控制水稻粒型、外观品质和产量的基因gw7及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种控制水稻谷粒长和谷粒宽的基因GW7(SEQ ID NOs：1-4)及其应用。GW7可以控制水稻的谷粒长、谷粒宽和长宽比，提高水稻的稻米品质。GW7与gs3聚合后可以显著提高稻米产量，同时改良稻米品质。本发明还公开了利用GW7基因培育产量提高的作物的方法和培育具有提高的米质和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法。GW7基因在水稻等作物的高产优质育种中具有广泛的应用前景。
【专利说明】
控制水稻粒型、外观品质和产量的基因 GW7及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物学和生物技术领域。具体地，本发明涉及一种控制水稻粒型和外 观品质的基因 GW7及其应用。本发明还涉及由该基因编码的多肽和该基因的启动子序列。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我国第一大粮食作物，也是世界上主要粮食作物之一， 全球近一半的人口以稻米为主食。近年来水稻种植面积持续下降，为解决粮食不足的问题， 提高水稻单位面积产量就成为提高粮食总产量的最为重要的途径。水稻半矮化育种和杂种 优势利用极大地提高了水稻的产量，为保障我国的粮食安全做出了巨大的贡献。但长期以 来，为了解决庞大人口的吃饭问题，我国的水稻育种一直以高产作为主要目标而忽视了品 质改良，导致目前我国水稻品种普遍存在高产而不优质的现状。随着人们生活水平的提高 和稻米市场开放，稻米作为商品进行交易，人们对稻谷外观和蒸煮食味等品质的要求也日 益提高，改良稻米品质的任务显得越来越迫切，选育优质高产的水稻新品种已成为我国水 稻育种的重要方向。
[0003] 水稻粒型（粒长、粒宽和长宽比）直接与稻米产量与品质相关。水稻粒型性状的研 究对提高稻米产量及品质的水稻育种具有非常重大的现实意义和理论价值。水稻谷粒形状 是典型的数量性状，受多基因调控，遗传基础复杂。通过遗传杂交和分子标记技术对控制数 量性状的QTL进行分解和定位克隆是研究粒形基因的有效手段。近年来，已通过该技术克 隆了多个控制水稻粒形的基因，例如，控制水稻粒宽基因 GW2 (Song等，2007)，GW5 (Shomura 等，2008 ;Weng 等，2008)，GS5 (Li 等，2011)和 GW8 (Wang 等，2012)，以及控制粒长的基因 gs3 (Fan等，2006 ;Mao等，2010)。这些粒型基因的克隆与功能分析为基于改良粒型，提高稻 米产量与品质的分子设计育种打下了材料基础。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及一种控制水稻产量和品质的基因及其应用。本发明的目的在于提供一 种从水稻中分离克隆控制水稻粒型（谷粒宽和谷粒长）和品质的重要功能基因及其应用。 在本发明中将这种控制水稻粒型和品质的基因称为GW7。
[0005] 在本发明的第一方面中，通过利用杂交稻育种中优质的不育系材料泰丰A和华粳 籼74构建分离群体，将GW7基因精细定位到水稻第7号染色体长臂端2. 6Kb的物理范围内， 并构建了华粳籼74背景下的近等基因系材料NIL-GW7。
[0006] 本发明的第二方面涉及控制水稻粒型和品质的基因 GW7,其为一种分离的多核苷 酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：
[0007] (l)SEQ ID NOs :1-4中的任何一个所示的核苷酸序列；
[0008] (2)与（1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂 交的核苷酸序列；
[0009] (3)与（1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是 至少95 %或98 %或99 %同一性的核苷酸序列；
[0010] (4)与⑴的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性 而在序列上不同的核苷酸序列；
[0011] (5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs :7、8中任何一个所示的 氨基酸序列，或者，由于一或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个） 氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs :7、8中任何一个所示的氨基酸序列不 同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs :7、8中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、 优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95 %或98 %同一性的氨基酸序列；
[0012] (6) (1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
[0013] (7)与（1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0014] 其中，gw7和GW7的cDNA序列如SEQ ID NOs :1-4所示，其相关启动子的核苷酸序 列由SEQ ID N0s:5-6所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0s:7-8所示。具体参见 下表1。
[0015] 表1. SEQ ID NOs :1-8的序列名称及其来源
[0016]
[0017] 优选地，本发明涉及的控制水稻谷粒宽、谷粒长和稻米外观品质的基因 GW7如SEQ ID N0 :2 所示。
[0018] 本发明还涉及GW7的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序 列：
[0019] (1) SEQ ID NOs :5和6所示的核苷酸序列；
[0020] (2)与（1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂 交的核苷酸序列；
[0021] (3)与（1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是 至少95 %或98%同一性的核苷酸序列；
[0022] (4) (1)-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
[0023] (5)与⑴-⑷任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0024] 本发明还涉及包含所述启动子序列的构建体，以及包含所述构建体的细胞，其中 所述细胞为植物细胞，优选水稻细胞。
[0025] 本发明的第三方面涉及分离的多肽（也称蛋白质），其由本发明所述的GW7基因编 码，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：
[0026] (l)SEQ ID NOs :7、8中任何一个所示的氨基酸序列，
[0027] (2)由于一或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个）氨基 酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs :9、10、11中任何一个所示的氨基酸序列不 同的氨基酸序列，
[0028] (3)与SEQ ID NOs :7、8中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少 80 %、更优选至少90 %、尤其是至少95 %或98 %或99 %同一性的氨基酸序列，
[0029] (4)⑴或⑵或⑶所述氨基酸序列的活性片段，
[0030] (5)由本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
[0031] 其中，GW7蛋白序列及其变体蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NOs :7、8所示，具体参 见表1。
[0032] 本发明的第四方面涉及一种重组构建体，其含有本发明所述的控制水稻粒型和品 质的基因 GW7的多核苷酸序列。其中所述构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述 多核苷酸的表达载体。
[0033] 本发明的第五方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明所述的重组构建体，或 在其基因组中整合有本发明所述的控制水稻粒型和品质的基因 GW7的多核苷酸序列。所述 宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，优选植物 细胞，最优选水稻细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。
[0034] 本发明的第六方面涉及本发明的多核苷酸（即，控制水稻粒型和品质的基因 GW7) 或多肽或本发明的重组构建体或本发明的重组宿主细胞在改良作物植物性状（例如，提高 作物产量）中的用途。
[0035] 本发明还涉及改良作物植物性状（例如，提高作物产量）的方法，该方法包括制备 含有本发明的控制水稻粒型和品质的基因 GW7的多核苷酸序列或本发明的构建体的作物 植物，例如，所述方法可以包括：从含有本发明的控制水稻粒型和品质的基因 GW7及其等位 变异的重组植物细胞再生转基因植物或者将含有本发明所述的控制水稻粒型和品质的基 因 GW7及其等位变异的植株与另一植株杂交，或者利用包含GW7的重组农杆菌细胞转染作 物植物获得转基因作物植株。所述性状包括但不限于：粒宽、粒长、长宽比、灌浆速率、产量 和品质等。其中所述植株优选是粒型改变，长宽比增加，千粒重无明显改变但籽粒品质提高 的植株，其中所述作物植物优选是农作物，例如水稻。
[0036] 在本发明的第七方面中，本发明提供所述GW7编码基因的用途，其用于控制作物 籽粒的粒型（更优选地，通过控制粒宽、改变长宽比而改良作物的外观品质）；调控但不仅 限于细胞分裂速度与方向；作为鉴定作物细长粒品种和优质品种的分子标记。
[0037] 本发明的第八方面涉及一种改良作物的方法。该方法包括：利用包含GW7的重组 农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株，或是适量调节作物植株中GW7基因的表达 水平，或是适量改变GW7蛋白生物学活性，或者将含有本发明的粒型基因的植株与另一植 株杂交；其中所述植株优选是籽粒长宽比改变，粒长增加，品质提升的植株，其中所述作物 植物优选是农作物，例如水稻。
[0038] 在本发明更优选的实施方案中，根据更详细的实验验证，本发明人发现可以利用 GW7基因及其等位变异通过以下三种方式进行培育具有提高的米质和产量的水稻品种的育 种实验：
[0039] (1)通过与其他粒形基因杂交聚合改良水稻的籽粒形状及品质；
[0040] (2)提高水稻中GW7基因的表达水平；或
[0041] (3)提高作物中GW7基因所编码的蛋白质的含量。
[0042] 其中⑴中所提及的其他粒型基因包括，但不限于，gs3基因。由此，本发明提供 培育具有提高的米质和产量的水稻品种的育种方法，所述方法包括：利用包含GW7基因的 重组宿主细胞（例如，农杆菌细胞）转染水稻植株获得含有GW7基因的转基因水稻植株。
[0043] 所述培育具有提高的米质和产量的水稻品种的方法也可以这样进行：利用包含 GW7基因及其等位变异的水稻植株与另一水稻植株杂交，获得包含GW7基因的杂交水稻植 株。其中所述另一水稻植株可以包含gs3基因。
[0044] 在优选的实施方案中，本发明提供一种培育具有提高的米质和产量的水稻品种的 分子标记辅助选择聚合育种方法，所述方法包括：使用包含GW7基因及其等位变异的水稻 亲本与包含gs3基因的水稻亲本杂交，在后代中选育出GW7-gs3双基因聚合的品系或品种。
[0045] 综上所述，本发明提供下述实施方案：
[0046] 1. 一种分离、克隆的控制水稻谷粒宽、谷粒长和稻米外观品质的基因 GW7,其为一 种分离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：
[0047] (l)SEQ ID NOs :1_4中的任何一个所示的核苷酸序列；
[0048] (2)与（1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂 交的核苷酸序列；
[0049] (3)与（1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是 至少95 %或98%同一性的核苷酸序列；
[0050] (4)与⑴的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性 而在序列上不同的核苷酸序列；
[0051] (5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示 的氨基酸序列，或者，由于一或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3 个）氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸 序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列具有至 少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95 %或98 %同一性的氨基酸序列；
[0052] (6) (1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
[0053] (7)与（1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0054] 2. -种分离的蛋白质，其由第1项的控制水稻谷粒宽、谷粒长和稻米外观品质的 基因 GW7编码，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：
[0055] (1) SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列，
[0056] (2)由于一或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个）氨基 酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs :9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同 的氨基酸序列，
[0057] (3)与SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少 80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列，
[0058] (4)⑴或⑵或⑶所述氨基酸序列的活性片段，
[0059] (5)由权利要求1的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
[0060] 3.如第2项所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质具有TRM保守结构域。
[0061] 4. -种重组构建体，其特征在于包含第1项的基因 GW7的多核苷酸序列，所述构建 体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。
[0062] 5. -种重组宿主细胞，其特征在于包含第1项的基因 GW7的多核苷酸序列或第4 项的重组构建体，或它的基因组中整合有第1项的基因 GW7的多核苷酸序列，其中所述细胞 选自植物细胞或者微生物细胞，其中所述微生物细胞优选为大肠杆菌或农杆菌细胞。
[0063] 6.第5项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为水稻细胞。
[0064] 7.培育产量提高的作物的方法，该方法包括：利用包含第1项所述的基因 GW7的 重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株，或者将含有第1项所述的控制水稻粒 形和稻米品质的基因 GW7的作物植株与另一作物植株杂交，其中所述植株优选是粒形改 变，长宽比增大，品质得到改良的植株，其中所述作物优选是农作物，例如水稻。
[0065] 8.控制水稻谷粒长和谷粒宽的基因 GW7的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序 列中选择的核苷酸序列：
[0066] (1) SEQ ID NOs :5和6所示的核苷酸序列；
[0067] (2)与（1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂 交的核苷酸序列；
[0068] (3)与（1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是 至少95 %或98%同一性的核苷酸序列；
[0069] (4) (1)-⑶任何一个的核苷酸序列的活性片段；或
[0070] (5)与⑴-⑷任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0071] 9.包含第8项的启动子序列的构建体。
[0072] 10. -种培育具有提高的米质和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方 法，所述方法包括：使用包含第1项所述的基因 GW7及其等位变异的水稻亲本与包含gs3基 因的水稻亲本杂交，在后代中选育出GW7_gs3双基因聚合的品系或品种。
[0073] 以下是对本发明中所用的一些术语的定义。除非另外指明，本发明所用的术语具 有本领域普通技术人员已知的意思。
[0074] "相关"/ "可操作地连接"指两个物理或功能相关的核酸序列。例如，如果启动子 或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列 将影响编码或结构DNA序列的表达水平，那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白 质的DNA序列"相关"。
[0075] "嵌合基因"是重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA 或作为蛋白质表达的核酸序列，或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关，使得调 节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中 所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。
[0076] "编码序列"是转录为RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有义RNA或反义RNA的核酸 序列。优选地，随后在生物体中翻译RNA以产生蛋白质。
[0077] 在本发明上下文中，"对应于"意指当不同GW7基因或蛋白质的核酸编码序列或氨 基酸序列互相比对时，"对应于" 一些计数位置的核酸或氨基酸是与这些位置比对，但不必 是在相对于特定GW7各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨 基酸。同样，当特定GW7的编码或氨基酸序列与参照GW7的编码或氨基酸序列比对时，"对 应于"参照GW7序列一些计数位置的该特定GW7序列中核酸或氨基酸是与参照GW7序列的 这些位置比对，但不必是在该特定GW7蛋白质各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确 数字位置中的核酸或氨基酸。
[0078] 这里所用的"表达盒"意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序 列，包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子，所述目的核苷酸序列可操作地连接终 止信号。通常，它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒 可以是嵌合的，意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可 以是天然存在的，但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而，通常，表达盒相对于宿 主是异源的，即，表达盒的特定核酸序列非天然出现在宿主细胞中，必须通过转化事件将其 引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导 型启动子控制，其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时，所述诱导型启动子才起始 转录。如果是多细胞生物体的情况，如植物，启动子也可以是对特定组织，或器官或发育阶 段特异的。
[0079] "基因"是位于基因组内的限定区域，除了前述编码核酸序列外，包含其它主要是 调节性的核酸序列，所述调节性核酸序列负责编码部分的表达，即转录和翻译控制。基因也 可以包含其它5'和3'非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是，例如内含子。
[0080] "异源"核酸序列是与其被引入的宿主细胞非天然相关的核酸序列，包含非天然存 在的天然存在核酸序列的多拷贝。
[0081] "同源"核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关的核酸序列。
[0082] "同源重组"是同源核酸分子间核酸片段的相互交换。
[0083] 当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有相同氨基酸序列的多肽时，该核酸 序列与参照核酸序列是"同类编码"。
[0084] "分离的"核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在，因此不是 天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在，或者可以 存在于非天然环境如，例如重组宿主细胞或转基因植物中。
[0085] "天然基因"指在未转化细胞的基因组中存在的基因。
[0086] 术语"天然存在"用于描述可以在自然界中发现的客体，其与人工产生的客体不 同。例如，可以从自然来源分离，并没有在实验室有意进行人工修饰的、生物体（包括病毒） 中存在的蛋白质或核苷酸序列是"天然存在"的。
[0087] "核酸分子"或"核酸序列"是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性 片段。在本发明上下文中，优选地，核酸分子是DNA片段。"核酸分子"也称多核苷酸分子。
[0088] "植物"是在任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
[0089] "植物细胞"是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以 是分离的单个细胞或培养细胞形式，或作为高等有组织的单位如，例如植物组织，植物器官 或整个植物的一部分。
[0090] "植物细胞培养物"意指各种发育阶段的植物单位如，例如原生质体，细胞培养细 胞，植物组织中的细胞，花粉，花粉管，胚珠，胚囊，合子和胚的培养物。
[0091] "植物材料"指叶，茎，根，花或花的部分，果实，花粉，卵细胞，合子，种子，插条，细 胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。
[0092] "植物器官"是植物清楚的和明显结构化和分化的部分，如根，茎，叶，花蕾或胚。
[0093] 这里所用的"植物组织"意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物 中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物，植物器官，植物种子，组织 培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包 含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。
[0094] "启动子"是编码区域上游非翻译的DNA序列，其包含RNA聚合酶II的结合位点， 并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。
[0095] "原生质体"是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。
[0096] "调节元件"指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的 核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。
[0097] "改组的"核酸是通过改组方法，如这里所述的任何改组方法产生的核酸。通过人 工的和可选地循环的方式（物理地或实际上）重组两个或多个核酸（或字符串）产生改组 核酸。一般地，在改组方法中利用一步或多步筛选步骤以鉴定目的核酸；可以在任何重组步 骤前或后进行该筛选步骤。在一些（但不是所有）改组实施方式中，期望在筛选前进行多 轮重组以增加待筛选库的多样性。可选地，可以循环重复重组和筛选的全部过程。根据上 下文，改组可以指重组和筛选的全部过程，或可替代地，可以仅指全部过程的重组部分。
[0098] 在两个核酸或蛋白质序列比对中的短语"基本相同"指当比较和比对以获得最大 对应时，如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的，具有至少60 %，优选80 %，更优选 90 %，甚至更优选95 %和最优选至少99 %核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列 或亚序列。优选地，基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域，更优选至少约100 个残基的区域上，最优选地，在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式 中，在编码区整个长度中序列基本相同。而且，基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同 的功能。
[0099] 为了进行序列比较，通常，一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列 比较算法时，将检测和参照序列输入到计算机中，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定 序列算法程序的参数。然后，根据选定的程序参数，序列比较算法将计算出检测序列相对于 参照序列的百分序列同一性。
[0100] 例如，通过 Smith&Waterman，Adv. Appl. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性 算法，通过Needleman&Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)的同源性比对算法，通过 Pearson&Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci.USA85 :2444(1988)的相似性检索方法，通过这 些算法的计算机化实施（Wisconsin Genetics软件包中GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA， Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或通过目测（通常参见，Ausubel 等，下文）可以进行用于比较的序列的最佳比对。
[0101] 适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法，在 Altschul等，J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中 心（http ://www. Ncbi. nlm. nih. gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括：通 过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对（HSPs)，所述短字在与数 据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值 (Altschul等，1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长 的HSPs。然后，这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸，直到积累比对分值不 再增加。对于核苷酸序列，用参数M(成对匹配残基的奖励分值；总是大于零）和N(错配残 基的罚分值；总是小于零）计算积累分值。对于氨基酸序列，用记分矩阵计算积累分值。当 积累比对分值从获得的最大值回落数量X，由于一个或更多负分值残基比对积累，积累分值 达到或低于零，或两个序列的任一个到达终点时，每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法 的参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序（对于核苷酸序列）使用字长 值（W) 11，期望值（E) 10,截断值100，M = 5，N = -4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸 序列，BLASTP程序使用字长值（W) 3,期望值（E) 10和BL0SUM62记分矩阵为缺省值（参见， Henikoff&Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ： 10915 (1989))〇
[0102] 除了计算百分序列同一性外，BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析 (参见，例如 Karlin&Altschul，Proc. Nat ' 1. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一个相似性测定是最小和概率（P (N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶 然出现匹配的概率的指示。例如，如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少 于约0. 1，更优选少于约0. 01，最优选少于约0. 001，那么认为检测核酸序列与参照序列相 似。
[0103] 两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语 "特异性杂交"指当该序列存在于复杂混合物（例如，总细胞的）DNA或RNA中时，在严格条 件下，分子仅与特定核苷酸序列结合，形成双螺旋或杂交。"基本结合"指探针核酸和靶核酸 间互补杂交，并且包含较少的错配，通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配，以实现 靶核酸序列的期望检测。
[0104] 在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中"严格杂交条件"和 "严格杂交漂洗条件"是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列 在较高温度特异性杂交。在 Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes，第 I 部分第 2 章 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier，New York中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地，对于在限 定离子强度和pH下的特定序列，高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点（TJ约5°C。 典型地，在"严格条件"下，探针将与其靶亚序列杂交，而不与其它序列杂交。
[0105] 1"是（在限定离子强度和pH条件下）50%靶序列与完全匹配的探针杂交时的温 度。对于特定的探针，非常严格的条件选择为等于T m。在Southern或Northern印迹中在 滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42°C，具有 lmg肝素的50%甲酰胺，过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72°C，0. 15M NaCl约 15分钟。严格漂洗条件的例子是在65°C，0. 2x SSC漂洗15分钟（参见，Sambrook，下文， SSC缓冲液的描述）。通常，在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对 于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，中严格性漂洗的例子是45°C，lx SSC漂洗15分钟。 对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言，低严格性漂洗的例子是40°c，4-6x SSC漂洗15 分钟。对于短探针（例如，约10到50个核苷酸），严格条件通常包括在pH7. 0到8. 3的少 于约1. 0M Na离子的盐浓度，通常约0. 01到1. 0M Na离子浓度（或其它盐），通常温度至 少是约30°C。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地，在特定杂交测定 中，信噪音比就无关探针所观察到的值高2X(或更高）表明特异杂交的检测。在严格条件 下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的，那么它们仍是基本相同的。例 如，当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时，就会出现这种情况。
[0106] 下面是杂交/漂洗条件设置的例子，所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷 酸序列基本相同的同源核苷酸序列：参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50°C，7% 十二烷基硫酸钠（SDS)，0. 5M NaP04, ImM EDTA 中杂交，在 50°C，2X SSC，0. 1% SDS 中漂洗， 更期望在 50°C，7%十二烷基硫酸钠（SDS)，0. 5M NaP04，lmM EDTA 中杂交，在 50°C，1X SSC， 0. 1% SDS中漂洗，更期望在50°C，7%十二烷基硫酸钠（SDS)，0. 5M NaP04, ImM EDTA中杂 交，在50°C，0. 5X SSC，0. 1% SDS中漂洗，优选地，在50°C，7%十二烷基硫酸钠（SDS)，0. 5M NaP04，lmM EDTA 中杂交，在 50°C，0.1X 35(：，0.1%503中漂洗，更优选地，在50°(：，7%十二 烷基硫酸钠（SDS)，0· 5M NaP04, ImM EDTA 中杂交，在 65°C，0.1 X SSC，0. 1% SDS 中漂洗。
[0107] 两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标是第一核酸编码的蛋白质与第二 核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或特异结合。因此，蛋白质通常与第二蛋白质基本相同，例 如，其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而不同。
[0108] "合成的"指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如，称更密切地 类似双子叶和/或单子叶植物基因 G+C含量和正常密码子分布的人工序列是合成的。
[0109] "转化"是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程，特别地，"转化"意指DNA 分子稳定整合进入目的生物体基因组中。
[0110] "转化的/转基因的/重组的"指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或 植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存 在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞，组织，或植物理解为不仅包含转化 过程的最终产物，也包含其转基因子代。"非转化的"，"非转基因的"，或"非重组的"宿主指 不含有异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。
[0111] 本文所用的术语"多核苷酸"、"多核苷酸分子"、"多核苷酸序列"、"编码序列"、 "开放阅读框（0RF) "等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列， cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义 和相应的反义链。生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域 技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术（参见Maniatis等，1989,分子克降，实验宰 壬册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；AUSUbel等，1989,分子牛物学当前抟术,Greene Publishing Associates&ffiley Interscience, NY :Sambrook等，1989,分子克降，实骑室手 显，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等（编），1995, PCR策略,Academic Press, Inc. , San Diego :和 Erlich (编），1992, PCR 技术，牛津大学出版社，New York)完 成。
【附图说明】
[0112] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0113] 图1显示利用泰丰A和珍汕97B构建的F2群体分析粒形QTL : (a)，粒宽QTL ; (b)， 粒长QTL。
[0114] 图2显示近等基因系NIL-GW7和NIL-gw7的表型比较。（a)，近等基因系材料的 株型比较；(b)，株高的比较；（c)，抽穗期的比较；(d)，分蘖数的比较；（e)，穗粒数的比较； (f)，谷粒宽的比较；（g)，谷粒长的比较；(h)，谷粒长宽比的比较；（i)，灌浆速率的比较； (j)，千粒重的比较；(k)，单株产量的比较。
[0115] 图3显示遗传互补验证GW7功能的结果。（a)，GW7-RNAi转基因阳性植株显著增 加粒宽，降低粒长；(b)，GW7过量表达转基因阳性植株显著增加粒长，降低粒宽。
[0116] 图 4 显示 GW7 与 OsTONlb 和 0sT0N2 的互作情况。（a)，GW7 与 0sT0N2 互作；（b)， GW7 与 OsTONlb 互作；（c)，0sT0N2 与 OsTONlb 互作，作为阳性对照；（d)，GW7 与 0sSPL16 不 互作，作为阴性对照。以上显示了 GW7作为水稻中TRM家族成员之一，可能参与了细胞分裂 及分裂方向调节等生物学事件中。
【具体实施方式】
[0117] 本发明人通过深入研究，确定了一个能够改变水稻粒型，改良水稻品质，但并不降 低水稻穗粒数和千粒重的粒型基因，该基因位于水稻第7号染色体长臂端。该基因的启动 子序列可以与GW8/0sSPL16蛋白结合，该基因表达量提尚可以促进水稻轩粒粒长增加，粒 宽降低，进而改善稻米的外观品质。本发明人将该控制水稻粒型但不改变千粒重和穗粒数 的基因命名为GW7。
[0118] 植物转化
[0119] 在特别优选实施方式中，在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的控制粒 宽和粒重的蛋白。可将本发明的控制粒宽和粒重的基因的核苷酸序列插入到表达盒中，然 后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中，将所述控 制粒宽和粒重的基因的核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。按照本发明转化的植 物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆， 菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜， 南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温椁，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓， 菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番前，高粱，甘鹿，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟 草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特 别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。
[0120] 一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或 用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
[0121] 优选地，在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列，由此在转基因植物中引起相 应粒宽蛋白的生物合成。以这种方式，可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因 植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有 特定的密码子使用偏爱性，这是本领域已知的，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的 氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35%，优选多于约45%， 更优选多于50 %，最优选多于约60 % GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平 的表达。尽管可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列，但可 以修饰序列以适应单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和GC含量偏好，因为这些 偏好已被证明是不同的（Murray等，Nucl. Acids Res. 17:477-498(1989))。此外，可筛选 核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP 0 385 962 (Monsanto)，EP 0 359 472 (Lubrizol)和 WO 93/07278 (Ciba-Geigy)中所述的方法，用 本领域熟知的位点定向诱变技术，PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行 的所有改变，如上述那些改变。
[0122] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，下列实施例仅用于进一步说明 本发明，而不用来限制本发明的精神和范围。
[0123] 需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特 别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。
[0124] 实施例1 :水稻粒型主效QTL_qGW7的获得
[0125] 明恢63和珍汕97是在我国杂交水稻育种中被广泛应用的亲本材料，明恢63是目 前应用面积最大的恢复系材料，珍汕97A则是应用面积最广的不育系。以二者为亲本育成 的汕优63是我国推广面积最大的杂交稻品种，该品种在产量方面表现优异但米质不佳。泰 丰A是华南地区近年来育成的品质优良的不育系材料，其米粒长宽比、垩白度等重要外观 品质性状均达到国标一级。
[0126] 本发明人利用珍汕97B(由温州市农业科学研究所选育，由广州市天河区五山华 南农业大学生命科学院的刘耀光老师赠送）为母本与泰丰A (广东省农业科学院水稻所利 用优质稻品系米31与（博B/浙9248) F8代优良株系杂交后经8代回交转育而成的优质籼 稻不育系，由广州市天河区金颖路29号广东省农科院水稻研究所的王丰老师赠送）杂交构 建匕作图群体，通过对F 2群体的QTL分析，我们检测到了 2个控制水稻粒宽的主效QTLs (图 1，a)和3个控制水稻粒长的QTLs (图1，b)，其中在第7号染色体长臂端的qGW7可同时控 制水稻的谷粒长和谷粒宽（图1，a，b)。
[0127] 研究所用的分子标记是以PCR为基础的标记，包括SSR标记和自行设计InDel标 记。SSR标记均来自McCouch等（2001，2002)发表的微卫星标记连锁图；PSM标记是用SSR 分析工具（http ://www. gramene.org/gramene/searches/ssrtool)分析克隆序列筛选出 微卫星重复性好的SSR目标序列，再用Primerf分析软件对这些目标序列进行引物设计。从 这些引物中选择了 95对在染色体上均匀分布，且在亲本间多态性好的标记用于遗传背景 筛选（粒型QTL分析所用的引物及其序列详见表2)。
[0128] PCR程序按照Panaud等（1996)的方法稍加修改进行，具体为每管20 μ 1扩增反应 体系，包括：〇· 15μΜ SSR引物、200 μΜ dNTP、lXPCR反应缓冲液（50mM KCl，10mM Tris-HCl PH8.3，1.5mM MgCl2,0.01% 明胶）、50-100ng 模板 DNA，1U Taq 酶；反应程序为：94°CDNA 变 性5分钟、循环（94°C 1分钟，55 °C 1分钟，72 °C 1分钟）35次、72 °C再延伸5分钟。扩增出 的PCR产物用6 %聚丙烯酰胺变性凝胶进行电泳，电压调至300V，室温下电泳约3小时。电 泳完毕后，银染记录带型或凝胶成像。
[0129] 表2 :粒型QTL分析所用的引物及其序列
[0130]
[0133] 实施例2 :水稻粒型基因 GW7的获得
[0134] 本发明人利用泰丰A(广东省农业科学院水稻所利用优质稻品系米31与（博B/浙 9248)F8代优良株系杂交后经8代回交转育而成的优质籼稻不育系）和华粳籼74 (华南农 业大学农学系育成的高产稻种，广东省2000年审定品种，由广州市天河区五山华南农业大 学农学院的张桂权老师赠送）杂交，并结合连续多代回交构建了 BC3F2群体。在此基础上， 利用图位克隆技术克隆了 GW7基因，图位克隆所用的多态性标记引物序列如表3所示，多态 性标记的检测方法如实施例1所述。
[0135] 表3 :图位克隆所用的引物及其序列
[0138] 实施例3 :近等基因系材料NIL-GW7和NIL-gw7的构建
[0139] 本发明人在实施例2中所阐述的BC3F2群体中选择含有qGW7,且粒型细长的单株 继续与华粳籼74连续多代回交至BC 6F2,根据籽粒变长变窄的表型选择单株，利用分子标 记对目标区段进行跟踪检测，并对目标性状以外的区段进行背景扫描，最终获得与华粳籼 74(NIL-gw7)遗传背景十分接近的近等基因系NIL-GW7材料用于后续的研究。分子标记检 测方法同实施例1所述。
[0140] 实施例4 :GW7在保证水稻产量的同时可提升稻米品质
[0141] 本发明人在海南省陵水县实验基地试验田播种NIL-GW7和NIL-gw 7(近等基因系 NIL-GW7和NIL-gw7的构建详见实施例3的介绍），在水稻生长过程中统计抽穗期（heading date)和籽粒灌衆速率；待植株成熟后，分别统计分蘖数（the number of tillers per plant)，株高（plant height)，每糖粒数（the number of grains per panicle)，千粒重 (1,000-grain weight)等性状，具体见图 2。
[0142] 具体的统计方法：从第一个材料群体抽穗开始，每天观察记录抽穗的单株，见穗植 株达50%时，记录为抽穗期。灌浆速率的统计则从水稻开花时选取主穗中上部的小穗进行 标记，然后在开花3天后至水稻小穗完熟，按照一定的时间间隔取样烘干后再称量干重，每 次剥取30个完整的发育中的籽粒，10个一组，3个重复。穗粒数的统计：在水稻成熟后，分 别在田间取30株主分蘖上的穗，分别统计每个穗上的穗粒数直接计数并记录。
[0143] 粒长、粒宽和粒重的测量。谷粒自然干燥后，浮水冲去秕粒，37°C恒温干燥后，在室 温条件下存放3个月及以上，保证谷粒的充分干燥和各株系间含水量的相对一致。从每个 株系中随机选取形态正常的种子，以游标卡尺测量其粒宽、粒长，作为粒形的考查指标。谷 粒千粒重根据随机选取的1000粒饱满谷粒进行估算，于电子天平上进行称量其总重，取20 次的平均值即为千粒重。试验结果允许差：千粒重20g以下的不超过0. 4g，千粒重20. 1~ 50g的不超过0. 7g，千粒重50. lg以上的不超过1. 0g。
[0144] 稻米品质的分析与评价参照《中华人民共和国农业部部标准米质测定方法》（NY 147-88)进行。
[0145] 差异显著性检测的方法：1.建立虚无假设，即先认为两者没有差异；2.通过统计 运算，确定假设成立的概率P。3.根据P值大小，判断假设是否成立。我们的实验中的标 准P < 0. 05。统计表明NIL-GW7与NIL-gw7的株高、分蘖数、抽穗期、千粒重等均无显著差 异（图2, a，b，c，d，e，j和k);但二者的粒型达到极显著差异，NIL-GW7的灌浆速率略较 NIL-gw7 慢（图 2, i)。本发明人还发现 NIL-gw7 千粒重与 NIL-gw8Basmatl3S5(Wang 等，2012) 差异显著，肌1^1￥7单株产量较肌1^1￥8^1^1385高14.9%左右（图2，」和1〇。对肌1^^7 与NIL-gw7的稻米品质分析表明，NIL-GW7的米质显著优于NIL-gw7 (表5)。以上研究结果 表明NIL-gw7在保证产量的同时提高稻米品质，在水稻的高产优质育种中有广阔的应用前 景。
[0146] 表4. NIL-GW7和NIL-gw7的稻米品质比较
[0149] 实施例5 :GW7与gs3聚合育种提高米质和产量的应用
[0150] 本发明人通过将获得华粳籼74背景下的近等基因系材料NIL-GW7与NIL-gs3 (系 NIL-gs3的构建方法参照实施例3的介绍，连续回交7代获得近等基因系）杂交，并在后 代中选择NIL-GW7-gs3双聚合系材料。2014年1月在海南省陵水县实验基地试验田播种 NIL-GW7、NIL-gs3和NIL-GW7-gs3待植株成熟后，分别取单株考察穗粒数，千粒重等产量 性状并对米粒长，米粒宽等性状进行分析，测量及分析方法同实施例4所示。结果显示， NIL-GW7-gs3聚合系材料在产量与稻米外观品质方面都得到了大幅的提升。这表明在育种 实践中，可以通过将GW7与gs3聚合来协同提高稻米的品质和产量（表5)。
[0151] 表5 GW7和gs3聚合系材料产量及米质分析
[0152]
[0153] 实施例6 :控制细长粒型GW7基因的优异等位变异的分子标记设计与应用
[0154] 根据GW7基因在泰丰A和ZS97B品种间存在的核苷酸序列差异，本发明人在GW7 启动子区域设计了 2对InDel引物（SEQ ID NOs :9，10和SEQ ID NOs :11，12)，利用Taq酶 进行PCR扩增产物的大小来判定所检测的水稻品种（品系）是否携带来自泰丰A的GW7基 因的优异等位变异，该分子标记可用于分子标记辅助选择育种。例如，用Taq酶PCR扩增谷 粒长宽比大的NIL-GW7材料和长宽比小的华粳籼74材料的基因组DNA，PCR产物经过4% 琼脂糖电泳可检测到由于碱基插入缺失造成的差异，并由此判定水稻品种所携带的等位变 异类型。在本实施例中，华粳籼74的引物1 (SEQ ID NOs :9,10)扩增产物较大，引物2(SEQ ID NOs : 11，12)扩增产物较小；NIL-GW7的PCR产物与之相反。这可以作为特异性分子标记 鉴定控制细长粒型基因 GW7的优异等位变异类型，即当引物1 (SEQ ID NOs :9,10)扩增产物 较小而引物2 (SEQ ID NOs :11，12)扩增产物较大的材料拥有较窄的谷粒和较大的谷粒长宽 比。在品种选育过程中，携带gw7宽粒品种与携带GW7窄粒品种的杂交后代群体中，可用该 标记快速筛选出携带窄粒基因 GW7的后代材料。
[0155] 实施例7 :GW7水稻转基因实验及转基因材料粒型分析
[0156] 本实施例利用近等基因系NIL-GW7 (由实施例3构建）幼穗为材料，反转录扩增获 得GW7基因全长cDNA。
[0157] (1)GW7反义超表达转基因载体的构建与转化
[0158] 根据GW7基因的cDNA序列，设计引物：
[0159] GW7pucc-BglIIF :5' -AgATCTAAACTgTTACCAAgAgCTCC-3'
[0160] GW7pucc-XhoIR :5, -CTCgAggTTCCACTgTCCACCTTgCATC-3'
[0161] GW7pucc-XbaIF : 5 ' -TCTAgAAAACTgTTACCAAgAgCTCC-3 '
[0162] GW7pucc-SalIR :5, -gTCgACgTTCCACTgTCCACCTTgCATC-3'
[0163] 以GW7基因全长cDNA为模板，分别用引物GW7pucc-BglIIF和GW7pucc-XhoIR、 GW7pucc-XbaIF和GW7pucc-SalIR扩增GW7基因406bp的序列，将扩增产物分别用BglllF 和XhoIR、Xba IF和Sal IR双酶切回收，先将用BglllF和Xho IR双酶切的片段连接到 经BglllF和XhoIR双酶切的质粒pUCCRNAi (构建RNAi载体的中间载体，详细构建方法 参见 Huang et al·，Nature Genetics，2009,41 (4) :494-497)上；测序正确后将连接好 的质粒经Xba IF和Sal IR双酶切，回收质粒部分，再与经Xba IF和Sal IR双酶切回 收的片段连接，从而在pUCCRNAi上连接有两段插入方向相反的GW7基因的同一 cDNA片 段，构建成pUCCRNAi. :GW7-RNAi，该质粒经Pst I单酶切，与同样经Pst I酶切的质粒 pCAMBIA-2300-Actin连接，构建成RNAi载体pAct :GW7-RNAi。采用农杆菌介导的转化法将 该载体导入到NIL-GW7中。转基因阳性植株的粒型显著改变，较NIL-GW7宽，短（图3，a)。
[0164] (2) GW7超表达转基因载体的构建与转化
[0165] 根据GW7基因的cDNA序列，设计引物：
[0166] GW7-F-SalI :5' -gCgTCgACATgCCTCCggCgAgggTgCTC-3'
[0167] GW7-R-KpnI : ' -cggggTACCTCAgCTTgTACTACTAAATgACAgC-3'
[0168] 以GW7基因全长cDNA为模板，扩增出GW7全长序列，将PCR产物利用Sail F和Κρη I R双酶切回收目标片段，并连入到用同样用Sal I F和Kpnl R双酶切回收的pl301Ubinos 载体上，构建成过量表达载体pUbi: :GW7。采用农杆菌介导的转化法将该载体导入到 NIL-gw7(即华粳籼74)中。转基因阳性植株中，GW7表达水平大幅上调，粒型显著改变，较 华粳籼74细长（图3, b)。
[0169] 以上实施例表明，可以通过适当调节GW7基因的表达来改变粒宽、粒长和长宽比 等表型，进而影响水稻籽粒品质。
[0170] 实施例8 :GW7的互作蛋白分析
[0171] 以实施例7中所获取的来自泰丰A、长度为2823Kb的GW7全长0RF，通过Sal I和Spe I重组到pSY735载体上构建成nYFP-GW7载体。通过BiFC方法分析GW7与 OsTONlb，0sT0N2的蛋白互作情况。本实施例采用的BiFC方法简述如下：用酶解液（成 份为：0.6M Mannitol，10mM MES(pH5.7)，1.5%Cellulase RS，0.75%Macerozyme，0.1% BSA，lmM CaCl2,50yg/mL carbenicillin)裂解于28度暗培养的9天的水稻幼苗获取水 稻原生质体；将待检测的nYFP-GW7载体分别与cYFP-GW7、cYFP-GW7用PEG/Ca (成份：0. 6M Mannitol，100mM CaCl2, PEG4000)介导法共转化水稻原生质体；将转化后的原生质体28 度暗培养过夜，用扫描共聚焦电镜对原生质体进行观察。实验结果显示GW7与OsTONlb、 0sT0N2均存在相互作用（图4)，这表明GW7作为水稻中TRM类蛋白的功能保守性，也提示 了 GW7参与植物细胞分裂调控，例如细胞分裂与伸长的方向有关。
[0172] 本发明提及的所有文献均引用作为参考。在阅读本发明所阐述的上述内容之后， 对本发明所作的各种改动或修改，均视同本发明的等价形式，均属于本发明所附的权利要 求书的限定范围。
【主权项】
1. 一种分离、克隆的控制水稻谷粒宽、谷粒长和稻米外观品质的基因 GW7,其为一种分 离的多核苷酸，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列： (1) SEQ ID NOs :1-4中的任何一个所示的核苷酸序列； (2) 与（1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的 核苷酸序列； (3) 与（1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少 95 %或98 %同一性的核苷酸序列； (4) 与（1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在 序列上不同的核苷酸序列； (5) 编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨 基酸序列，或者，由于一或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个）氨 基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列不 同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、 优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95 %或98 %同一性的氨基酸序列； (6) ⑴_(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或 (7) 与（1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2. -种分离的蛋白质，其由权利要求1的控制水稻谷粒宽、谷粒长和稻米外观品质的 基因 GW7编码，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列： (1) SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列， (2) 由于一或多个（例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个）氨基酸残 基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NOs :9-11中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨 基酸序列， (3) 与SEQ ID NOs :7和8中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少 80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列， (4) ⑴或⑵或⑶所述氨基酸序列的活性片段， (5) 由权利要求1的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。3. 如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质具有TRM保守结构域。4. 一种重组构建体，其特征在于包含权利要求1的基因 GW7的多核苷酸序列，所述构建 体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。5. -种重组宿主细胞，其特征在于包含权利要求1的基因 GW7的多核苷酸序列或权利 要求4的重组构建体，或它的基因组中整合有权利要求1的基因 GW7的多核苷酸序列，其中 所述细胞选自植物细胞或者微生物细胞，其中所述微生物细胞优选为大肠杆菌或农杆菌细 胞。6. 权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为水稻细胞。7. 培育产量提高的作物的方法，该方法包括：利用包含权利要求1所述的基因 GW7的 重组农杆菌细胞转染作物植物获得转基因作物植株，或者将含有权利要求1所述的控制水 稻粒形和稻米品质的基因 GW7的作物植株与另一作物植株杂交，其中所述植株优选是粒形 改变，长宽比增大，品质得到改良的植株，其中所述作物优选是农作物，例如水稻。8. 控制水稻谷粒长和谷粒宽的基因 GW7的启动子序列，其包含从如下组核苷酸序列中 选择的核苷酸序列： (1) SEQ ID NOs :5和6所示的核苷酸序列； (2) 与（1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的 核苷酸序列； (3) 与（1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少 95 %或98 %同一性的核苷酸序列； (4) ⑴-(3)任何一个的核苷酸序列的活性片段；或 (5) 与（1)-(4)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。9. 包含权利要求8的启动子序列的构建体。10. -种培育具有提高的米质和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法， 所述方法包括：使用包含权利要求1所述的基因 GW7及其等位变异的水稻亲本与包含gs3 基因的水稻亲本杂交，在后代中选育出GW7-gs3双基因聚合的品系或品种。
【文档编号】C12N15/113GK105985965SQ201510063733
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月6日
【发明人】傅向东, 王少奎, 吴昆 , 刘倩, 李姍
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所