一种新型rna环化表达载体的构建及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种新型RNA环化表达载体的构建及其应用。具体地，本发明的用于构建RNA环化分子的核酸构建物具有式I所示的从5’至3’的结构。式I中，A1和A2共同构成一报告基因；B1为第一5’剪接位点序列；C1为第一环化配对序列；D1为嘧啶富含区；E1为第一3’剪接位点序列；F为外源的RNA环化分子的线性序列；B2为第二5’剪接位点序列；C2为第二环化配对序列；D2为嘧啶富含区；和E2为第二3’剪接位点序列；其中，第一环化配对序列C1和第二环化配对序列C2为互补序列。基于本发明构建物的方法，具有操作简单、表达效率高、对目标表达序列要求低，适用范围广、可在体内表达等优点。A1―B1―C1―D1―E1―F―B2―C2―D2―E2―A2 (I)。
【专利说明】
一种新型RNA环化表达载体的构建及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种外显子来源的环形RNA分子高效表达载体的 构建及其应用。
【背景技术】
[0002] 环形RNA最早在上世纪70年代被人们发现，随着相关技术的发展，人们对这一类 分子的研究逐步深入。
[0003] 从物种上，不论在病毒、酵母还是古细菌中，不论在人、灵长类动物还是小鼠中，都 发现了环形RNA的存在。
[0004] 从数量上，早期环形RNA只是被零星地发现，由于新一代高通量测序技术以及分 子生物学技术的进步，目前根据生物信息学的计算分析结果预测，环形RNA的数量相当于 mRNA的1%左右，甚至更多，它们在不同的细胞系中被发现，而且存在种属特异性和组织特 异性（Salzman, et al.，2012)。
[0005] 从类型上，目前发现的环形RNA可以分为三类：一是由外显子通过反向剪接 (back - splicing)形成的外显子来源的环形RNA，exonic circRNAs;二是由来源于内含 子区域通过抑制脱分支过程形成的内含子来源的环形RNA，ciRNAs (circular intronic RNAs) (Zhang Y，et al.，2012);三是由外显子和内含子共同组成的环形RNA分子。
[0006] 从功能上，早期人们认为环形RNA是基因转录过程中剪接产生的副产物，并不发 挥生物学功能，而2013年《自然》杂志发表的一系列文章表明，环形RNA可以充当miRNA分 子海绵，调控基因转录，并与RNA结合蛋白相互作用（Hansen TB，et al.，2013)。而环形RNA 是否具有更多的功能，还有待进一步的探索。
[0007] 为了更好地研究环形RNA的功能，人们一直在寻找一种体外或体内合成环形RNA 的方法，以期通过分子生物学的手段和方法，研究环形RNA在生物体内所发挥的功能和作 用，目前已知的方法和策略主要包括两种：
[0008] 一种是由T4RNA连接酶或T4DNA连接酶诱导的环化（T4RNA or T4DNA ligase - induced circularization) (Beaudry D, et al.，1995)。先是通过 PCR 的方法将 T7 体外转 录酶启动子序列和（或）需要的核酸内切酶位点构入拟环化的片段模板，然后通过体外转 录的方式得到需要的片段，再通过去磷酸化以及磷酸化，或者酶切连接的方法构建出需要 的环形RNA分子，最后通过PAGE纯化切胶回收。这种方法只能用于体外构建，虽然可以获 得足够的环形RNA分子，但后续的应用受到很大的限制。
[0009] 另一种策略是利用自剪接诱导环化（self-splicing-induced circularization) (Umekage S, et al·，2009)。I型内含子的剪接机制目前研究得较为清 楚，它具有保守的序列和结构，能够通过两步转醋反应完成剪接。而其中5'端和3'端剪接 位点的具体序列，以及能被识别、结合、活化的结构特征，比剪接位点的相对位置更加重要。 所以，人们人工合成了 PIE (permuted intron - exon)序列，并通过构建入合适的质粒，使其 能够发生自剪接作用，从而产生环形RNA分子。该方法可以在体内产生环形RNA分子，但是 其构建的一些环形RNA分子种类有限，且构建过程比较繁琐。
[0010] 综上所述，本领域迫切需要开发新的高效地在体内产生环形RNA分子的方法。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种高效的分子生物学工具，其能够在真核细胞中高效表 达外显子来源的环形RNA，为研究环形RNA分子的功能和作用提供工具支持。
[0012] 本发明的第一方面提供一种用于构建RNA环化分子的核酸构建物，所述的构建物 具有式I所示的从5'至3'的结构：
[0013] A1-B1-C1-D1-E1-F-B2-C2-D2-E2-A2 (I)
[0014] 式中，
[0015] A1和A2共同构成一报告基因；
[0016] B1为第一 5'剪接位点序列；
[0017] C1为第一环化配对序列；
[0018] D1为嘧啶富含区；
[0019] E1为第一 3'剪接位点序列；
[0020] F为外源的RNA环化分子的线性序列；
[0021] B2为第二5'剪接位点序列；
[0022] C2为第二环化配对序列；
[0023] D2为嘧啶富含区；和
[0024] E2为第二3'剪接位点序列；
[0025] 其中，第一环化配对序列C1和第二环化配对序列C2为互补序列，且长度100 - 500bp〇
[0026] 此外，"一 "表示各元件（即各序列）之间连接键或连接关系（通常为直接相连）。
[0027] 在另一优选例中，第一环化配对序列C1和第二环化配对序列C2为非重复序列。
[0028] 在另一优选例中，所述的第一环化配对序列含有序列如SEQ ID N0. :2所示的核心 互补区。
[0029] 在另一优选例中，所述的第一环化配对序列的长度为200 - 2000bp，较佳地为 300 - 1500bp，更佳地为 500 - lOOObp。
[0030] 在另一优选例中，所述的D1和D2的长度各自独立为20 - 100bp。
[0031] 在另一优选例中，所述的D1的序列如SEQ ID Ν0· :3。
[0032] 在另一优选例中，所述的D2的序列如SEQ ID Ν0· :7。
[0033] 在另一优选例中，所述的第一环化配对序列Cl和第二环化配对序列C2为完全互 补或部分互补的。
[0034] 在另一优选例中，第一环化配对序列C1长度L1和第二环化配对序列C2的长度L2 之比为1 :8至8 :1，较佳地为1 :4至4 :1 ;更佳地为1 :2至2 :1(如约1:1)。
[0035] 在另一优选例中，所述的F含有miRNA的海绵序列。
[0036] 在另一优选例中，所述的F的长度为100 - 500bp。
[0037] 在另一优选例中，所述的F不含有5'剪接位点序列和3'剪接位点序列。
[0038] 在另一优选例中，所述的第一 5'剪接位点序列和第二5'剪接位点序列为相同或 不同类别的5'剪接位点序列。
[0039] 在另一优选例中，所述的第一 5'剪接位点序列和第二5'剪接位点序列为相同类 别的5'剪接位点序列。
[0040] 在另一优选例中，所述的第一 5'剪接位点序列和第二5'剪接位点序列具有相同 序列。
[0041] 在另一优选例中，所述的第一 3'剪接位点序列和第二3'剪接位点序列为相同或 不同类别的3'剪接位点序列。
[0042] 在另一优选例中，所述的第一 3'剪接位点序列和第二3'剪接位点序列为相同类 别的3'剪接位点序列。
[0043] 在另一优选例中，所述的第一 3'剪接位点序列和第二3'剪接位点序列具有相同 序列。
[0044] 在另一优选例中，在A1与F之间序列总长度TL1以及F与A2之间序列总长度TL2 各自独立地为300 - 3000bp，较佳地所述的500 - 2000bp，更佳地为800 - 1200bp。
[0045] 在另一优选例中，所述的总长度TL1和总长度TL2之比为5 :1至1:5 ;较佳地为2 : 1 至 1:2〇
[0046] 在另一优选例中，所述的报告基因包括抗性基因和荧光蛋白基因。
[0047] 在另一优选例中，A1占完整报告基因序列的约1/20至19/20 ;而A2占完整报告基 因序列的约19/20至1/20 ;且A1+A2构成完整报告基因。
[0048] 在另一优选例中，所述的报告基因是增强绿色荧光蛋白（EGFP)基因。
[0049] 在另一优选例中，B1、C1、D1、E1、F、B2、C2、D2、E2的具体序列如表A中所示。
[0050] 在本发明的第二方面，提供了一种在体外（或体内）非治疗性（或治疗性）地产 生环形RNA的方法，包括步骤：将本发明第一方面中任一所述的用于构建RNA环化分子的核 酸构建物导入真核细胞，从而在所述真核细胞中产生来源于所述构建物的环形RNA。
[0051] 在另一优选例中，所述的环形RNA为表达外显子来源的环形RNA。
[0052] 在另一优选例中，所述的真核细胞包括哺乳动物细胞（如酵母细胞、哺乳动物、人 细胞等）。
[0053] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0054] 图1显示了实施例1中用于构建RNA环化分子的核酸构建物pZWl - Circ 一 Vector 的序列结构。
[0055] 图2显示了核酸构建物pZWl - Circ-Vector的引物设计策略。
[0056] 图3显示了实施例2中更优的用于构建RNA环化分子的核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High的序列结构。
[0057] 图4显示了核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High的引物设计策略。
[0058] 图5显示了对比例1中互换核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High中C1和D1 位置的序列结构。
[0059] 图6显示了对比例2中互换核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High中C2和D2 位置的序列结构。
[0060] 图1-6中，exon表示外显子。此外，核酸构建物的各元件的代表性的序列如下表A 所示：
[0061] 表 A
【具体实施方式】
[0064] 本发明人通过广泛而深入的研究，首次成功开发了一种在体内高效表达环形RNA 分子的载体。该载体经过优化设计，通过特定的提高环形RNA形成的结构元件（包括元件 A1、B1、C1、D1、E1、B2、C2、D2、E2、A2)并引入限制性酶切位点，可以方便地将拟研究的外显 子序列连接到载体，可以更加高效地在体内针对所需的外源序列F表达形成环形RNA分子， 从而为环形RNA分子的研究提供更高效、更方便、更实用的分子生物学工具。在此基础上完 成了本发明。
[0065] 本发明公开了一种在体内高效表达环形RNA分子的载体，并公开了一种将外显子 序列构建成环形RNA的方法。
[0066] 在一个具体例中，是将选定的可产生环形RNA的外显子及其两侧的内含子序列， 构建入常规的PZW1载体或类似载体中，原载体的剪接位点和多克隆酶切位点不予保留，利 用体内环形RNA的成环机制，形成外显子来源的环形RNA分子。
[0067] 在一个具体实施例中，以P0LR2A基因的第9、第10个外显子及其两侧内含子序列， 并将其构建入PZW1载体。
[0068] 本发明人首次意外地发现，具有式1所示的特定结构的构建物，可以非常高效地 形成外显子来源的环形RNA分子。
[0069] 此外，在一优选例中，本发明人利用已经构建成功的质粒载体，并其两侧设置反向 互补的Alu序列，那么有助于在成环机制中起作用。如果将其两侧的Alu序列分别进行缺 失突变，结果显示两侧至少保留一个反向互补的Alu序列，才能保证环形RNA的形成。更优 地，在此基础上，对该载体进行优化，将两侧Alu序列用一对完全反向互补序列（非重复序 列）分别替代，进一步证明元件C1和C2的存在是必要的。更重要的是，采用两侧完全反向 互补序列（非重复序列）替代原有的Alu序列后，能更加高效地表达外显子来源的环形RNA 分子。
[0070] 在一特别优选例中，通过在此高效表达载体上引入了限制性核酸内酶位点Bglll、 Notl等，可将类似的外显子来源的环形RNA简单、快速地构建到在该载体中，并进行高效的 表达，为进一步研究外显子来源的环形RNA在真核生物体内的作用提供了更优的分子生物 学工具。
[0071] 在一个具体实施中，本发明方法包括步骤：
[0072] 1.设计带酶切位点引物（上游引物带Bglll酶切位点，下游引物带Notl酶切位 点），将需要表达的外显子序列通PCR的方法进行体外扩增。
[0073] 2.(可选步骤）可将PCR产物连接入TA克隆载体，然后进行鉴定。对阳性克隆的 可行目的质粒扩增备用。
[0074] 3.将PCR产物或步骤2中扩增的质粒进行双酶切，获得目的片段。然后用T4DNA 连接酶连接。
[0075] 4.选择合适的感受态细胞，将连接产物进行转化，然后进行单克隆鉴定，对阳性克 隆进行扩增纯化出质粒，即可供下游细胞转染等实验应用。
[0076] 本发明的有益效果为：首次成功构建并公开了在真核细胞生物体内高效表达外显 子来源环形RNA分子的思路和方法，利用该改进的载体，可以简单、快速地进行构建，并能 高效表达外显子来源的环形RNA分子，从而为在真核生物体内研究环形RNA分子的作用和 功能，提供了新的途径和方法。本发明为深入研究外显子来源的环形RNA分子的功能和应 用提供了有力的工具支持。
[0077] 本发明的主要优点在于：
[0078] (1)操作简单，表达效率高。
[0079] (2)对目标表达序列要求低，适用范围广。
[0080] (3)体内表达，可以更加真实反映体内作用情况。
[0081] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0082] 实施例lpZWl - Circ一 Vector环形RNA分子表达载体的构建及检测
[0083] 根据目前关于外显子来源的环形RNA分子的分子结构和产生机制，本发明构建了 环形RNA分子表达载体，命名为pZWl - Circ一 Vector，并采用Northern Blot等实验方法 验证环形RNA分子的表达。此例中，以P0LR2A基因的第9、第10外显子为例，描述其构建的 方法和验证实施过程。
[0084] 1.实验材料
[0085] 1. 1实验试剂
[0086] 限制性核酸内切酶Nhel和Mlul购自美国NEB公司；T4DNA连接酶，PrimeSTAR 高保真PCR体系购自日本Takara公司；TRIzol·? Reagent购自美国Invitrogen公司； AmpliScribe? T7 Transcription Kits 购自美国 Epicentre 公司，LiCl 和琼脂糖购自美 国 Sigma 公司；X-tremeGENE 9DNA Transfection Reagent,DIG Northern Starter Kit, RNA Molecular Weight Marker III，Anti-digoxigenin-AP, Fab fragments VXjk. CDP - Star, ready to use试剂购自瑞士 Roche公司；质粒抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司；X光 片，显影液和定影液购自美国Kodak公司。
[0087] 1. 2细胞株和载体
[0088] 实验中所采用的细胞培养方法均按照美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC)提供的条件培养。人源胚胎干细胞系H9培养在Martigel包 被的培养皿上，米用CM (fibroblast - conditioned medium)培养基进行培养，该CM培养基 为补加了 4ng/mL的成纤维细胞生长因子（bFGF，Life Technologies)的小鼠 MEF细胞培养 基上清。
[0089] 人源宫颈癌细胞系HeLa由其他实验室提供，HeLa细胞系的培养基为90%的DMEM， 10% FBS，加上1%。的氨苄青霉素和链霉素；培养条件为37°C，5% C02。构建目的质粒所采 用的载体为pZWl载体（Wang et al.，2004)。
[0090] 2.实验方法
[0091] 2. lpZWl - Circ一 Vector环形RNA分子表达载体的构建
[0092] 采用的方法主要为分子生物学中Overlap PCR等方法。在pZWl载体中的MCS区 域（即两个半个EGFP外显子中间的内含子区域）的Nhel和Mlul之间插入含有P0LR2A基 因的第9、第10外显子及其两侧内含子片段，并且去除了原载体中的剪接位点，利用插入片 段的剪接序列及真核细胞本身的剪接机制产生环形RNA分子。质粒构建示意图参见图1。 具体构建过程如下：
[0093] 2. 1. lOverlap PCR该方法的基本原理是利用两个或多个PCR产物片段，利用其彼 此设计的一定长度的重叠区域，通过两轮PCR的方法将片段连接。具体的，第一轮PCR，一 般采用5个循环，不加入引物，只加入等摩尔数的目的PCR片段，片段间有重叠区域，利用它 们可以互为模板和引物进行扩增；第二轮PCR，通常不超过30个循环，与第一轮PCR不同的 是，需要加入所需长片段最外侧两端的引物，进一步扩大所需片段的产量。
[0094] 进一步的，pZWl - Circ一 Vector包含三个片段，采用PrimeSTAR高保真PCR体系 进行目的扩增，具体的，即左侧片段包含Nhel酶切位点并且和P0LR2A基因的第9、第10外 显子及其两侧内含子序列上游有重叠区域的egfp左半边；中间片段包含有P0LR2A基因的 第9、第10外显子及其两侧内含子序列；以及右边含有Mlul酶切位点并且和P0LR2A基因 的第9、第10外显子及其两侧内含子序列下游有重叠区域的egfp右半边。三个片段之间依 次包含相互重叠部分（如图2中所示）。
[0095] 采用下面表1中的引物，限制性核酸内切酶Nhel和Mlul位点是在两侧的引物中 引入，以pZWl为模板，采用引物1、4扩增出左侧片段，采用引物2、5扩增出右侧片段；以H9 细胞基因组为模板，采用引物3、6扩增出中间片段。
[0096] 表1引物序列
[0097]
[0099] 其中，PrimeSTAR(Takara公司）的PCR反应体系为，如表2、表3 :
[0100] 表2PCR反应体系
[0102] 表3PCR反应条件
[0103]
[0104] 将所得的以上3个片段PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的大小与预计相 符，然后将相应条带割胶回收，PCR产物回收后，加入等摩尔数的三个片段，前五个循环不加 引物，随后加入P0LR2A-Con- 1 一 F (引物1)和P0LR2A-Con- 1 一 R (引物2)再扩增30 个循环后回收产物。
[0105] 2. 1. 2酶切将PCR产物经纯化后的片段、pZWl载体分别用限制性内切酶Nhel和 Mlul进行酶切。酶切结束后，采用胶回试剂纯化。反应体系如下，见表4:
[0106] 表4酶切反应体系
[0107]
[0108] 2. 1. 3连接用T4DNA连接酶（Takara)将含有黏性末端的PCR片段连到线性化的 pZWl载体中，连接反应体系如下，见表5 :
[0109] 表5连接反应体系
[0110]
[0111] 反应体系总体积l〇ul，依次加入各反应物质，混匀，置于16°C连接过夜。
[0112] 2. 1. 4转化取5ul连接产物转化感受态大肠杆菌，42°C热激30s，立即放冰上2min， 加入无抗的液体LB培养基，37°C复苏60min，6000rpm离心2min，吸去大部分上清，用剩余 残液重悬菌沉淀，用涂布棒涂布在含卡那霉素（l〇〇mg/ml)的固体LB平板上，置于37°C培养 箱培养12 - 16小时，挑取单菌落并PCR鉴定阳性克隆，阳性克隆送测序公司进行测序，测序 结果与预期一致后扩大培养并抽提质粒，将其命名为PZW1 - Circ一 Vector。
[0113] 2. 2细胞转染
[0114] 用pZWl空载体（阴性对照）、表达载体pZWl - Circ 一 Vector转染HeLa细胞系，转 染 24 小时后收取总 RNA。转染试剂为X - tremeGENE 9DNA Transfection Reagent(Roche)。 具体的，
[0115] 2. 2. 1细胞准备提前一天铺HeLa细胞，铺盘密度为3xl05个/35mm dish，混匀，贝占 壁培养。24小时后细胞汇合度75 - 85%，然后进行转染。
[0116] 2. 2. 2转染前取100ul的Opti - MEM(Gibco)加入无菌的1. 5ml的EP管中，然后 加入lug相应质粒，混匀后再加入3ul转染试剂，混匀后室温静置20分钟。
[0117] 2. 2. 3转染将质粒混合物逐滴加入细胞培养物中，轻轻混匀，然后放入37°C培养 箱中继续培养。
[0118] 2. 2. 4转染后培养24小时后，终止转染，收取总RNA (具体步骤如2. 3)。
[0119] 2.3细胞总1?熟提取
[0120] 采用T.Klpol? Reagent试剂（Invitrogen)抽提细胞的总RNA，具体步骤如下：
[0121] 2. 3. 1漂洗，裂解首先用lx PBS洗35mm培养皿中的细胞两次，然后加入 lml TRIzol·? Reagent试剂，反复吹打直至细胞全部裂解；
[0122] 2. 3. 2分离转到1. 5ml的无 RNase的EP管中，并加入0. 2mL氯仿，剧烈振荡30秒， 然后放入在4°C低温离心机中，采用14000rpm/min，离心15分钟；
[0123] 2. 3. 3沉淀取上层水相500ul，转到新的无 RNase的1. 5ml EP管中，加入等体积预 冷的异丙醇混匀后室温静置10分钟，然后4°C离心，14000rpm/min，离心10分钟；
[0124] 2. 3. 4干燥离心结束后，RNA在管底形成沉淀，用一 20°C预冷的75%乙醇漂洗两次 后，倒掉乙醇并短暂离心，去掉残留乙醇，RNA沉淀室温晾干至透明状；
[0125] 2. 3. 5溶解向EP管中加入50ul DEPC处理的双蒸水溶解，混匀；
[0126] 2. 3. 6保存用Nanodrop检测RNA浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性； 然后取出适量RNA用于下游实验，其余RNA分装后放入超低温冰箱保存。
[0127] 2. 4Northern Blot验证环形RNA分子的表达
[0128] 通过Northern Blot手段检测构建的pZWl - Circ一 Vector表达载体是否可以产 生所预期的外显子来源的环形RNA。
[0129] 2. 4. 1制备Dig标记探针
[0130] 以H9细胞基因组为模板，采用表6所列引物，采用PCR技术扩增所需模板。
[0131] 表6制备探针所用到的引物
[0132]
[0133] 然后，将纯化的PCR产物，采用体外转录试剂盒（Epicentre)制备所需探针，其中 采用Roche的DIG RNA Labeling Mix(10x)。体外转录制备探针的反应体系如表7所示：
[0134] 表7体外转录制备探针的反应体系
[0135]
[0136] 混匀后，37°C水浴3小时，采用4M LiCl沉淀回收，DEPC- H20溶解后分装后，一 80 °C保存备用。
[0137] 2. 4. 2采用变性TBE - PAGE胶验证环形RNA分子表达
[0138] 验证实验中用到的电泳缓冲液为lx TBE buffer (89mM Tris，89mM硼酸，2mM EDTA ρΗ8·0)，转膜缓冲液为 lx transfer buffer(10mM Tris，5mM NaAc，lmM EDTA，pH7.8); Northern Blot 试剂 DIG Northern Starter Kit (Roche)。具体过程可参照 Roche 公司 DIG Northern Starter Kit说明书。Northern Blot验证关键步骤如下：
[0139] 1)配制 5% 的 8M 尿素 TBE - PAGE 胶。
[0140] 2) 4ug total RNA上样，上样缓冲液为尿素饱和的4x DNA loading buffer。
[0141] 3)在120V的电压条件下电泳约2个小时，电泳缓冲液为lx TBE buffer。
[0142] 4)用Bio - Rad转膜装置进行转膜，100V电转1. 5h，转膜缓冲液为lx transfer buffer。
[0143] 5) RNA转移到尼龙膜上后，在紫外交联仪中交联，将RNA固定在尼龙膜上，交联条 件为 180mJ/cm2。
[0144] 6)加入3ml杂交缓冲液，68°C预杂交2个小时；更换3ml新的杂交缓冲液，并加入 相应的100°C变性5分钟的探针，杂交过夜。
[0145] 7)杂交结束后，在室温用2XSSC+0. 1% SDS条件洗涤两次，每次5min，在68°C用 0. 2 X SSC+0. 1 % SDS条件洗涤两次，每次30min ;
[0146] 8)用 lx Blocking buffer 室温封闭 30min，然后按 1:10000 加入 Anti - Digoxigenin, Fab Fragment (Roche)，室温孵育 30min〇
[0147] 9)用 lx Washing buffer 洗两次，每次 20min〇
[0148] 10)用 lx Detection buffer 漂洗 5min 后，在膜上加入 0· 2ml - lml 反应底物 ⑶P - Star, ready to use，反应2- 3分钟后，在暗室中压X光片若干分钟并显影。
[0149] 2. 5实验结果分析
[0150] pZWl - Circ一 Vector表达载体转染HeLa细胞后经Northern Blot所形成的环形 RNA，在对照组经长时间曝光可观察到单一条带，在相同的位置，可见pZWl - Circ一 Vector 表达载体成功的表达出目的环形RNA。该环形RNA预计大小为336bp，但由于其环形结构， 在变性的TBE - PAGE胶中迀移速度相对较慢。
[0151] 实施例2pZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达载体的构建及检测
[0152] 在pZWl - Circ一 Vector表达载体基础上，用完全反向互补的两段序列替代原有 的Alu元件，可以更加高效地表达外显子来源的环形RNA，获得更多的环形RNA分子，对经过 此优化的载体，命名为pZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达载体。质粒构 建示意图参见图3。具体实施过程如下：
[0153] 1.实验材料
[0154] 1. 1实验试剂
[0155] 同实施例1中所用试剂。
[0156] 1.2细胞株和载体
[0157] 此例中仍采用人源胚胎干细胞H9细胞系和人源宫颈癌细胞HeLa细胞系，具体可 参见实施例1中1. 2细胞株和载体部分。构建目的质粒所采用的载体为实施例1中所成功 构建的 pZWl - Circ一 Vector 载体。
[0158] 2.实验方法
[0159] 2. lpZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达载体的构建
[0160] 所采用的构建策略仍是Overlap PCR方法。所选用进行替代Alu元件的完全反 向互补序列选自P0LR2A基因的第9、第10外显子上游经分析后选取的内含子区域，长约 300bp，与被替代的Alu元件大小相当，分析过程主要是避开已知的可能含有影响剪接过程 的序列，防止其对产生环形RNA可能产生不利的影响。具体的，
[0161] 2. 1. lOverlap PCR构建原理同实施例1中2. 1. 1所阐述的方法，采用下面表8中 的引物，以及表1中所列引物P0LR2A-Con- 1 一 F (引物1)和P0LR2A-Con- 1 一 R (引物 2)，并用采用高保真PCR体系（PrimeSTAR，Takara)扩增出Overlap PCR所需要的各个目的 片段。
[0162] 表8引物序列
[0163]
[0164]
[0165] 具体的，pZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达载体包含以下五个片 段：第一个片段，包含Nhel酶切位点和所插入反向互补左侧片段序列上游重叠区域；第二 个片段包含所插入反向互补左侧片段序列上、下游重叠区域；第三个片段包含所插入反向 互补左侧片段序列下游和所插入方向互补的右侧片段的上游重叠区域；第四个片段包含所 插入方向互补的右侧片段的上、下游重叠区域；第五个片段包含Mlul酶切位点和所插入方 向互补的右侧片段的下游重叠区域。五个片段之间依次包含相互重叠部分（如图4所示）。
[0166] 进一步的，第一片段以实施例1中构建成功的pZWl - Circ 一 Vector表达载体为模 板，采用引物1、1〇扩增；第二片段以H9细胞基因组为模板，采用引物9、12扩增；第三片段 以实施例1中构建成功的pZWl - Circ一 Vector表达载体为模板，采用引物11、14扩增；第 四片段以H9细胞基因组为模板，采用引物13、16扩增；第五片段以实施例1中构建成功的 pZWl - Circ一 Vector表达载体为模板，采用引物2、15扩增。
[0167] 反应体系和方法参见实施例1中2. 1. 1。
[0168] 将所得的以上5个片段进行回收，加入等摩尔数的5个片段，前五个循环不加引 物，随后加入P0LR2A - Con- 1 一 F (引物1)和P0LR2A - Con- 1 一 R (引物2)再扩增30个 循环后回收产物。
[0169] 然后将PCR产物和pZWl载体进行双酶切、连接、转化（具体参见实施例1中 2. 1.2, 2. 1.3, 2. 1.4)，将转化后鉴定阳性的克隆进行扩增，提取高质量的质粒，并将其命名 为pZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达载体。
[0170] 2. 2高效环形RNA分子表达的验证
[0171] 主要通过Northern Blot的方法进行验证，采用5%的8M尿素变性TBE - PAGE胶。
[0172] 细胞转染、总RNA提取，以及Northern Blot的方法同实施例1 (2. 2, 2. 3, 2. 4)。转 染质粒的量也是lug。Northern Blot上样量仍为4ug。所用探针与实施例1中制备的Dig 标记的探针相同。
[0173] 具体结果如下，可以清晰地看到与野生型（未经过转染的正常状态）、转染pZWl - Circ一 Vector表达载体的样本相比，pZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达 载体所产生的目的条带更深、量更多，从而证明了其产生了更多的环形分子，说明pZWl - Circ一 Vector - High高效环形RNA分子表达载体的构建是成功的。进一步的，通过对胶图 进行灰度扫描分析，本载体环形RNA表达效率约为实施例1中载体的3倍以上，说明本载体 可以更加高效地表达环形RNA。
[0174] 对比例1
[0175] 互换核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High中C1和D1位置的质粒构建及检测
[0176] 为了进一步说明本专利中用于构建RNA环化分子的核酸构建物各结构序列位置 的重要性，将实施例2互换核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High中C1和D1位置互换 (如图5所示），从而检测结构序列位置对环形RNA表达效率的影响。
[0177] 1.实验材料
[0178] 1.1实验试剂
[0179] 同实施例2中所用试剂。
[0180] 1.2细胞株和载体
[0181] 同实施例2中所用细胞株和载体。
[0182] 2.实验方法
[0183] 载体构建及Overlap PCR方法同实施例2,引物设计时仅将实施例2中C1和D1 位置互换，其他序列位置保持不变。
[0184] Northern Blot检测同实施例2。结果显示，相对于实施例2中所构载体，环形RNA 形成效率大幅下降（环形RNA形成效率< 30% )，说明各结构序列位置对于核酸构建物环 形RNA产生效率影响较大。
[0185] 对比例2
[0186] 互换核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High中C2和D2位置的质粒构建及检测
[0187] 为了进一步说明本专利中用于构建RNA环化分子的核酸构建物各结构序列位置 的重要性，将实施例2互换核酸构建物pZWl - Circ一 Vector - High中C2和D2位置互换 (如图6所示），从而检测结构序列位置对环形RNA表达效率的影响。
[0188] 1.实验材料
[0189] 1. 1实验试剂
[0190] 同实施例2中所用试剂。
[0191] 1.2细胞株和载体
[0192] 同实施例2中所用细胞株和载体。
[0193] 2.实验方法
[0194] 载体构建及Overlap PCR方法同实施例2,引物设计时仅将实施例2中C2和D2位 置互换，其他序列位置保持不变。
[0195] Northern Blot检测同实施例2。结果显示，相对于实施例2中所构载体，环形RNA 形成效率大幅下降（环形RNA形成效率< 30% )，说明各结构序列位置对于核酸构建物环 形RNA产生效率影响较大。
[0196] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种用于构建RNA环化分子的核酸构建物，其特征在于，所述的构建物具有式I所示 的从5'至3'的结构： A1-B1-C1-D1-E1-F-B2-C2-D2-E2-A2 (I) 式中， A1和A2共同构成一报告基因； B1为第一 5'剪接位点序列； C1为第一环化配对序列； D1为嘧啶富含区； E1为第一 3'剪接位点序列； F为外源的RNA环化分子的线性序列； B2为第二5'剪接位点序列； C2为第二环化配对序列； D2为嘧啶富含区；和 E2为第二3'剪接位点序列； 其中，第一环化配对序列C1和第二环化配对序列C2为互补序列，且长度100 - 500bp。2. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一环化配对序列含有序列 如SEQ ID NO. : 2所示的核心互补区。3. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一环化配对序列的长度为 200 - 2000bp，较佳地为 300 - 1500bp，更佳地为 500 - lOOObp。4. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的D1和D2的长度各自独立为 20一 100bp 〇5. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的D1的序列如SEQ ID NO. :3。6. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的D2的序列如SEQ ID NO. :7。7. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，第一环化配对序列Cl长度L1和第二 环化配对序列C2的长度L2之比为1 :8至8 :1，较佳地为1 :4至4 :1 ;更佳地为1 :2至2 : 1 (如约 1:1)。8. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的F含有miRNA的海绵序列；和 /或所述的F的长度为100 - 500bp。9. 如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，在A1与F之间序列总长度TL1以及 F与A2之间序列总长度TL2各自独立地为300 - 3000bp，较佳地所述的500 - 2000bp，更佳 地为800- 1200bp ;和/或所述的总长度TL1和总长度TL2之比为5 :1至1:5 ;较佳地为2 : 1 至 1:2〇10. -种在体外非治疗性地产生环形RNA的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求 1 一 9中任一所述的用于构建RNA环化分子的核酸构建物导入真核细胞，从而在所述真核细 胞中产生来源于所述构建物的环形RNA。
【文档编号】C12N15/10GK105985978SQ201510100793
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月6日
【发明人】杨力, 陈玲玲, 张晓鸥, 张杨
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院