卵孢霉素的生物合成基因簇及其应用
【专利摘要】本发明涉及卵孢霉素的生物合成基因簇，具体地，是由一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)产生的具有杀虫和抑菌功能的卵孢霉素生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含7个基因：OpS1、OpS2、OpS3、OpS4、OpS5、OpS6、OpS7。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断卵孢霉素的生物合成，或使其产量发生改变，或产生新的化合物。本发明还首次发现卵孢霉素的生物合成途径，具有重大研究意义。
【专利说明】
卵孢霉素的生物合成基因簇及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及具有杀虫和抑菌作用的卵 孢霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
【背景技术】
[0002] 卵孢霉素（Oosporein)最初于上世纪60年代，鉴定是一种由球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)和布氏白僵菌（Beauveria brongniarti)产生胞外的红色色素，具 有一定的杀虫活性和抑菌作用。单胺氧化酶（ΜΑ0)的活性异常可引起机体多种功能障碍， 形成疾病状态，如帕金森氏病、老年痴呆症及近年来都市中较为流行的抑郁症等均与ΜΑ0 活性异常有关，而卵孢霉素作为一类单胺氧化酶抑制剂，可能对于研发由于单胺酶活性异 常引起的疾病相关药物有一定的帮助。目前虽然卵孢霉素早已被发现，并解析了其结构 (图1)，然而卵孢霉素的生物合成途径却一直不清楚。
[0003] 因此，我们以微生物来源的卵孢霉素为目标分子，从克隆卵孢霉素的生物合成基 因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学以及有机化学相结合的方法来研究其生物 合成，探索其生物合成途径及调节机制，并验证卵孢霉素的杀虫及抑菌效果。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及具有杀虫和抑菌作用的卵孢霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功 能研究及其应用。
[0005] 本发明的第一方面提供了一种卵孢霉素的生物合成基因簇，所述基因簇包括编码 卵孢霉素生物合成所涉及的7个卵孢霉素合成相关基因：0pSl、0pS2、0pS3、0pS4、0pS5、 0pS6、0pS7 ;
[0006] 其中，OpSl位于基因簇核苷酸序列第24759 - 32012位，编码聚酮合酶/苷色酸 合酶，长度为2211个氨基酸；
[0007] 0pS2位于基因簇核苷酸序列第32992 - 34102位，编码转运蛋白，长度为350个氨 基酸；
[0008] 0pS3位于基因簇核苷酸序列第36584 - 38809位，编码转录因子，长度为741个氨 基酸；
[0009] 0pS4位于基因簇核苷酸序列第39149 - 40901位，编码羟化酶，长度为427个氨基 酸；
[0010] 〇pS5位于基因簇核苷酸序列第41885 - 44041位，编码漆酶，长度为590个氨基 酸；
[0011] 0pS6位于基因簇核苷酸序列第44430 - 45147位，编码谷胱甘肽S转移酶，长度为 218个氨基酸；
[0012] 0pS7位于基因簇核苷酸序列第45713 - 46768位，编码Cupin蛋白，长度为305个 氨基酸。
[0013] 在另一优选例中，所述基因簇的序列选自SEQ ID NO. 1中第8391-54012位。
[0014] 在另一优选例中，所述基因簇还包括所述7个卵孢霉素合成相关基因中的一个基 因或多个（如2个、3个、4个、5个、6个或7个）基因所构成的组合或所构成的基因簇或其 片段。
[0015] 本发明第二方面提供了一种卵孢霉素的生物合成相关蛋白，所述蛋白的氨基酸序 列是选自如SEQ ID N0. : 2-8所示的氨基酸序列。
[0016] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :2所示的聚酮合酶/苷 色酸合酶。
[0017] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :3所示的转运蛋白。
[0018] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :4所示的转录因子。
[0019] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :5所示的羟化酶。
[0020] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :6所示的漆酶。
[0021] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :7所示的谷胱甘肽转移 酶。
[0022] 在另一优选例中，所述的生物合成相关蛋白是SEQ ID N0. :8所示的Cupin蛋白。
[0023] 本发明第三方面提供了一种卵孢霉素的生物合成相关基因，所述基因编码本发明 第二方面所述卵孢霉素的生物合成相关蛋白。
[0024] 在另一优选例中，所述的生物合成相关基因是选自以下基因：
[0025] OpSl、0pS2、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6、0pS7、或其组合。
[0026] 在另一优选例中，所述合成相关基因的核苷酸序列的信息如上所述或见表1。
[0027] 本发明第四方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第一方面所述的 卵孢霉素的生物合成基因簇或其片段，或本发明第三方面所述的卵孢霉素的生物合成相关 基因。
[0028] 本发明第五方面提供了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面 所述的表达载体，或其染色体上整合有外源的本发明第一方面所述的卵孢霉素的生物合成 基因簇或本发明第三方面所述的卵孢霉素的生物合成相关基因。
[0029] 在另一优选例中，所述重组的宿主细胞包括真核细胞，如球孢白僵菌、毕赤酵母。
[0030] 本发明第六方面提供了一种球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，在所述的球孢 白僵菌中，卵孢霉素的生物合成基因簇中的选自下组一个或多个基因被失活：〇pSl、0pS3、 0pS4、0pS5、0pS6、0pS7,从而不产生卵孢霉素。
[0031] 在另一优选例中，所述的被失活基因选自下组的一个基因：0pSl，0pS3, 0pS4， 0pS5, 0pS6,和 0pS7。
[0032] 在另一优选例中，所述的球孢白僵菌中，0ps2基因被保留。
[0033] 本发明第七方面提供了一种球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，所述的球孢白僵 菌中，卵孢霉素的生物合成基因簇中一个或多个基因被过表达，从而提高或恢复卵孢霉素 的产量，
[0034] 其中，所述的被过表达基因选自下组：0pSl，0pS3, 0pS4, 0pS5, 0pS6和0pS7。
[0035] 在另一优选例中，所述的球孢白僵菌中，0ps2基因被敲除或下调。
[0036] 在另一优选例中，所述的提高指，与原始菌株（球孢白僵菌）的卵孢霉素产量A0 相比，所述过表达的球孢白僵菌中的卵孢霉素产量A1与AO之比为> 1.5,较佳地>2.0,更 佳地彡2. 5,如1. 5-10,较佳地2-5。
[0037] 本发明第八方面提供了一种卵孢霉素生物合成基因或其蛋白的用途，用于合成 卵孢霉素的前体或中间体，其中所述的卵孢霉素生物合成基因或其蛋白选自下组：〇pSl、 0pS4、0pS5、0pS7〇
[0038] 在另一优选例中，所述的合成为体外酶促合成或人工合成。
[0039] 在另一优选例中，提供了一种OpSl基因或其蛋白的用途，所述OpSl基因或其蛋白 用于合成卵孢霉素的合成前体。
[0040] 在另一优选例中，所述卵孢霉素的合成前体为苷色酸。
[0041] 在另一优选例中，所示OpSl基因或其蛋白以乙酰辅酶A为原料催化苷色酸的合 成。
[0042] 在另一优选例中，所述苷色酸的结构如式I所示：
[0043]
[0044] 在另一优选例中，提供了一种0pS4基因或其蛋白的用途，所述0pS4基因或其蛋白 用于催化式I化合物的脱羧羟化反应，从而生成式Π 中间体。
[0045] 在另一优选例中，所述中间体为化合物2。
[0046] 在另一优选例中，所述化合物2为三羟基甲苯。
[0047] 在另一优选例中，所述化合物2的结构如式II所示：
[0048]
[0049] 在另一优选例中，所述化合物2结构不稳定，会部分转化为化合物3和化合物4。
[0050] 在另一优选例中，所述化合物3为酮式结构，其结构如式III所示：
[0051]
[0052] 在另一优选例中，所示化合物4由2个化合物2氧化聚合形成，其结构如式IV所 示：
[0053]
[0054] 在另一优选例中，提供一种0pS7基因或其蛋白的用途，所述0pS7基因或其蛋白用 于催化式II化合物的羟化反应，生成四羟基甲苯。
[0055] 在另一优选例中，所述四羟基甲苯的结构如式V所示：
[0056]
[0057] 在另一优选例中，所述四羟基甲苯结构不稳定，会部分转化成化合物1。
[0058] 在另一优选例中，所述化合物1为酮式结构，其结构如式VI所示：
[0059]
[0060] 在另一优选例中，提供一种0pS5基因或其蛋白的用途，所述0pS5基因或其蛋白用 于催化四羟基甲苯的氧化聚合反应，产生卵孢霉素。
[0061] 在另一优选例中，所述卵孢霉素的结构如式VII所示：
[0062]
[0063] 本发明第九方面提供了一种制备卵胞霉素的方法，包括步骤：
[0064] (i)在适合培养的条件并且在添加原料化合物的情况下，培养产生卵胞霉素的宿 主细胞，从而产生卵胞霉素，其中所述的原料化合物选自下组：苷色酸（式I)、化合物2 (式 II)、四羟基甲苯（式V)或其组合；和
[0065] (ii)分离或纯化出所述的卵胞霉素。
[0066] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是球孢白僵菌。
[0067] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是导入外源卵胞霉素合成相关基因的球孢白僵 菌，其中所述的基因选自下组：0pSl、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6或0pS7基因。
[0068] 本发明第十方面提供了一种对宿主细胞进行改造的方法，包括步骤：
[0069] (a)测定所述宿主细胞中属于卵胞霉素合成基因簇的各相关基因的表达和/或活 性；
[0070] (b)根据测定结果，向所述宿主细胞中导入卵胞霉素合成基因簇的相关基因，从而 提高/恢复所述宿主细胞产生卵胞霉素的能力，
[0071 ] 其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因：0pSl、0pS3、0pS4、 0pS5、0pS6 或 0pS7。
[0072] 在另一优选例中，所述的宿主细胞是球孢白僵菌。
[0073] 在另一优选例中，当所述基因簇的OpSl基因失活或活性下降时，还包括步骤：
[0074] 向培养体系中添加原料化合物，所述原料化合物选自下组：苷色酸（式I)、化合物 2(式II)、四羟基甲苯（式V)或其组合，以恢复卵胞霉素的形成。
[0075] 本发明第十一方面提供了一种与卵胞霉素相关的化合物，所述化合物选自下组：
[0076] 化合物2 (式II)、化合物3 (式III)、化合物4 (式IV)和化合物1 (式VI)。
[0077] 本发明第十二方面提供了一种提高球孢白僵菌产生卵胞霉素的能力的方法，包括 步骤：
[0078] 向所述的球孢白僵菌中导入卵胞霉素合成基因簇的相关基因，从而提高或恢复所 述球孢白僵菌产生卵胞霉素的能力，其中，所述的基因簇的相关基因包括一种或多种以下 基因：0pSl、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6或0pS7 ;或敲除所述的球孢白僵菌中卵胞霉素合成基因 族的0pS2基因，从而提1?所述球抱白僵菌广生卵胞霉素的能力。
[0079] 本发明第十三方面提供了一种分离的0pS2多肽或其编码基因的用途，所述0pS2 多肽或基因用于抑制卵孢霉素的合成。
[0080] 在另一优选例中，所述0pS2多肽选自下组：（i)具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序 列的多肽；
[0081] (ii)将SEQ ID N0:3氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的且具有抑制卵胞菌素合成功能的由（i)衍生的多肽。
[0082] 在另一优选例中，所述0pS2多肽的编码序列选自下组：
[0083] (1)编码如SEQ ID N0:3所述多肽的多核苷酸序列；
[0084] (2)如SEQ ID N0:10所示的多核苷酸序列；
[0085] (3)与（1)或⑵所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸的。
[0086] 本发明第十四方面提供了一种本发明第一方面所述卵孢霉素的生物合成基因 簇或其部分基因的用途，其特征在于，所述基因簇中部分基因被用于在球孢白僵菌ARSEF 2860相关基因缺失的突变株中进行异源互补，从而恢复产生卵孢霉素；或将所述基因簇中 部分基因在毕赤酵母中进行异源表达，从而产生卵孢霉素的合成前体、中间体以及卵孢霉 素类似物。
[0087] 在另一优选例中，所述毕赤酵母选自GS115。
[0088] 在另一优选例中，所述卵孢霉素的合成前体为苷色酸（式I)。
[0089] 在另一优选例中，所述卵孢霉素的合成中间体为化合物2(式II)、化合物3(式 III)、四羟基甲苯（式V)和化合物1(式VI)。
[0090] 在另一优选例中，所述卵孢霉素类似物为化合物4(式IV)。
[0091] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0092] 图1显示了卵孢霉素的化学结构式及颜色。
[0093] 图2显示了卵孢霉素合成基因簇结构。
[0094] 图3显示了 OpSl敲除载体结构。
[0095] 图4显示了各基因敲除突变体及野生型菌株发酵液颜色变化。
[0096] 图5显示了各突变体及野生型菌株发酵液HPLC检测结果。
[0097] 图6显示了 0pS3过表达载体结构。
[0098] 图7显示了野生型、0pS3敲除及过表达突变体发酵液颜色对比。
[0099] 图8显示了野生型及各突变体发酵液HPLC检测结果。
[0100] 图9显示了野生型菌株及各突变体卵孢霉素产量对比。
[0101] 图10显示了野生型菌株及各突变体卵孢霉素合成相关基因的RT-PCR结果。
[0102] 图11显示了 OpSl与OrSA的结构域组成对比。
[0103] 图12显示了野生型菌株与Λ OpSl突变体苷色酸喂养实验发酵液颜色对比。
[0104] 图13显示了野生型和Λ OpSl突变体苷色酸喂养实验的HPLC检测结果。
[0105] 图14显示了野生型及OpSl异源表达菌株发酵液和苷色酸标样（OrA)的HPLC检 测结果。
[0106] 图15显示了野生型菌株和各突变体菌株发酵液的颜色对比。
[0107] 图16显示了野生型及各突变体发酵液HPLC检测结果。
[0108] 图17显示了野生型与突变体GS115: :0pS4发酵液HPLC检测结果。
[0109] 图18显示了野生型与突变体Λ 0pS7: :0pS3的"化合物1"喂养试验HPLC检测结 果。
[0110] 图19显示了卵孢霉素的合成途径。
[0111] 图20显示了大蜡螟生物测定结果。
[0112] 图21显示了被白僵菌感染的大蜡螟血淋巴镜检结果。
[0113] 图22显示了野生型和突变体感染虫尸对比。
[0114] 图23显示了卵孢霉素抑菌试验。
【具体实施方式】
[0115] 本发明人经过广泛而深入的研究，以球孢白僵菌来源的卵孢霉素为目标分子，从 克隆其在球孢白僵菌ARSEF 2860中的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、 生物分析信息学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，首次鉴定了卵孢霉 素的生物合成基因簇，具体地，所述基因簇包括7个基因，分别为：0pSl、0pS2、0pS3、0pS4、 0pS5、0pS6、0pS7。其中，OpSl编码聚酮合酶/苷色酸合酶、0pS2编码转运蛋白、0pS3编码 转录因子、0pS4编码羟化酶、0pS5编码漆酶、0pS6编码谷胱甘肽S转移酶、0pS7编码Cupin 蛋白；并且，发明人还首次发现了卵孢霉素的生物合成途径，并验证了卵孢霉素的杀虫及抑 菌效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。
[0116] 卵胞霉素合成相关基因及蛋白
[0117] 如本文所用，本发明公开了一种卵胞霉素合成基因簇（gene cluster)，所述基因 簇包括：0pSl、0pS2、0pS3、0pS4、0pS5、0pS6、0pS7 基因。
[0118] 其中，OpSl基因编码酮合酶/苷色酸合酶，且OpSl基因至少具有选自下组的一个 或多个特征：
[0119] ⑴编码如SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID N0 :2所示的氨 基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii) 具有如SEQ ID NO :9所示的多核苷酸序列；（iv)具有与如SEQ ID NO :9所示的多核苷酸序 列互补的多核苷酸。
[0120] 0pS2基因编码转运蛋白，且0pS2基因至少具有选自下组的一个或多个特征：（i) 编码如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列经过 一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID NO :10所示的多核苷酸序列；（iv)具有与SEQ ID NO :10所示所示的多核苷酸序列互补的 多核苷酸。
[0121] 0pS3基因编码转录因子，且0pS3基因至少具有选自下组的一个或多个特征：（i) 编码如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列经过 一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID NO :11所示的多核苷酸序列；（iv)具有与SEQ ID NO :11所示多核苷酸序列互补的多核苷 酸。
[0122] 0pS4基因编码羟化酶；且0pS4基因至少具有选自下组的一个或多个特征：（i)编 码如SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列经过一 个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID NO :12所示的多核苷酸序列；（iv)具有与SEQ ID NO :12所示多核苷酸序列互补的多核苷 酸。
[0123] 0pS5基因编码漆酶；且0pS5基因至少具有选自下组的一个或多个特征：（i)编码 如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列经过一个 或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如SEQ ID N0 : 13所示的多核苷酸序列；（iv)具有与SEQ ID NO :13所示多核苷酸序列互补的多核苷酸。
[0124] 0pS6基因编码谷胱甘肽S转移酶；且0pS6基因至少具有选自下组的一个或多个 特征：（i)编码如SEQ ID N0 :7所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID N0 :7所示的氨基 酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具 有如SEQ ID N0:14所示的多核苷酸序列；（iv)具有与SEQ ID N0:14所示多核苷酸序列互 补的多核苷酸。
[0125] 0pS7基因编码Cupin蛋白；且0pS7基因至少具有选自下组的一个或多个特征： (i)编码如SEQ ID N0 :8所示的氨基酸序列；（ii)编码如SEQ ID N0 :8所示的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由（i)衍生的多肽；（iii)具有如 SEQ ID N0:15所示的多核苷酸序列；（iv)具有与SEQ ID N0:15所示多核苷酸序列互补的 多核苷酸。
[0126] 在得到了卵胞霉素合成相关基因的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它 的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以 用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的核 苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的雯库或按本领域技术人员已知 的常规方法所制备的雯库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次 或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0127] 卵孢霉素生物合成基因簇的确定
[0128] 发明人在完成球孢白僵菌ARSEF 2860菌株基因组测序的基础上，通过Gene Blast的方法，找到了基因 orsA在球孢白僵菌中的同源基因 OpSl及其所在基因簇 (gene cluster)，其中包括：0pSl(BBA_08179)、0pS2(BBA_08180)、0pS3(BBA_08181)、 0pS4(BBA_08182)、OpS5 (BBA_08183)、OpS6 (BBA_08184)和 OpS7 (BBA_08185)(图 2)。
[0129] 卵孢霉素生物合成基因簇相关性和完整性的确定
[0130] 由于微生物次级代谢产物的生物合成基因在染色体上是连锁成簇存在的，本发明 人对已获得序列中的各个基因进行敲除实验，以验证所获得基因簇与卵孢霉素生物合成的 相关性及其完整性。
[0131] 基因敲除OpSl，0pS3, 0pS4, 0pS5, 0pS6,或0pS7完全中断了卵孢霉素的产生并 且基因过表达OpSl，0pS3, 0pS4, 0pS5,或0pS7能够增加卵孢霉素的产量，证明筛选到的基 因簇的确是与卵孢霉素生物合成相关的；基因敲除0pS2反而增加了卵孢霉素的产量，说明 0pS2有抑制卵孢霉素合成的作用；由此证实，得到的基因簇包含了卵孢霉素生物合成所需 要的所有基因。在各个基因敲除或过表达突变株中，有的完全中断了卵孢霉素的产生，有的 产量有所变化，有的没有明显影响，有的有新化合物出现。
[0132] 基于以上实验结果，并与同类化合物生物合成基因簇进行比较，本发明人确定 卵孢霉素的生物合成基因簇包含从OpSl到0pS7的7个开放读码框（图2)，涵盖染色体 22kb的区域。在整个基因簇中，OpSl编码聚酮合酶/苷色酸合酶（Polyletide Synthase/ Orsellinic acid Synthase)、0pS2 编码转运蛋白（Transporter)、0pS3 编码转录因子 (Transcription Factor)、0pS4 编码轻化酶（Hydroxylase)、0pS5 编码漆酶（Laccase)、 0pS6 编码谷胱甘肤 S 转移酶（Glutathione S-Transferases/GSTs)、0pS7 编码 Cupin 蛋白 (Cupin domain containing protein)(表 1,图 2) 〇
[0133] 表 1
[0134]
[0135] 其中，"一"指"不产生"；"ΝΑ"指"未做过表达实验"。
[0136] 卵孢霉素前体的合成途径
[0137] 聚酮合酶（PKS)是一类多功能酶，由多个模块组成，以乙酰辅酶A(Acetyl-C〇A)为 起始底物，每个模块以丙二酰辅酶A(Malonyl-CoA)为前体，依次引入一个二碳单位。PKS 起始模块只含有AT-domain和ACP-domain，按"AT-ACP"的顺序排列。其延伸模块由三 个核心结构域（Core-domain)组成，即酮酯酰合成结构域（KS-domain)、酰基转移结构域 (AT-domain)和酰基载体蛋白结构域（ATP-domain)，按"KS-AT-ACP"的顺序排列。PKS的最 后一个模块还含有一个硫酯酶结构域（Te-domain)，按"KS-AT-ACP-Te"的顺序排列。除了 这些核心结构域外，PKS中往往还含有一些修饰结构域（Tailoring-Domain),如酮酯酰还 原酶结构域（KR-domain)、脱氢酶结构域（DH-domain)、烯酰基还原酶结构域（ER-domain) 以及甲基转移酶结构域（MT-domain)等。PKS根据结构不同可分为3类，其中真菌的PKS属 于type I迭代型PKS。Type I迭代型PKS只含有一个模块，通过对这个模块的重复利用来 合成不同的产物。基因 OpSl被预测为type I迭代型PKS编码基因，且与构巢曲霉中的苷 色酸合酶基因（orsA)同源，它们所编码的PKS的结构域组成对比如图11所示。
[0138] 卵孢霉素的前体苷色酸被实验证明是由OpSl(PKS)负责合成的。具体地，发明 人对球孢白僵菌AOpSl突变体进行苷色酸回补喂养试验发现，苷色酸的添加使突变体 AOpSl恢复合成卵孢霉素的能力，因此说明苷色酸确实是卵孢霉素合成的前体，且由OpSl 负责合成。
[0139] 卵孢霉素的生物合成途径
[0140] 发明人通过实验发现，如图19所示，卵孢霉素的生物合成由OpSl、0pS4、0pS5、 0pS7介导。
[0141] 具体地，卵孢霉素的生物合成途径如下：
[0142] (1)聚酮合酶OpSl以乙酰辅酶A为原料催化苷色酸的合成；
[0143] (2)苷色酸由羟化酶0ps4催化，经脱羧羟化反应生成"化合物2"（三羟基甲苯）；
[0144] (3) "化合物2"不稳定，会转化为其酮式结构"化合物3"，并且化合物2会氧化聚 合形成少量的"化合物4"（5, 5' -二脱氧卵孢霉素）；
[0145] (4) "化合物2"（三羟基甲苯）经Cupin蛋白0pS7羟基化生成四羟基甲苯，少量 四羟基甲苯会转化为其酮式结构"化合物1" ；
[0146] (5)四羟基甲苯由漆酶0pS5催化，经氧化和自由基二聚化反应生成卵孢霉素。
[0147] 载体
[0148] 本文所用的术语"载体"包括能使插入目的基因进入宿主细胞表达的克隆载体以 及其他载体。表达载体可包括原核表达载体和真核表达载体，可以是质粒、黏粒、噬菌体或 病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列，并在适当位置有可插入外源基因 的限制性内切酶位点。
[0149] 在具体的实施方式中，本发明表达载体含有本发明的卵孢霉素生物合成基因，或 含有本发明的卵孢霉素生物合成基因簇。
[0150] 宿主细胞
[0151] 本文所用的术语"宿主细胞"具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，包含 外源性目的基因并能使之表达的细胞。例如，宿主细胞可以是原核宿主细胞（例如，大肠杆 菌、枯草杆菌、链霉菌、小单胞菌）、真核宿主细胞（例如，酵母）、植物细胞等等。
[0152] 在具体的实施方式中，本发明的宿主细胞宜包含本发明的表达载体，或染色体上 整合有单拷贝或多拷贝的外源的卵孢霉素生物合成基因，或单拷贝或多拷贝的卵孢霉素生 物合成基因簇。
[0153] 在优选的实施方式中，本发明的宿主细胞包括球孢白僵菌、毕赤酵母。
[0154] 优选地，本发明的工程菌是通过球孢白僵菌（Beauveria bassiana ARSEF2860)基 因工程改造而获得。
[0155] 卵孢霉素生物合成基因簇中结构基因失活的突变球孢白僵菌
[0156] 本发明还提供一种球孢白僵菌突变株，所述突变株中本发明的卵孢霉素生物合成 基因的一个或多个基因失活，从而所述突变株不产生卵孢霉素。
[0157] 在具体的实施方式中，所述失活的一个或多个基因选自编码如SEQ ID N0. :9、 11-15所示基因。更佳地，所述的被失活基因选自0?31、0?33、0?34、0?35、0?36或0?37。
[0158] 本发明提供的卵孢霉素生物合成基因簇中一个或多个结构基因被失活的球孢白 僵菌突变株，可作为验证卵孢霉素基因簇中基因功能的模型或对照菌株，和/或用于外源 表达卵孢霉素的宿主细胞。
[0159] 卵孢霉素生物合成基因簇中结构基因过表达的突变球孢白僵菌或突变毕赤酵母
[0160] 本发明还提供一种球孢白僵菌突变株，所述突变株中本发明的卵孢霉素生物合成 基因的一个或多个基因过表达，从而所述突变株提高或恢复产生卵孢霉素。
[0161] 在具体的实施方式中，所述过表达的一个或多个基因选自编码如SEQ ID N0. :9、 11-15所示基因。更佳地，所述的被失活基因选自0?31、0?33、0?34、0?35、0?86或0?37。
[0162] 本发明提供的卵孢霉素生物合成基因簇中一个或多个结构基因过表达的球孢白 僵菌突变株，可作为验证卵孢霉素基因簇中基因功能的模型或对照菌株，和/或用于外源 表达卵孢霉素的宿主细胞。
[0163] 本发明的主要优点包括：
[0164] (1)本发明为卵胞霉素提供了生物合成途径，探索了一种新的生物合成机制。
[0165] (2)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适 的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿 主包括链霉菌、球孢白僵菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
[0166] (3)本发明首次够公开了一种卵胞霉素生物合成基因簇的结构，并对各个基因的 功能进行了分析研究。
[0167] (4)本发明提供了一种新的寻找沉默中间产物的方法，即通过对调控基因簇中各 基因表达的转录因子在突变体中进行过表达，从而得到中间产物。
[0168] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计。
[0169] 通用方法：
[0170] 1.根癌农杆菌AGL-1的转化方法
[0171] 1. 1根癌农杆菌AGL-1感受态制备：
[0172] ⑴以牙签挑取原始菌株AGL-1，于YEB平板（含50μ g/ml羧苄青霉素）上划线培养 进行活化。⑵挑取平板上单菌落，接种至4ml YEB液体培养基（含50 μ g/ml羧苄青霉素） 中，28°C，200rpm，培养过夜。⑶取2ml上述菌液转接至50ml YEB液体培养基（含50 μ g/ ml羧苄青霉素）中，28°C，200rpm，培养至菌液0D600为0. 5( -般约8h)。⑷取出菌液，冰 浴3〇111；[11，4°(1|，8000印111，5111；[11离心收集菌体。（5)弃上清，加入10111120111103(]12重悬菌体沉 淀。（6)41：，8,000印111，51^11，再次离心收集菌体。（7)上清，以211112011110 &(：12再次重悬菌 体，加入无菌甘油至终浓度为15~20%。分装至1. 5ml EP管，100 μ 1/管，液氮速冻后保 存于-80°C。
[0173] 1. 2质粒转化根癌农杆菌AGL-1感受态：
[0174] ⑴取出-80°C冻存的农杆菌感受态，置于冰上融化约10min。⑵向感受态中加 0.5~lyg目的质粒，混匀后冰上静置30min。⑶依次处理如下：液氮5min，37°C水浴 5min，处理后立即置于冰上2min。⑷加入lml无抗YEB液体培养基，28°C，150rpm，复苏3h。 (5) 8, OOOrpm，2min离心收集菌体。（6)弃上清，以100 μ 1无抗YEB重悬菌体后均匀涂布于 YEB平板（含50 μ g/ml羧苄青霉素及50 μ g/ml卡那霉素），28°C倒置培养2天。（7) PCR验 证转化子，挑取阳性转化子以3ml YEB液体（含50 μ g/ml羧苄青霉素和50 μ g/ml卡那霉 素）过夜摇菌，28°C，220rpm。⑶将菌液取部分保存于-80°C，甘油终浓度为15%。
[0175] 2.根癌农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化：
[0176] ⑴白僵菌分生孢子孢悬液的制备：选取马铃薯固体培养基PDA平板上培养两周的 球孢白僵菌，刮取适量菌丝至lml无菌0. 05% Tween-20水溶液，涡旋振荡分离菌丝与分生 孢子；以玻璃丝棉或三层擦镜纸过滤去除菌丝，收集滤液；12, OOOrpm，lmin，离心菌液收集 孢子；弃上清，以lml无菌水重悬孢子，清除残余营养；12, OOOrpm，lmin，再次离心收集孢 子；可重复步骤4~5 -次，以彻底清除孢子表面残余营养；弃上清，以适量无菌水重悬孢 子，血球计数器统计孢子数目后，将孢悬液浓度调至5 X 105conidia/ml，作为工作液用于后 续实验操作。⑵白僵菌转化：转接已成功转化相应载体的AGL-1冻存菌至3ml液体YEB (含 50 μ g/ml羧节青霉素和50 μ g/ml卡那霉素），28°C，220rpm，培养过夜；8, OOOrpm，2min，离 心收集菌体；弃上清，以适量的頂液体重悬菌体，调整至〇D65。为0· 15 ;28°C，150rpm，诱导 培养至0D65。为0. 5~0. 8, 一般需6h ;取诱导好的农杆菌菌液及新鲜制备的白僵菌孢悬液 各100 μ 1，于1. 5ml EP管中混和均匀；取上述混合液100 μ 1涂布于頂平板，28°C共培养 48h ;待灭菌后的M-100固体培养基温度降至60°C，加相应抗生素（噻孢霉素，草胺膦/苯 菌灵）；每块共培养頂平板以15ml上述M-100培养基覆盖，25°C培养3-5天至单个抗性菌 落出现；以牙签将上述抗性菌落挑取至新的M-100抗性培养基平板上，进行第二次筛选；以 SDB液体培养基对二次筛选平板上的抗性菌落摇菌培养，并在M-100平板背面的相应位置 做好标记；抽滤SDB培养菌丝，抽提基因组，进行PCR验证。
[0177] 3.农杆菌介导的真菌转化溶液及培养基
[0178] 2. 5 X诱导培养基的基础盐溶液
[0179]
[0180] M-100微量元素溶液
[0181]
[0182] Μ-100 盐溶液
[0183]
[0184] 诱导培养基（液体）
[0185]
[0186] 灭囷后冷却到50 C后添加：
[0187]
[0188] 诱导培养基（固体）
[0189]
[0190] 灭囷后冷却到50 C后添加：
[0191]
[0192] M-100(For 1L)
[0193]
[0194] MES和AS母液配制：
[0195]
[0196] 4.卵孢霉素分离纯化方法：
[0197] 4. 1卵孢霉素的萃取：
[0198] 用抽滤法分离白僵菌菌丝与培养基，将分离得到的发酵液经50°C真空旋蒸浓缩为 原体积的四分之一。向浓缩的发酵液中加入三氟乙酸并震荡摇匀至发酵液由紫红色变为橙 色（pH~2)。用三倍体积的乙酸乙酯萃取发酵液，分离有机相和水相。将乙酸乙酯相经真 空旋蒸蒸干，最终溶于适量甲醇中。
[0199] 4. 2卵孢霉素的分离：
[0200] 先将大孔树脂D101悬浮于工业酒精中，并装填于层析柱中。用pH~2的水（用 三氟乙酸调pH)平衡层析柱中的填料大孔树脂至流出的洗脱液pH~2 (即大孔树脂显酸 性）。将所得卵孢霉素粗提物均匀滴加于层析柱顶端，使样品充分吸附于大孔树脂之上。用 水（pH~2)作为流动相洗脱3个柱体积，再用氢氧化钾水溶液（pH~12)洗脱样品。收集 洗脱下来的紫色溶液，用三氟乙酸调至pH~2 (溶液变为橙色），随后经真空旋蒸浓缩至原 体积的十分之一。用乙酸乙酯再次萃取溶液，并浓缩蒸干，并用少许甲醇溶解，装于EP管 中。将EP管置于-20°C沉淀过夜后，12000rpm离心lmin，收集沉淀。沉淀即为析出的卵孢 霉素晶体。
[0201] 5. UV 287nm下卵孢霉素的标准曲线绘制。
[0202] 用分离纯化的卵孢霉素分别配置成浓度为1 Omg/ml、8mg/ml、6mg/ml、4mg/ml、2mg/ ml、lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml 和 0· 4mg/ml 的二甲基亚讽（DMSO)溶液。在紫外 UV 287nm 条件下HPLC检测，上样量3 μ 1。计算不同浓度下卵孢霉素的积分峰面积，绘制成卵孢霉素 标准曲线。线性化方程为：y = 2E-07x-0. 4486(y为卵孢霉素的质量，X为卵孢霉素峰面 积）。
[0203] 6.球孢白僵菌RNA的制备
[0204] 6. 1白僵菌RNA的抽提：
[0205] (1)液氮研磨冷冻白僵菌菌丝成粉末，取100mg于EP管中；（2)立即加入1ml Trizol，用移液枪吹打混匀，计入1/5体积（200μ 1)氯仿，混匀，于冰上放置2-3min ;(3)于 12000rpm，4°C离心5min，吸取上清 400μl于另一EP管中，加入l/2体积（200μl)氯仿： 异戊醇（24:1)，混匀；（4) 12000rpm，4°C离心5min，将上清转入另一 EP管中（重复多次去蛋 白），加入1/2体积（200μ 1)异丙醇，混匀，冰上静置10min ; (5) 12000rpm，4°C离心15min， 弃上清，加入800 μ 1 75%乙醇洗2次；（6) 12000rpm，4°C离心5min，弃上清，室温晾干；（7) 用50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀；（8)测定RNA浓度。
[0206] 6.2去除0嫩杂质：
[0207] 配置50 μ 1的反应体系，降解DNA :
[0208]
[0209] 于 37°C 反应 lh。
[0210] 6. 3 回收纯化 RNA:
[0211] (1)50 μ 1反应体系中再加入50 μ 1DEPC水，再加入100 μ 1氯仿：异戊醇（24:1)， 混匀；（2) 12000rpm，4°C离心5min，将上清移入另一个ΕΡ管中，加入100μ 1氯仿：异戊醇 (24:1)混匀；（3) 12000rpm，4°C离心5min，将上清移入另一 ΕΡ管中，加入10μ1 3Μ乙酸钠 和250 μ 1无水乙醇（冰浴），混匀，于-80°C放置20min ; (4) 12000rpm，4°C离心10min，弃上 清，用800 μ 175%乙醇洗2次；（5) 12000rpm。4°C离心5min，收集沉淀，晾干，用30 μ 1 DEPC 水溶解；(6)测RNA浓度。
[0212] 7.球孢白僵菌cDNA的制备（Τ0Υ0Β0 RNA反转试剂盒）
[0213] 7. 1RNA 变性：
[0214] 配置12 μ 1反应体系
[0215]
[0216] 于65°C反应5min后，立即置于冰上。
[0217] 7. 2RNA 反转：
[0218] 配置反转反应体系20 μ 1
[0219]
[0220] 反应程序
[0221]
[0223] 8.毕赤酵母GS115的转化方法
[0224] 8. 1毕赤酵母电转感受态的制备：
[0225] (1)从YPD平板上挑去GS115单菌落，接种于5ml常规YPD培养基中，30°C摇床培 养过夜；⑵取种子培养液〇. 02-0. lml，分别接种于2瓶50ml YPD培养基（装于250ml三角 瓶）中，过夜培养至〇D6QQ= 1.3-1.5 ;(3)将两瓶菌液分装于2支50ml离心管内，于1500g， 4°C离心5min，分别用50ml冰浴的无菌水冲悬菌体；(4) 1500g，4°C离心5min，分别用25ml 冰浴的无菌水重悬菌体；（5)再次离心（方法同上），分别用2ml的冰浴1M山梨醇重悬菌 体；（6)离心（同上），分别用0. lml冰浴的1M山梨醇重悬菌体，并分装于预冷的EP管中， 每管80 μ 1,置于冰上备用。
[0226] 8. 2毕赤酵母电转方法：
[0227] (1)取线性化的质粒5-10 μ g加于GS115电转感受态菌液内，混匀；(2)将混匀的 感受态菌液移入预冷的的电转杯（2mm)中，于冰上放置5min ; (3)电转（2kv) ; (4)迅速向电 转杯中加入冰浴的1M山梨醇lml，将混合液转入1. 5ml EP管中；（5)将菌液置于30°C静置 孵育1-2h ; (6)将菌液混匀，取200 μ 1菌液涂于博来霉素/遗传霉素的YPDS平板上，30°C 培养2-3天。
[0228] 8. 3毕赤酵母突变体的筛选：
[0229] (1)用枪头挑去筛选平板上的突变体菌落，分别接种于3ml的YH)培养基（含 博来霉素/遗传霉素）中，与30°C摇床培养24h ; (2)分别取菌液lml于相应的EP管中； (3) 12000rpm离心lmin，弃上清；（4)分别用200μ 1的裂解液将菌体重悬，分别加入100mg 的0. 5mm瓷珠；（5)于振荡器上震荡8次，每次30s ; (6) 12000rpm离心lmin，将上清移入另 一 EP管中；（7) PCR验证突变体。
[0230] 8. 4毕赤酵母的发酵及诱导表达：
[0231] (1)取常规YPD培养基中的毕赤酵母菌液100 μ 1，接种于50ml MGY培养基（装 于250ml三角瓶中），30°C，220rpm摇床培养24h ; (2) 1500g离心5min，弃上清，用lml常规 MMH培养基重悬菌体，转接于100ml MMH培养基（装于500ml三角瓶），调至0D_= 1 ; (3) 在MMH培养基中加入0. 5%的甲醇（500μ 1)，诱导基因表达，30°C，220rpm摇床培养48h。
[0232] 9.毕赤酵母转化及表达所用培养基
[0233] YPD+Agar 培养基（For 100ml)(遗传霉素 0. 5mg/ml 或博来霉素 0. lmg/ml)
[0234]
[0235] YPD 培养基（For 100ml)(遗传霉素 0. 5mg/ml 或博来霉素 0. lmg/ml)
[0236]
[0237] MGY 培养基（For 100ml)
[0238]
[0239] MMH 培养基（For 500ml)
[0242] 裂解液
[0243]
[0244] 实施例1卵孢霉素合成基因簇的鉴定
[0245] 对球孢白僵菌ARSEF 2860进行测序，获得测序的基因组数据，对该数据进行比较 基因组分析，找到了球孢白僵菌中OpSl及其所在的基因簇，其中包括：0pSl(BBA_08179)、 0pS2(BBA_08180)、 0pS3(BBA_08181)、 0pS4(BBA_08182)、 0pS5(BBA_08183)、 0pS6(BBA_08184)和 0pS7(BBA_08185)(图 2)。
[0246] 生物信息学分析显示，这些基因可能分别编码如下蛋白，包括：0pSl编码聚酮合 酶/苷色酸合酶、0pS2编码转运蛋白、0pS3编码转录因子、0pS4编码羟化酶、0pS5编码漆 酶、0pS6编码谷胱甘肽S转移酶、0pS7编码Cupin蛋白（表1)。
[0247] 实施例2卵孢霉素合成相关基因及其功能的鉴定
[0248] 分别对 OpSl (BBA_08179)、0pS2 (BBA_08180)、0pS3 (BBA_08181)、 0pS4 (BBA_08182)、0pS5 (BBA_08183)、0pS6 (BBA_08184)和 0pS7 (BBA_08185)进行了敲除及 过表达，并用高效液相色谱（HPLC)对敲除突变体的发酵液进行检测，观察特定基因的缺失 或过表达对卵孢霉素合成的影响。
[0249] 2. 10pS基因簇中各基因对卵孢霉素合成的影响
[0250] 以植物遗传中常用的双元载体PCAMBIA1300的pDHt-ks为骨架，向其中分别引入 草胺磷抗性基因 Bar和苯菌灵抗性基因 Ben，构建了用于真菌转化的双元载体pDHt-Bar 和pDHt-Ben ;以载体pDHt-Bar为基础，分别构建了用于敲除基因 OpSl、0pS2、0pS3、0pS4、 0pS5、0pS6和0pS7的敲除载体。
[0251] 使用引物OpSlUF/OpSlUR及OpSIDF/OpSIDR (具体引物序列见表2)，分别PCR扩 增出敲除载体的上下游同源臂，并将上下游同源臂片段分别连接于载体pDHt-Bar的上下 游位点（图3)。用构建好的OpSl敲除质粒转化根癌农杆菌AGL-1获得含有敲除载体的农 杆菌，用于转化球孢白僵菌ARSEF 2860。通过草胺磷抗性平板筛选获得球孢白僵菌的OpSl 敲除突变体（Δ OpSl)
[0252] 按上述方法依次敲除，获得敲除突变体AOpSl、A〇pS2、A〇pS3、A〇pS4、A〇pS5、 Λ 0pS6和Λ 〇PS7,用0. 05 %的Tween溶液分别收集各突变体及野生型菌株WT的孢子，制成 浓度为10s个孢子/ml的孢子悬液，取40 μ 1孢子悬液分别接种于装有20ml SDB培养基的 三角瓶中，于25°C，200rpm摇床培养3天，作为种子培养基。
[0253] 取1ml种子培养基分别接种于装有50ml SDB培养基的三角瓶中，并置于25°C光照 培养箱中（光照时间为12h/天），静置培养5天。最后，滤去菌丝体，收集发酵液。
[0254] 结果显示，如图4所示，野生型菌株WT的发酵液呈红色，除Λ 〇PS2发酵液红色加 深外，其他基因的敲除突变体发酵液均无颜色。
[0255] 用乙酸乙酯萃取发酵液，所得粗提物经真空旋蒸浓缩后，用甲醇洗脱并用高效液 相色谱（HPLC)检测。HPLC检测使用CNW公司C18柱（12:〇|，4. 6mmX 250mm，5 μ m)。洗脱 条件为：柱温401：，水（含0.1%三氟乙酸）：乙腈=87:13，洗脱35 1^11。紫外检测波长为 UV 287nm。
[0256] 检测结果如图5所示，图中卵孢霉素的峰被标记为红色。结果表明，基因 OpSl、 0pS3、0pS4、0pS5、0pS6和0pS7的缺失导致卵孢霉素无法合成，而基因0pS2的缺失反而增 加了卵孢霉素的产量。
[0257] 表 2
[0258]
[0263] 以载体pDHt-Ben为基础构建了基因0pS3的过表达载体，用引物gpdA-F/ gpdA-R(表2)经PCR扩增出球孢白僵菌3-磷酸甘油醛脱氢酶gpdA(BBA_05480)的启动 子连接于载体pDHt-Ben下游的酶切位点SpeI处，获得载体pDHt-Ben-gpdA。然后，用 引物0pS3-F/0pS3-R (表2)扩增得到基因0pS3，并连接于载体pDHt-Ben-gpdA下游酶 切位点Xbal处。用验证引物gpdA-YF/0pS3-YR (表2)验证连接方向，所得过表达载体 pDHt_ben-gpdA-〇pS3 结构如图 6 所不。
[0264] 将构建好的载体通过根癌农杆菌AGL-1的介导转化球孢白僵菌，经含有苯菌灵的 抗性平板筛选得到球孢白僵菌0pS3基因的过表达突变体WT: :0pS3。
[0265] 分别收集球孢白僵菌野生型菌株WT、Λ 〇PS3突变体和过表达突变体WT: :0pS3的 孢子，制成浓度为10s个孢子/ml的孢子悬液，发酵各突变体及野生型菌株，过滤分离菌丝 体和发酵液，如图7所示，野生型菌株WT的发酵液呈红色，Λ 〇PS3菌株的发酵液无颜色，而 WT: :0pS3的发酵液红色加深。
[0266] 将收集的发酵液经HPLC检测，检测结果显示，0pS3的过表达可以显著提高卵孢霉 素的产量，而0pS3的缺失则导致白僵菌无法合成卵孢霉素（图8,卵孢霉素的峰被标记为红 色）。
[0267] 定量实验：
[0268] 用分离纯化的卵孢霉素标样绘制卵孢霉素在HPLC紫外检测波长为UV 287nm条件 下的标准曲线。用卵孢霉素的峰面积比对标准曲线，得到野生型菌株WT及各突变体的卵孢 霉素产量，如图9所示。
[0269] 结果表明，转录因子基因 0pS3的过表达显著提高了卵孢霉素的产量，从不到 50 μ g/ml 提高到约 150 μ g/ml。
[0270] 作用机理研究：
[0271] 分别提取野生型WT、Λ 0pS3突变体及过表达突变体WT: :0pS3的菌丝体RNA并反 转录得到cDNA。通过半定量RT-PCR检测OpS基因簇其他基因在野生型菌株WT和0pS3突 变体中的表达情况（图10, tubulin基因为内标）。
[0272] 结果表明，相比于野生型菌株，基因 0pS3的缺失导致其他卵孢霉素合成相关基因 表达的沉默，而0pS3的过表达则极大地提高了这些基因的表达。
[0273] 2. 3聚酮合酶OpSl的功能鉴定
[0274] 对球孢白僵菌Λ OpSl突变体进行苷色酸（式I)回补喂养试验。将球孢白僵菌野 生型菌株WT和Λ OpSl突变体的种子培养基分别接种于装有50ml SDB培养基的三角瓶中。 野生型WT接种3瓶，而Λ OpSl突变体接种6瓶，其中3瓶加入300 μ 1 (100mg/ml)的苷色 酸（OrA)乙醇溶液，另外3瓶加入300 μ 1的乙醇作为对照，发酵5天，收集发酵液（图12)。
[0275] 结果显示，野生型WT的发酵液呈红色，未添加苷色酸的Λ OpSl突变体的发酵液为 无色，而添加了苷色酸的Δ OpSl突变体发酵液也呈红色。
[0276] 与此同时，将不同处理的发酵液经HPLC检测，紫外检测波长为UV 254nm。结果如 图13所示，图中苷色酸的峰被标记为黄色，而卵孢霉素的峰被标记为红色。由图可见，苷色 酸的添加使突变体△ OpSl中恢复合成卵孢霉素的能力，这说明苷色酸确实是卵孢霉素合 成的前体，且由OpSl负责合成。
[0277]
[0278] 毕赤酵母异源表达：
[0279] 将基因 OpSl (BBA_08179)和磷酸泛酰巯基乙胺酰转移酶（PPTase)基因 BBA_06793 从球孢白僵菌cDNA中扩增出来（表2)，分别与载体pPICZB和pPIC3. 5K连接，得到异源表 达载体pPICZB-OpSl和pPIC3. 5K-06793,并依次转化GS115,经博来霉素和遗传霉素筛选 后，得到基因 OpSl在毕赤酵母中的异源表达突变体GS115: :0pSl。
[0280] 将野生型菌株GS115和OpSl异源表达突变体GS115: :0pSl在MMH培养基中于 30°C，220rpm摇床培养48h。4000rpm离心收集发酵液，将野生型和异源表达突变体的发酵 液与苷色酸标样（OrA)分别经HPLC检测，紫外检测波长为UV 210nm。
[0281] 结果如图14所示，苷色酸被标记为黄色，毕赤酵母野生型菌株GS115的发酵液中 没有积累峰，而在OpSl异源表达菌株GS115: :0pSl的发酵液中发现了苷色酸的积累峰，分 子量为MW = 168。实验证明，OpSl (PKS)负责苷色酸的合成。
[0282] 2. 4其他相关基因的功能鉴定
[0283] 如图5所示，0pS4、0pS5、0pS6和0pS7的缺失均导致卵孢霉素不能合成，但却没有 在其发酵液中发现中间产物的积累。因此，为了找到各敲除突变体中卵孢霉素合成中间体 的积累峰，发明人将转录因子0pS3在各敲除突变体中进行过表达。
[0284] 将过表达载体pDHt-Ben_gpdA-〇pS3分别转化敲除突变体Δ 0pS4、Δ 0pS5、Δ 0pS6 和 A〇pS7,得到转录因子过表达突变体 A0pS4::0pS3、A0pS5::0pS3、A0pS6::0pS3 和 A0pS7::0pS3。发酵野生型菌株及突变体（AOpSl、A〇pS2、A〇pS3、A0pS4::0pS3、 A0pS5::0pS3、A0pS6::0pS3 和 A0pS7::0pS3)并收集发酵液。
[0285] 结果表明，除野生型WT和Λ 0pS2突变体发酵液呈红色外，原来无色的0pS5、0pS6 和0pS7敲除突变体，在过表达转录因子后，分别呈现出红色和橙色（图15)。
[0286] 随后，将上述发酵液用HPLC检测，紫外检测波长为UV 254nm。
[0287] 结果显示（图16):
[0288] (1)在突变体Λ 〇PS4: :0pS3的发酵液中有一个苷色酸的积累峰（分子量为丽= 168)，被标记为黄色。
[0289] (2)在突变体Λ 〇PS5: :0pS3的发酵液中有累积的峰，标记为蓝色，化合物分子量 为丽=154,命名为"化合物1"。
[0290] (3)在突变体Λ 〇PS7: : 0pS3的发酵液中有一个分子量为丽=140的累积峰，被标 记为绿色，命名为"化合物2"，此外还有一个积累峰分子量为MW = 138,被标记为橙色，命名 为"化合物3"。
[0291] (4)在突变体 A〇pS5: :0pS3、A〇pS6: :0pS3 和 A〇pS7: :0pS3 中均有一个积累峰， 分子量为丽=274,标记为枚红色，命名为"化合物4" ；突变体Λ 〇PS6: :0pS3的发酵液中 发现了卵孢霉素的峰（分子量为MW = 306)，被标记为红色。
[0292] 由此推断，羟化酶0pS4、漆酶0pS5及Cupin蛋白0pS7参与催化以苷色酸为前体的 卵孢霉素的合成，且羟化酶0pS4直接催化以苷色酸为底物的反应。而作为S-谷胱甘肽转 移酶的0pS6并不直接参与卵孢霉素的合成，而可能是起到清除卵孢霉素合成过程中产生 的自由基，从而保护细胞免于自由基伤害的作用。羟化酶0pS4与水杨酸羟化酶的氨基酸序 列同源性很高，而水杨酸羟化酶催化水杨酸脱羧羟基化，生成儿茶酚。因此发明人推测羟化 酶0pS4也催化类似的反应，将苷色酸转化为三羟基甲苯。
[0293] 2. 4. 10pS4基因的功能鉴定
[0294] 为了进一步研究羟化酶0pS4的功能及其所催化的反应，发明人将基因0pS4从球 孢白僵菌的cDNA中扩增出来，并连接于载体pPICZB上，构建了基因0pS4的异源表达载体 pPICZB-0pS4,并转化毕赤酵母GS115,经博来霉素筛选得到基因0pS4的异源表达突变体 GS115::0pS4。
[0295] 分别用MMH培养基发酵野生型菌株GS115和突变体GS115: :0pS4,并分别在野生型 和突变体的发酵液中各加入300 μ 1 (100mg/ml)的苷色酸，于30°C，220rpm摇床培养24h。 4000rpm离心收集发酵液，用HPLC检测，紫外检测波长为UV 254nm，结果如图17所示，其中 苷色酸的峰被标记为黄色。
[0296] 结果表明，如图17所示，相比于野生型菌株的发酵液，0pS4异源表达突变体 GS115: :0pS4的发酵液中的苷色酸被大量消耗并转化为"化合物2"，分子量为丽=140,被 标记为绿色。"化合物2"不稳定，会转化产生"化合物3"（MW = 138)和"化合物4"（MW = 274)，分别被标记为橙色和枚红色。
[0297] 分离"化合物4"，经核磁共振鉴定，其结构如式IV所示。
[0298]
[0299] NMR(CD30D，400MHz):
[0300]
[0301] 化合物4的结构与卵孢霉素相似，与卵孢霉素相比，只缺少两个羟基，由两个三羟 基甲苯聚合而成，命名为"5,5' -二脱氧卵孢霉素"。由于"5,5' -二脱氧卵孢霉素"是"化 合物2"被氧化形成的产物，而"化合物2"的分子量为丽=140,因此推断"化合物2"为三 羟基甲苯，且"化合物3"(Mff = 138)为酮式结构，结构分别如式II、式III所示。因此推断 羟化酶0pS4催化苷色酸的脱羧羟化反应，形成一个三羟基甲苯。
[0302]
[0303] 2. 4. 20pS7、0pS5基因的功能鉴定
[0304] 如图16所示，在突变体A〇pS7: :0pS3的发酵液中有"化合物2"的积累，即"化合 物2"为0pS7的底物。分离纯化突变体A〇PS5: :0pS3发酵液中的"化合物1"（分子量为 MW = 154)，经核磁共振鉴定为一个醌类化合物，结构如式VI所示。
[0305] 发明人推断0pS7为一个单加氧酶，催化"化合物2"甲基邻位碳的羟基化，生成一 个四羟基甲苯（式V)。当其无法被利用时，便由烯醇式结构转化为更稳定的酮式结构，即 "化合物1"。同时研究发现，漆酶0pS5可以将多酚类化合物氧化成醌类化合物，并经自由基 反应，在两个自由基之间聚合形成碳碳单键，而漆酶0pS5敲除突变体中又有"化合物1"的 积累，因此发明人推断漆酶0pS5催化"化合物1"的烯醇式结构"四羟基甲苯"（式V)氧化 聚合形成卵胞菌素（式VII)。
[0308] NMR(CD30D，400MHz):
[0311] 验证实验：
[0312] 发明人用分离得到的"化合物1"喂养突变体A〇PS7: :0pS3,用HPLC检测其发酵 液，结果如图18所示。
[0313] 从图中我们可以看到，在突变体A〇pS7: :0pS3中加入"化合物1"使得卵孢霉素的 合成得以恢复，因此"化合物1"是由〇pS7催化产生的。
[0314] 结合图16, 0pS5的敲除阻断了卵孢霉素的合成，且导致了"化合物1"的积累，因 此漆酶0pS5以"化合物1"为底物合成卵孢霉素。
[0315] 实施例3卵孢霉素的合成途径
[0316] 发明人推断卵孢霉素的合成途径如图19所示。具体如下：
[0317] (1)聚酮合酶OpSl以乙酰辅酶A为原料催化苷色酸的合成；
[0318] (2)苷色酸由羟化酶0ps4催化，经脱羧羟化反应生成"化合物2"（三羟基甲苯）；
[0319] (3) "化合物2"不稳定，会转化为其酮式结构"化合物3"，并且化合物2会氧化聚 合形成少量的"化合物4"（5, 5' -二脱氧卵孢霉素）；
[0320] (4) "化合物2"（三羟基甲苯）经Cupin蛋白0pS7羟基化生成四羟基甲苯，少量 四羟基甲苯会转化为其酮式结构"化合物1" ；
[0321] (5)四羟基甲苯由漆酶0pS5催化，经氧化和自由基二聚化反应生成卵孢霉素。
[0322] 实施例4卵孢霉素具有杀虫和抑菌效果
[0323] 4. 1杀虫实验
[0324] 发明人以大蜡螟为实验对象进行白僵菌杀虫实验。
[0325] 取球孢白僵菌野生型WT、无法合成卵孢霉素的突变体Λ OpSl以及卵孢霉素高产 菌株WT: :0pS3的孢子悬液（浓度为106个孢子/ml)，分别注射大蜡螟幼虫，每条幼虫注射 10 μ 1的孢子悬液，每种菌注射50条幼虫；另设一组空白对照，注射0. 05%的Tween溶液。 将注射后的大蜡螟幼虫按所注射孢子的不同分别养在不同容器里，并置于25°C饲养。每隔 12h记一次数，观察大蜡螟的死亡情况。实验结果如图20所示。
[0326] 结果表明，球孢白僵菌野生型WT和卵孢霉素高产菌株WT: :0pS3的杀虫毒力明显 强于无法合成卵孢霉素的突变体△ OpSl，说明卵孢霉素在白僵菌的杀虫过程中起着重要作 用。
[0327] 4. 2抑制昆虫免疫系统实验
[0328] 发明人分别在注射孢子后的第24h、第36h和第48h取被感染大蜡螟的血淋巴进行 镜检，结果如图21所7K。
[0329] 从图中可以看到，在注射白僵菌孢子24h后，野生型WT和卵孢霉素高产菌株 WT: :0pS3的孢子已经突破大蜡螟血细胞的包裹开始萌发，而突变体Λ OpSl的孢子则无法 突破血细胞的包裹；注射后36h，当WT和WT: :0pS3的孢子已经开始大量繁殖，并形成虫菌 体时，极少数的AOpSl孢子才刚开始突破包裹萌发。由此可见，卵孢霉素在抑制昆虫免疫 系统方面发挥着重要作用。
[0330] 与此同时，我们还观察到被WT和WT: : 0pS3感染的大蜡螟的尸体呈红色，而被 Λ OpSl感染的大蜡螟尸体不呈红色，且虫体内菌丝生长缓慢，如图22所示。
[0331] 综上表明，卵孢霉素作为球孢白僵菌主要的外分泌次级代谢产物，不仅影响球孢 白僵菌的杀虫过程，对于白僵菌的后续生长及再感染也至关重要。
[0332] 4. 3抑菌实验
[0333] 与WT和WT::0pS3相比，突变体AOpSl感染的大蜡螟幼虫更容易感染细菌，使虫 尸腐烂发臭。因此，发明人推断卵孢霉素还有抑菌作用，帮助白僵菌拮抗其他腐生微生物的 竞争。为此，发明人对卵孢霉素进行了革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的抑菌实验。
[0334] 实验方法：
[0335] 配制不同浓度的卵孢霉素水溶液，浸润厚滤纸片并贴于长有枯草芽孢杆菌的培养 基平板上，将培养基置于37 °C培养12h。
[0336] 实验结果如图23所示：
[0337] 在卵孢霉素浓度为lmg/ml和0. 8mg/ml的滤纸片周围形成了明显的抑菌圈，表明 卵孢霉素确实具有良好的抑菌作用。
[0338] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种卵孢霉素的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括编码卵孢霉素生物 合成所涉及的7个卵孢霉素合成相关基因：OpSl、OpS2、OpS3、0pS4、OpS5、OpS6、OpS7 ; 其中，OpSl位于基因簇核苷酸序列第24759 - 32012位，编码聚酮合酶/苷色酸合酶， 长度为2211个氨基酸； 0pS2位于基因簇核苷酸序列第32992 - 34102位，编码转运蛋白，长度为350个氨基 酸； 0pS3位于基因簇核苷酸序列第36584 - 38809位，编码转录因子，长度为741个氨基 酸； 0pS4位于基因簇核苷酸序列第39149 - 40901位，编码羟化酶，长度为427个氨基酸； 0pS5位于基因簇核苷酸序列第41885 - 44041位，编码漆酶，长度为590个氨基酸； 0pS6位于基因簇核苷酸序列第44430 - 45147位，编码谷胱甘肽S转移酶，长度为218 个氨基酸； 0pS7位于基因簇核苷酸序列第45713 - 46768位，编码Cupin蛋白，长度为305个氨基 酸。2. -种卵孢霉素的生物合成相关蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列是选自如 SEQ ID NO. : 2-8所示的氨基酸序列。3. -种卵孢霉素的生物合成相关基因，其特征在于，所述基因编码权利要求2所述卵 孢霉素的生物合成相关蛋白。4. 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的卵孢霉素的生物 合成基因簇或其片段，或权利要求3所述的卵孢霉素的生物合成相关基因。5. -种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体， 或其染色体上整合有外源的权利要求1所述的卵孢霉素的生物合成基因簇或权利要求3所 述的卵孢霉素的生物合成相关基因。6. 一种球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，其特征在于，在所述的球孢白僵菌中，卵 孢霉素的生物合成基因簇中选自下组的一个或多个基因被失活：〇pSl、0pS3、0pS4、0pS5、 0pS6、0pS7,从而不产生卵孢霉素。7. 一种球孢白僵菌（Beauveria bassiana)，所述的球孢白僵菌中，卵孢霉素的生物合 成基因簇中一个或多个基因被过表达，从而提高或恢复卵孢霉素的产量， 其中，所述的被过表达基因选自下组：〇pSl，0pS3, 0pS4, 0pS5, 0pS6和0pS7。8. -种卵孢霉素生物合成基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于合成卵孢霉素的 前体或中间体，其中所述的卵孢霉素生物合成基因或其蛋白选自下组：〇pSl、0pS4、0pS5、 0pS7〇9. 一种制备卵胞霉素的方法，包括步骤： (i) 在适合培养的条件并且在添加原料化合物的情况下，培养产生卵胞霉素的宿主细 胞，从而产生卵胞霉素，其中所述的原料化合物选自下组：苷色酸（式I)、化合物2 (式II)、 四羟基甲苯（式V)或其组合；和 (ii) 分离或纯化出所述的卵胞霉素。10. -种对宿主细胞进行改造的方法，其特征在于，包括步骤： (a)测定所述宿主细胞中属于卵胞霉素合成基因簇的各相关基因的表达和/或活性； (b)根据测定结果，向所述宿主细胞中导入卵胞霉素合成基因簇的相关基因，从而提高 /恢复所述宿主细胞产生卵胞霉素的能力， 其中，所述的基因簇的相关基因包括一种或多种以下基因：〇pSl、OpS3、0pS4、OpS5、 OpS6 或 OpS7。
【文档编号】C12N9/02GK105985967SQ201510070362
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月10日
【发明人】王成树, 冯鹏, 商艳芳
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院