐的一种。5. 如权利要求4所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的保护 剂pH为5或10。6. 如权利要求1或2所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的 保护剂选择如下混合物， 蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物； 蔗糖、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物； 蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物； 蔗糖、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐的混合物； 右旋糖酐、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物； 右旋糖酐、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物； 右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物； 右旋糖酐、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐的混合物； 乳糖、甘露醇和甘氨酸或其盐的混合物； 乳糖、甘露醇和赖氨酸或其盐的混合物； 乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其盐的混合物； 乳糖、聚乙二醇4000和赖氨酸或其盐的混合物； 蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物； 右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物； 海藻糖和甘氨酸或其盐的混合物。7. 如权利要求6所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的混合 物的成分在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为1 %。8. 如权利要求6或7所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的 保护剂选自如下优选地的混合物， 乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其盐的混合物； 蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其盐的混合物； 蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物； 右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物。9. 如权利要求6或7所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的 保护剂pH为5-10。10. 如权利要求6所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述的混 合物，由两种成分组成的混合物中的成分在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为0.2%， 0.5%，1%，2.5%和5%〇11. 如权利要求8所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，其特征在于，所述蔗糖 和甘氨酸或其盐的混合物，蔗糖在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇. 5%，甘氨酸或其 盐在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为1 % ;所述右旋糖酐和甘氨酸或其盐的混合物，右 旋糖酐在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为0.5%，甘氨酸或其盐在酶冻干溶液中的质 量体积百分浓度为0.5%。12. -种赖氨酰肽链内切酶的冻干剂，其特征在于，包括如下组分： 权利要求1-11任一项所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，所述保护剂成分在 酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇.2%~5% ; 和赖氨酰肽链内切酶，所述的赖氨酰肽链内切在酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为 0.0001%-0.02%。13. 如权利要求12所述的一种赖氨酰肽链内切酶的冻干剂，其特征在于，所述的冻干剂 的pH为4~10。14. 一种赖氨酰肽链内切酶的贮存溶液，其特征在于，包括如下组分： 权利要求1-11任一项所述的赖氨酰肽链内切酶冻干及贮存保护剂，所述保护剂成分在 酶冻干溶液中的质量体积百分浓度为〇.2%~5% ; 和赖氨酰肽链内切酶，所述的赖氨酰肽链内切酶在酶贮存溶液中的质量体积百分浓度 为 0·0001%-0·02%。15. 如权利要求14所述的一种赖氨酰肽链内切酶的贮存溶液，其特征在于，所述的保护 剂选用蔗糖和甘氨酸或其盐的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其盐在酶贮存溶液中的质量体 积百分浓度为1 %。
【文档编号】C12N9/52GK105985942SQ201610269634
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】吴勇, 徐帆, 徐一帆, 李亚茹
【申请人】上海多米瑞生物技术有限公司, 上海医药工业研究院