诱发微藻细胞自解的活性物质及其制造方法

诱发微藻细胞自解的活性物质及其制造方法
【专利摘要】本发明提供一种诱发微藻细胞自解的活性物质及其制造方法，包括：在培养液中接种一芽胞杆菌(Bacillus)属的菌株，获得菌体悬浮液；将在该菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期，至该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清的状态；以及在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清之后，将该菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，其中该活性溶液中含有诱发微藻细胞自解的活性物质。DSM 2980720141211
【专利说明】
诱发微藻细胞自解的活性物质及其制造方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种诱发微藻细胞自解的活性物质与其制造方法，以及此诱发微藻细 胞自解的活性物质的应用。
【背景技术】
[0002] 为了解决目前全球因过度使用化石能源所造成温室效应及石油利用成本提升的 问题，将生质料源转化为能源方式已被视为取代传统化石燃料的途径之一。而在生质能源 技术开发中，微藻生质柴油是受到瞩目的研究方向。
[0003] 不同于目前产业界主要将微藻应用于食品、保健、生物医药等高价产品，将微藻应 用于生质燃料产业虽然市场规模极大，但产品单价低，对于生产的成本与耗能更加着重。而 要将油脂从微藻细胞中取出作为生质燃料，必需先破坏微藻细胞，但此程序往往是相当耗 能，进而造成成本提尚。
[0004] 在过去的研究中发现，以传统机械力破坏微藻细胞壁需要消耗微藻细胞所含总能 量的约30%，成为微藻生质燃料产业化的一大阻碍。而化学破壁方法因为需使用化学药剂， 所以在生物细胞破坏的同时，也可能造成胞内产物的破坏，而不利于后续产物回收使用，再 者化学破壁也需额外的搅拌动力进而使成本提高。
[0005] 有鉴于传统机械破壁技术处理微藻细胞这类高含水生质物所消耗的能量太大，不 符合生质燃料产业所需，与化学破壁易造成胞内产物破坏且仍需额外搅拌动力，因此目前 亟需一种新颖的低能耗、低成本的微藻破壁技术，以期微藻生质能可迈向市场化。

【发明内容】

[0006] 本发明提供一种诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，包括：在培养液中接 种一芽胞杆菌（Bacillus)属的菌株以获得菌体悬浮液；将在该菌体悬浮液中的芽胞杆菌 属的菌株培养至少至生长稳定期（stationary phase)，至该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬 浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清的状态；以及在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬 浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清之后，将该菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获 得活性溶液，其中该活性溶液中含有诱发微藻细胞自解的活性物质。
[0007] 本发明也提供一种诱发微藻细胞自解的活性物质，其由包括下列步骤的方法所获 得：在培养液中接种一芽胞杆菌属的菌株以获得菌体悬浮液；将在该菌体悬浮液中的芽胞 杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期，至该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集 且该菌体悬浮液变为澄清的状态；以及在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集 且该菌体悬浮液变为澄清之后，将该菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，其中 该活性溶液中含有诱发微藻细胞自解的活性物质。
[0008] 本发明还提供一种诱发微藻细胞自解的方法，包括：将微藻细胞与前述的诱发微 藻细胞自解的活性物质接触，以诱发微藻细胞自解。
[0009] 本发明更提供一种诱发微藻细胞自解的方法，包括：在培养液中接种一芽胞杆菌 属的菌株接种以获得菌体悬浮液；将在该菌体悬浮液中的菌该芽胞杆菌属的菌株培养至少 至生长稳定期；在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄 清之后，将该菌体悬浮液取出；将取出的菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液， 其中该活性溶液中含有诱发微藻细胞自解的活性物质；将该微藻细胞与含该活性溶液混合 以形成一混合液；以及将该混合液静置，以使该微藻细胞自解并沉降。
【附图说明】
[0010] 图 1 显不苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis) ITRI-G1 (2014 年 12 月 11日保藏于德国微生物菌种保藏中心，莱布尼茨研究院DSMZ，Inhoffenstr. 7B，D-38124 Braunschweig，德国，保藏编号：DSM 29807)培养液的蒸馏液与残留液的破胞活性；
[0011] 图2显示不同的本发明活性物质的处理时间对于微藻破胞的影响；
[0012] 图3A显示不同的本发明活性物质的处理时间对于小球藻破胞的影响；
[0013] 图3B显示不同的本发明活性物质的处理时间对于微星藻破胞的影响；
[0014] 图3C显示不同的本发明活性物质的处理时间对于拟球藻破胞的影响；
[0015] 图4A显示冷冻对于本发明诱发微藻细胞自解的活性物质的影响；
[0016] 图4B显示加热对于本发明经冷冻的诱发微藻细胞自解的活性物质的影响；
[0017] 图5显示回收的本发明活性物质对于促进微藻油脂萃取的功效；
[0018] 图6显示测试搅拌对于活性物质诱发微藻破胞的影响的结果；
[0019] 图7显示不同的细菌培养时间所获得的培养液的蒸馏液的微藻破胞效功效；
[0020] 图8显示适用于获得诱发微藻细胞自解的活性物质的减压蒸馏的温度及压力范 围；
[0021] 图9显示本发明的活性物质溶液的高效液相色谱（HPLC)的结果；
[0022] 图10A显示通过将上述高效液相色谱所获得的具有破胞活性的的区段产物进行 气相色谱于第5. 9分钟所获得的样本的质谱分析（mass spectrometry);以及
[0023] 图10B显示通过将上述高效液相色谱所获得的具有破胞活性的的区段产物进行 气相色谱于第8. 5分钟所获得的样本的质谱分析。
【具体实施方式】
[0024] 在本发明一实施例中，本发明提供一种诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方 法。而本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质，具有在微藻细胞内诱发一连串生化反应而 使其自行裂解的功效。
[0025] 于此所叙述的微藻细胞，可为一单细胞藻类微生物，具有细胞壁外壳保护。在 一实施例中，上述微藻细胞的例子可包括，但不限于，小球藻（Chlorella sp.)、拟球藻 (Nannochloropsis sp.)、扁藻（Tetraselmis sp.)、等鞭金藻（Isochrysis galbana)与杜 氏藻（Dunaliella sp.)等。
[0026] 本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，可包括下列步骤，但不限于 此。
[0027] 首先，在培养液中接种一芽胞杆菌（Bacillus)属的菌株以获得菌体悬浮液。
[0028] 上述芽胞杆菌属的菌株的例子可包括，苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis)等，但不限于此。上述苏云金芽胞杆菌可为在台湾食品工业发展研究所生 物资源保存及研究中心保藏的苏云金芽胞杆菌BCRC 14683 (新竹市食品路331號，30061)， 或保藏编号为DSM 29807的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis) ITRI-G1(德国微 生物菌种保藏中心，莱布尼茨研究院DSMZ，Inhoffenstr. 7B, D_38124Braunschweig)。在一 实施例中，于本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法中所使用的芽胞杆菌属的 菌株可为保藏编号为DSM 29807的苏云金芽胞杆菌ITRI-G1。
[0029] 又，上述培养液的成分并无特殊限制。在一实施例中，培养液的成分可包括蛋白胨 与酵母菌提取物等，但不限于此。上述蛋白胨于培养液中的浓度可为约l_5g/L，又，上述酵 母菌提取物于培养液中的浓度可为约〇. 1-0. 5g/L，但不限于此。在一特定实施例中，培养液 的成分可包括2g/L蛋白胨与0. 2g/L酵母菌提取物。
[0030] 接着，将在菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期，至芽胞杆 菌属的菌株于菌体悬浮液中形成聚集且菌体悬浮液变为澄清的状态。在一实施例中，将在 菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养约2-3天，可使芽胞杆菌属的菌株于菌体悬浮液中 形成聚集且菌体悬浮液变为澄清。在一特定实施例中，培养芽胞杆菌属的菌株约2天，可使 芽胞杆菌属的菌株于菌体悬浮液中形成聚集且菌体悬浮液变为澄清。
[0031 ] 又，培养上述芽胞杆菌属的菌株的温度为约20_40°C，但不限于此。在一实施例中， 将上述芽胞杆菌属的菌株培养于28°C。
[0032] 然后，在芽胞杆菌属的菌株于菌体悬浮液中形成聚集且菌体悬浮液变为澄清之 后，将菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，而活性溶液中则含有诱发微藻细胞 自解的活性物质。
[0033] 上述减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约40_90°C，但不限于此。在一实施例中可为约 40 °C、约50 °C、约60 °C、约75 °C或约90 °C。在一特定实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可 为约50°C。又，上述减压蒸馏程序的压力为约65-550hPa，但不限于此。在一实施例中可为 约80hPa、约llOhPa、约210hPa、约295hPa或约490hPa。在一特定实施例中，减压蒸馏程序 的压力可为约llOhPa。
[0034] 在一实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约40_90°C，而减压蒸馏程序的压力 为可约65-550hPa。在另一定实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约40°C，而减压蒸 馏程序的压力为可约65-95hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约50°C，而减压蒸馏程序 的压力为可约105-155hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约60°C，而减压蒸馏程序的压 力为可约175-245hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约75°C，而减压蒸馏程序的压力为 可约245-345hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约90°C，而减压蒸馏程序的压力为可约 430-550hPa。且，在一特定实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约50°C，而减压蒸馏程 序的压力为可约llOhPa。
[0035] 在一实施例中，上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法可进一步 包括，将所获得的活性溶液以高效液相色谱分离出诱发微藻细胞自解的活性物质的步骤。
[0036] 在另一实施例中，上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，可进 一步包括，将所获得的含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液加热，以避免其中的诱 发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性的步骤。活性溶液加热的温度可为约50_90°C， 而在一实施例中为约60°C。又，活性溶液加热的时间可为约2-10小时，而在一实施例中为 约8小时。在一实施例中，活性溶液加热的温度可为约60-80°C，而活性溶液加热的时间可 为约6-8小时。在一特定实施例中，活性溶液加热的温度可为约60、70或80°C，而活性溶液 加热的时间可为约8小时。
[0037] 在另一实施例中，本发明也提供一种诱发微藻细胞自解的活性物质。本发明的诱 发微藻细胞自解的活性物质可通过任何上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制 造方法来获得。
[0038] 在又另一实施例中，本发明还提供一种诱发微藻细胞自解的方法。于此所述本发 明的诱发微藻细胞自解的方法，可包括下列步骤，但不限于此。
[0039] 首先，将微藻细胞与通过任何上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造 方法所获得的诱发微藻细胞自解的活性物质接触，以诱发微藻细胞自解。
[0040] 于此所述的微藻细胞为一单细胞藻类微生物，具有细胞壁外壳保护，例如小球藻、 拟球藻、扁藻、鞭金藻或杜氏藻等。在一实施例中，微藻细胞为新鲜存活状态的微藻细胞。
[0041] 将微藻细胞与本发明诱发微藻细胞自解的活性物质接触的步骤并无特别限制，仅 需使微藻细胞与诱发微藻细胞自解的活性物质实际接触即可，例如，可于含微藻细胞的溶 液中直接添加诱发微藻细胞自解的活性物质本身，或将微藻细胞与含诱发微藻细胞自解的 活性物质的活性溶液混合。
[0042] 而在一实施例中，将微藻细胞与上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质接触 的步骤，可包括，但不限于，将微藻细胞与含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液混合 以形成一混合液，之后将混合液静置或将混合液持续搅拌后静置，以使微藻细胞自解并沉 降。又，微藻细胞可占上述混合液的约4-50wt%，例如10wt%。
[0043]由于本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质，具有诱发微藻细胞内一连串生化反 应而使其自行裂解的功效，且细胞裂解是由细胞内的生化反应所导致，因此诱发微藻细胞 自解的方法对细胞外的搅拌质传需求低，可在低搅拌条件下或甚至不须搅拌下进行。
[0044] 在一实施例中，将微藻细胞与上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质接触的 步骤，可包括，但不限于，将微藻细胞与含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液混合以 形成一混合液，之后将混合液静置，以使微藻细胞自解并沉降。于此实施例中，可将混合物 静置约5-30小时，例如约8、12、24小时。又，混合物的静置温度并无特殊限制。在一实施 例中，可将混合物静置于室温。又，混合物的静置温度并无特殊限制。在一实施例中，可将 混合物静置于室温。
[0045] 在一实施例中，上述本发明的诱发微藻细胞自解的方法，还可进一步包括，在将微 藻细胞与通过任何上述本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法所获得的诱发 微藻细胞自解的活性物质接触之前，先将含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液混合 进行加热，以避免其中的诱发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性。而将含诱发微藻 细胞自解的活性物质的活性溶液加热的温度可为约50-90°C，例如，60°C，但不限于此。又， 将含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液加热的时间可为约2-10小时，例如，8小时， 但不限于此。在一实施例中，活性溶液加热的温度为约60-80°C，而加热的时间为约6-8小 时。在一特定实施例中，活性溶液加热的温度为约60、70或80°C，而加热的时间为约8小 时。
[0046] 在另一实施例中，上述本发明的诱发微藻细胞自解的方法，可进一步包括，在微藻 细胞自解并沉降之后，回收上述混合液的上清液，以回收于上清液中的诱发微藻细胞自解 的活性物质。
[0047] 于此实施例中，还可进一步包括，将所回收的上清液进行加热，以避免其中的诱发 微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性的步骤。而将含将所回收的上清液加热的温度可 为约50-90°C，例如，60°C，但不限于此。又，将所回收的上清液加热的时间可为约2-10小 时，例如，8小时，但不限于此。在一实施例中，将所回收的上清液加热的温度为约60-80°C， 而加热的时间为约6-8小时。在一特定实施例中，将所回收的上清液加热的温度为约60、70 或80°C，而加热的时间为约8小时。
[0048] 在又另一实施例中，本发明更提供另一种诱发微藻细胞自解的方法。于此所述本 发明的诱发微藻细胞自解的方法，可包括，但不限于下方所述的步骤。
[0049] 首先，在培养液中接种一芽胞杆菌属的菌株接种以获得菌体悬浮液。
[0050] 适用于此所述的本发明诱发微藻细胞自解的方法中使用的芽胞杆菌属的菌株，可 包括，但不限于，苏云金芽胞杆菌。上述苏云金芽胞杆菌的例子可包括，苏云金芽胞杆菌 BCRC 14683与保藏编号为DSM 29807的苏云金芽胞杆菌ITRI-G1等，但不限于此。在一实 施例中，于本发明的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法中所使用的芽胞杆菌属的菌 株，可为保藏编号为DSM 29807的苏云金芽胞杆菌ITRI-G1。
[0051] 而，适合在于此所述的本发明诱发微藻细胞自解的方法中使用的培养液并无特殊 限制。在一实施例中，于此所述的本发明诱发微藻细胞自解的方法中所使用的培养液为适 合芽胞杆菌属的菌株生长的培养液。在另一实施例中，培养液的成分可包括蛋白胨与酵母 菌提取物等，但不限于此。上述蛋白胨于培养液中的浓度可为约l_5g/L，又，上述酵母菌提 取物于培养液中的浓度可为约〇. 1-0. 5g/L，但不限于此。在一特定实施例中，培养液的成分 可包括2g/L蛋白胨与0. 2g/L酵母菌提取物。
[0052] 然后，将在菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期，至芽胞杆 菌属的菌株于菌体悬浮液中形成聚集且菌体悬浮液变为澄清的状态。在一实施例中，将在 菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养约2-3天，可使芽胞杆菌属的菌株于菌体悬浮液中 形成聚集且菌体悬浮液变为澄清。在一特定实施例中，培养芽胞杆菌属的菌株约2天，可使 芽胞杆菌属的菌株于菌体悬浮液中形成聚集且菌体悬浮液变为澄清。又，培养芽胞杆菌属 的菌株的温度为约20-40°C，例如约28°C，但不限于此。
[0053] 再来，在芽胞杆菌属的菌株于菌体悬浮液中形成聚集且菌体悬浮液变为澄清之 后，将菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，而活性溶液中则含有诱发微藻细胞 自解的活性物质。
[0054] 适合获得上述活性溶液的减压蒸馏程序所采用的蒸馏温度与压力，如下所述。减 压蒸馏程序的蒸馏温度可为约40-90°C，例如约40°C、约50°C、约60°C、约75°C、约90°C等， 但不限于此，在一实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约50°C。又，上述减压蒸馏程序 的压力为可约65-550hPa，例如在一实施例中可为约80hPa、约110hPa、约210hPa、约295hPa 或约550hPa。在一特定实施例中，减压蒸馏程序的压力可为约llOhPa。
[0055] 在一实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约40_90°C，而减压蒸馏程序的压力 为可约65-550hPa。在另一定实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约40°C，而减压蒸 馏程序的压力为可约65-95hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约50°C，而减压蒸馏程序 的压力为可约105-155hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约60°C，而减压蒸馏程序的压 力为可约175-245hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约75°C，而减压蒸馏程序的压力为 可约245-345hPa，或减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约90°C，而减压蒸馏程序的压力为可约 430-550hPa。且，在一特定实施例中，减压蒸馏程序的蒸馏温度可为约50°C，而减压蒸馏程 序的压力为可约llOhPa。
[0056] 接着，将微藻细胞与含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液混合以形成一混 合液。微藻细胞可占上述混合液的约4_50wt %，例如10wt %。于此所述的微藻细胞为单细 胞藻类微生物，具有细胞壁外壳保护，例如小球藻、拟球藻、扁藻、等鞭金藻、杜氏藻等。在一 实施例中，微藻细胞为新鲜存活状态的微藻细胞。
[0057] 最后，将混合液静置，以使微藻细胞自解并沉降。可将上述混合液静置约5-30小 时，例如约8、12与24小时。在一实施例中，将上述混合液静置约8-24小时。在一特定实 施例中，则将上述混合液静置约8、12或24小时。
[0058] 又，在一实施例中，于此所述的本发明诱发微藻细胞自解的方法，可进一步包括， 在将微藻细胞与前述活性溶液混合之前，将所获得的活性溶液以高效液相色谱分离出诱发 微藻细胞自解的活性物质的步骤。
[0059] 另外，在一实施例中，于此所述的本发明的诱发微藻细胞自解的方法，可进一步包 括，在将微藻细胞与前述活性溶液混合之前，先将前述活性溶液混合进行加热，以避免其中 的诱发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性。
[0060] 而将含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液加热的温度可为约50-90°C，例 如，60°C，但不限于此。又，将含诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液加热的时间可为 约2-10小时，例如，8小时，但不限于此。在一实施例中，活性溶液加热的温度为约60-80°C， 而加热的时间为约6-8小时。在一特定实施例中，活性溶液加热的温度为约60、70或80°C， 而加热的时间为约8小时。
[0061] 此外，在另一实施例中，于此所述的本发明的诱发微藻细胞自解的方法，也可进一 步包括，在微藻细胞自解并沉降之后，回收上述混合液的上清液，以回收于上清液中的诱发 微藻细胞自解的活性物质。
[0062] 而于此实施例中，还可进一步包括，将所回收的上清液进行加热，以避免其中的诱 发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性的步骤。而将含将所回收的上清液加热的温度 可为约50-90°C，例如，60°C，但不限于此。又，将所回收的上清液加热的时间可为约2-10小 时，例如，8小时，但不限于此。在一实施例中，将所回收的上清液加热的温度为约60-80°C， 而加热的时间为约6-8小时。在一特定实施例中，将所回收的上清液加热的温度为约60、70 或80°C，而加热的时间为约8小时。
[0063] 通过本发明的诱发微藻细胞自解的方法，可只需将微藻细胞与含诱发微藻细胞自 解的活性物质的活性溶液混合后静置，而不须进行搅拌及/或其他处理，即可完成微藻细 胞的破胞。
[0064] 又，于微藻细胞破胞完成后，于本发明的诱发微藻细胞自解的方法中所使用的诱 发微藻细胞自解的活性物质，也能轻易地被回收并继续使用。因此，由此可知，本发明的诱 发微藻细胞自解的方法具有操作容易、节省能源与降低成本等多重优点，为一种新颖的低 耗能、低成本、可回收的微藻细胞破胞方法。
[0065] 实施例
[0066] 实施例1、诱发微藻细胞自解的活性物质的挥发性质的确认
[0067] 1.苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis) ITRI-G1 (保藏编号 DSM29807,德 国微生物菌种保藏中心，莱布尼茨研究院DSMZ，Inhoffenstr. 7B, D_38124Braunschweig) 的培养液的处理
[0068] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0069] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0070] 培养液：2g/L蛋白胨+0· 2g/L酵母菌提取物
[0071] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0072] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，取300mL的培养液进行减压蒸馏程序。在 不同蒸馏时间收集残留液（未挥发部分），并于蒸馏2小时之时收集所有蒸馏液，减压蒸馏 的条件如下所示：
[0073] 蒸馏温度：50°C
[0074] 压力：110hPa
[0075] 时间：2小时
[0076] 2.小球藻的破胞测试
[0077] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着将上方所得的残 留液或蒸馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于悬浮液的浓度为约l〇g/L。
[0078] 然后，测定悬浮液的280nm吸光值，以评估小球藻因细胞壁破坏而释出的蛋白质 的量。结果如图1所示。
[0079] 根据图1可明确得知，随蒸馏时间增加，残留液的破胞活性越来越低，至蒸馏2小 时之时，残留液几乎完全没有破胞活性。相对地，蒸馏液则显示相当高的破胞活性。
[0080] 故，由上述可知，苏云金芽胞杆菌ITRI-G1所产生的诱发微藻细胞自解的活性物 质完全挥发且存在于蒸馏液中。
[0081] 实施例2、通过诱发微藻细胞自解的活性物质的小球藻的破胞测试
[0082] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0083] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0084] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0085] 培养液：2g/L蛋白胨+0· 2g/L酵母菌提取物
[0086] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0087] (2)诱发微藻细胞自解的活性物质的分离纯化
[0088] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，取300mL的培养液通过减压蒸馏程序进 行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如下所示：
[0089] 蒸馏温度：50°C
[0090] 压力：110hPa
[0091] 时间：2小时。
[0092] 2.小球藻的破胞
[0093] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着将上方所得的蒸 馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于悬浮液的浓度为约l〇g/L。
[0094] 然后，于不同时间点取出部分悬浮液以测定悬浮液的280nm吸光值，以评估小球 藻因细胞壁破坏而释出的蛋白质的量。结果如图2所示，其中测试1与测试2为重复实验。
[0095] 根据图2可明确得知，上方所获得的蒸馏液，的确可使微藻破胞自解。
[0096] 实施例3、诱发微藻细胞自解的活性物质对于不同微藻的破胞功效
[0097] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0098] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1与苏云金芽胞杆菌BCRC 14683 (购自台湾食品工业 发展研究所生物资源保存及研究中心）的培养
[0099] 分别将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1与苏云金芽胞杆菌BCRC 14683以下方所示的培 养液与培养条件进行培养
[0100] 培养液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0101] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0102] (2)诱发微藻细胞自解的活性物质的分离纯化
[0103] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1或苏云金芽胞杆菌BCRC 14683培养完成后，取300mL 的培养液通过减压蒸馏程序进行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如 下所示：
[0104] 蒸馏温度：50 °C
[0105] 压力：110hPa
[0106] 时间：2小时。
[0107] 2.微藻的破胞
[0108] 将新鲜的微藻调配为浓度为约150g/L的微藻悬浮液。接着将上方所得的蒸馏液 添加至微藻悬浮液中（控制组为将水添加至微藻悬浮液中），至微藻于悬浮液的浓度为约 5g/L。之后将悬浮液静置24小时。获自苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养液的蒸馏液所测 试的微藻种类包括小球藻、微星藻以及拟球藻，而获自苏云金芽胞杆菌BCRC 14683的培养 液的蒸馏液所测试的微藻种类则包括小球藻以及微星藻。
[0109] 然后，于不同时间点取出部分悬浮液以测定悬浮液的280nm吸光值，以评估微藻 因细胞壁破坏而释出的蛋白质的量。存在于蒸馏液中的诱发微藻细胞自解的活性物质对于 小球藻、微星藻以及拟球藻的破胞功效分别结果如图3A、3B与3C所示。
[0110] 根据图3A、3B与3C可知，存在于蒸馏液中的诱发微藻细胞自解的活性物质对于小 球藻、微星藻以及拟球藻皆具有破胞效果。
[0111] 实施例4、诱发微藻细胞自解的活性物质在冷冻后与冷冻后加热的功效评估
[0112] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0113] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0114] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0115] 培养液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0116] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0117] (2)诱发微藻细胞自解的活性物质的分离纯化
[0118] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，取300mL的培养液通过减压蒸馏程序进 行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如下所示：
[0119] 蒸馏温度：50°C
[0120] 压力：110hPa
[0121] 时间：2小时。
[0122] (3)诱发微藻细胞自解的活性物质的冷冻与冷冻后加热
[0123] 将上述蒸馏液（活性物质溶液）置于-20°C以不同时间长度进行冷冻，且之后将其 取出于室温解冻。
[0124] 将冷冻达72小时的蒸馏液（活性物质溶液），解冻后置于60°C、70°C或80°C高温 水浴8小时。
[0125] (4)小球藻的破胞
[0126] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着将上方所得的经 冷冻的蒸馏液或经冷冻后加热的蒸馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于悬浮液的浓度 为约l〇g/L。
[0127] 然后，于不同时间点取出部分悬浮液以测定悬浮液的280nm吸光值，以评估小球 藻因细胞壁破坏而释出的蛋白质的量。经冷冻的蒸馏液或经冷冻后加热的蒸馏液的破胞功 效分别如图4A与4B所不。
[0128] 根据图4A与4B可知，随冷冻时间增加，蒸馏液破胞活性逐渐减少，至冷冻达72小 时，蒸馏液几乎不具破胞活性。相对地，当将经冷冻的蒸馏液再进行加热，则蒸馏液的活性 可恢复至约70% (相较于未经冷冻的蒸馏液的破胞活性（未显示））。
[0129] 故，根据上述可知，冷冻会使存在于蒸馏液中的诱发微藻细胞自解的活性物质失 活，而相对地，加热可恢复存在于蒸馏液中的诱发微藻细胞自解的活性物质的活性。
[0130] 实施例5、通过活性物质所诱发的微藻破胞的微藻内油脂萃取与回收的活性物质 的功效测试
[0131] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0132] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0133] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0134] 培养液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0135] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0136] (2)诱发微藻细胞自解的活性物质的分离纯化
[0137] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，取300mL的培养液通过减压蒸馏程序进 行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如下所示：.
[0138] 蒸馏温度：50°C
[0139] 压力：110hPa
[0140] 时间：2小时。
[0141] 2.小球藻的破胞
[0142] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着将上方所得的蒸 馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于悬浮液的浓度为约l〇g/L。之后将悬浮液静置24 小时。
[0143] 3.小球藻内的油脂萃取
[0144] 于悬浮液静置24小时后，将悬浮液离心，获得小球藻的藻体。之后对小球藻进行 油脂萃取，并进行脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester, FAME)分析，以测定油脂含量。
[0145] 4.活性物质的回收
[0146] 于悬浮液静置24小时后，将悬浮液离心，取得上清液。然后将300mL的上清液通 过减压蒸馏程序进行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如下所示：
[0147] 蒸馏温度：50°C
[0148] 压力：110hPa
[0149] 时间：2小时。
[0150] 5.回收的活性物质的功效测试
[0151] 依照前述微藻破破胞方法以回收步骤中所获得的蒸馏溶液进行微藻破胞，且于微 藻破胞后以前述相同方式分析微藻油脂含量并再次回收活性物质。将活性物质重复回收与 使用，并测定微藻破胞后的油脂含量达四次。结果如图5所示。
[0152] 根据图5可知，活性物质具有诱发微藻破胞并促进油脂萃取的功效，且，活性物质 使用后可被回收并继续用于使微藻破胞，但其活性会略有下降。
[0153] 实施例6、搅拌对于活性物质诱发微藻破胞的影响
[0154] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0155] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0156] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0157] 培养液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0158] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0159] (2)诱发微藻细胞自解的活性物质的分离纯化
[0160] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，取300mL的培养液通过减压蒸馏程序进 行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如下所示：.
[0161] 蒸馏温度：50°C
[0162] 压力：110hPa
[0163] 时间：2小时。
[0164] 2.小球藻的破胞
[0165] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着将上方所得的蒸 馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于悬浮液的浓度为约10 g / L。之后，将悬浮液静置 (不搅拌），或将悬浮液以lOOrpm进行水平震荡。
[0166] 然后，于不同时间点取出部分悬浮液以测定悬浮液的280nm吸光值，以评估小球 藻因细胞壁破坏而释出的蛋白质的量。结果如图6所示。
[0167] 根据图6可明确得知，无搅拌条件下可在12-16小时完成破胞。又，相较于搅拌处 理，无搅拌条件下活性物质的微藻破胞效率较佳，不论是起始的破胞速率或最后的破胞率， 无搅拌条件下活性物质的微藻破胞效率都较lOOrpm搅拌条件下高出近100%。
[0168] 实施例7、不同的细菌培养时间所获得的培养液的蒸馏液的微藻破胞效功效测试
[0169] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0170] (1)不同培养时间的苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0171] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0172] 培养液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0173] 培养条件：
[0174] (i)在150rpm的震荡速率下，以28°C培养1天；
[0175] (ii)在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0176] (2)减压蒸馏
[0177] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，取300mL的培养液通过减压蒸馏程序进 行分离纯化，并获得l〇〇mL的蒸馏溶液。减压蒸馏的条件如下所示：
[0178] 蒸馏温度：50°C
[0179] 压力：110hPa
[0180] 时间：2小时。
[0181] 2.小球藻的破胞
[0182] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着将上方所得的蒸 馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于悬浮液的浓度为约l〇g/L。之后将悬浮液静置24 小时。
[0183] 3.小球藻内的油脂萃取
[0184] 于悬浮液静置24小时后，将悬浮液离心，获得小球藻的藻体。之后对小球藻进行 油脂萃取，并进行脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester, FAME)分析，以测定油脂含量以 此评估小球藻破胞情况。不同的细菌培养时间所获得的活性物质的微藻破胞效果，如图7 所示。
[0185] 图7显示，来自通过培养苏云金芽胞杆菌ITRI-G1菌株1天至对数生长期末期所 获得的培养液的蒸馏液，并无明显破胞能力，而来自通过培养苏云金芽胞杆菌ITRI-G1菌 株2天所获得的培养液的蒸馏液则具有明显的破胞能力。
[0186] 因此，由上述可知，苏云金芽胞杆菌ITRI-G1菌株应于生长稳定期之后才会开始 分泌诱发微藻细胞自解的活性物质。
[0187] 实施例8、以不同方式破胞的微藻的含水率
[0188] 将未经破胞的小球藻悬浮液、经实施例1的方法破胞的小球藻悬浮液，以及经机 械破胞（球磨15分钟破胞）的小球藻悬浮液，分别以500rpm离心15分钟，之后取浓缩藻 泥测试其含水率。结果如表1所示。
[0189] 表1、以不同方式破胞的微藻的含水率
[0190]
[0191] 表1显示，以实施例1的方法破胞的微藻的含水率与未破胞的微藻的含水率相近， 而经机械破胞的微藻的含水率较高。
[0192] 而破胞后的微藻含水率越低，代表所使用的破胞方法使破胞后的微藻具有较佳的 脱水性。微藻的脱水性佳，则代表容易回收破胞的微藻所释放出的物质与用以破胞的活性 物质。
[0193] 因此，根据表1所示的结果可知，相较于机械破胞，以实施例2的方法破胞，可使破 胞的微藻具有较佳的脱水性，且较易回收微藻所释放出的物质与用以破胞的活性物质。
[0194] 实施例9、适用于获得诱发微藻细胞自解的活性物质的减压蒸馏的温度及压力范 围测定
[0195] 1.诱发微藻细胞自解的活性物质的制备
[0196] (1)苏云金芽胞杆菌ITRI-G1的培养
[0197] 将苏云金芽胞杆菌ITRI-G1以下方所示的培养液与培养条件进行培养
[0198] 培养液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0199] 培养条件：在150rpm的震荡速率下，以28°C培养2天
[0200] (2)诱发微藻细胞自解的活性物质的分离纯化
[0201] 于苏云金芽胞杆菌ITRI-G1培养完成后，将培养液在不同温度下，以不同的压力 分别进行减压蒸馏，并测得各温度的水沸腾压力。
[0202] 2.微藻的破胞与活性物质挥发界线压力评估
[0203] 将新鲜的小球藻调配为浓度为约150g/L的小球藻悬浮液。接着分别将上方所述 以不同温度不同压力的减压蒸馏所获得的不同蒸馏液添加至小球藻悬浮液中，至小球藻于 悬浮液的浓度为约l〇g/L。然后将悬浮液静置8小时。
[0204] 然后，测定以各不同蒸馏液处理的悬浮液的280nm吸光值，以评估小球藻的细胞 壁是否被破坏，并进而得知活性物质在各温度下的最大挥发压力（蒸馏压力界线）。结果如 表2与图8所示。
[0205] 表 2
[0206]
[0207] 根据图8可知，适用于获得诱发微藻细胞自解的活性物质的减压蒸馏的温度及压 力范围由在活性物质最大发挥压力与水沸腾压力之间的灰色区域所表示。
[0208] 实施例10、活性物质溶液的高效液相色谱（HPLC)
[0209] (1)高效液相色谱
[0210] 将实施例1的方法中所获得的蒸馏液进行高效液相色谱，而高效液相色谱的条件 如下所示：
[0211] 高效液相色谱的条件
[0212] (a)柱：Jupiter'。5m C4 柱（lOOx 4. 6mm)，Phenomenex ;
[0213] (b)检测波长：214nm ;
[0214] (c)溶剂
[0215] 溶剂 A:0.1%TFA
[0216] 溶剂 B: 0· 1 % TFA+10 % CH3CN
[0217] 溶剂 C: 0· 1 % TFA+90 % CH3CN
[0218] (d)流速：lml/ 分钟
[0219] (e)高效液相色谱梯度程序：如下方表3所示。
[0220] 表3、高效液相色谱梯度程序
[0221]
[0222] 之后，收集由高效液相色谱所获得的各区段（不同时间点）的产物。又，活性物质 溶液的高效液相色谱的结果如图9所示。
[0223] (2)确认活性物质所存在的活性溶液高效液相色谱的产物区段
[0224] 上方所述各区段的产物添加至小球藻悬浮液中（添加浓度约10wt% )并静置8小 时。
[0225] 然后，测定以各区段的产物处理的悬浮液的280nm吸光值，以观察小球藻的细胞 壁是否被破坏并确认活性物质所谓于的区段。结果显示，活性物质分布在11. 5-13分钟之 间的区段产物中（图9中的黑色方框区域）。
[0226] 实施例11、活性物质的气相色谱质谱分析（GC-MS)
[0227] 将通过高效液相色谱所获得的具有破胞活性的在11. 5-13分钟之 间的区段产物（图9中的黑色方框区域）以60 °C加热，并进行固相微萃取 (solid phase microextractior^SPMEMDVB/CAR/FOMS 纤维（fibers)为获自 Supelco (Bellefonte，PA, USA))。
[0228] 之后，固相微萃取的产物进行气相色谱质谱分析。气相色谱质谱分析的条件如下 所示：
[0229] 气相色谱质谱分析的条件：
[0230] Agilent 6890 气相色谱仪
[0231] 极性键合相（polar bonded phase)BPX-5 融合（fused)娃毛细管（silica capillary column)，长 25m，内径 0· 22mm，薄膜厚度 0· 25 μ m(SGE, Melbourne, Australia)。
[0232] 电子撞击界面化（El interfaced)至Agilent 5973四极柱式质谱仪（quadrupole mass spectrometer)〇
[0233] NIST 11 质谱数据库（spectra library)
[0234] 将柱的温度程序化为以15 °C /分钟，从50 °C (维持1分钟）至250 °C (维持5分 钟）。
[0235] 将氦气以0. 6ml/分钟的固定流速使用为载体气体。
[0236] 不分流进样器（splitless injector)的温度为 270°C。
[0237] 传输管线（transfer line)的温度为 250°C 〇
[0238] 离子源（ion source)与四极柱（quadrupole)的温度维持于230°C与150°C。
[0239] 离子化（ionization)以70eV的撞击电子（impacting electron)的动能来发生。 通过在m/z在10-600的质量范围进行自动扫描（automatic scanning)以获得质谱图（Mass spectra)〇
[0240] 将前方所述由高效液相色谱所获得的具有破胞活性的的区段产物，进行气相色谱 质谱分析，并于第5. 9分钟与8. 5分钟各获得一个可能与破胞活性有关的物质。接着，将前 述分别于第5. 9分钟与8. 5分钟所获得的可能与破胞活性有关的物质进行质谱分析，其质 谱分析结果分别如图10A与图10B所示。
【主权项】
1. 一种诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，包括： 在培养液中接种一芽胞杆菌属的菌株以获得菌体悬浮液； 将在该菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期，至该芽胞杆菌属的 菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清的状态；以及 在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清之后，将 该菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，其中该活性溶液中含有诱发微藻细胞 自解的活性物质。2. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该芽胞杆菌 属的菌株包括苏云金芽胞杆菌。3. 根据权利要求2所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该苏云金 芽胞杆菌包括苏云金芽胞杆菌BCRC 14683或保藏编号为DSM29807的苏云金芽胞杆菌 ITRI-Gl〇4. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该培养液的 成分包括蛋白胨与酵母菌提取物。5. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中培养在该菌 体悬浮液中的该菌该芽胞杆菌属的菌株约2-3天以至少至生长稳定期。6. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中培养该芽胞 杆菌属的菌株的温度为约20-40°C。7. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中培养该芽胞 杆菌属的菌株的温度为约28°C。8. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该减压蒸馏 程序的蒸馏温度为约40-90°C。9. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该减压蒸馏 程序的蒸馏温度为约50 °C。10. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该减压蒸 馏程序的压力为约65-550hPa。11. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该减压蒸 馏程序的压力为约llOhPa。12. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，其中该减压蒸 馏程序的蒸馏温度为约50°C，而该减压蒸馏程序的压力为约llOhPa。13. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，进一步包括，将 该活性溶液以高效液相色谱分离出该诱发微藻细胞自解的活性物质。14. 根据权利要求1所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，进一步包括，将 该活性溶液加热，以避免其中的诱发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性。15. 根据权利要求14所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，该活性溶液加 热的温度为约50-90 °C。16. 根据权利要求14所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，该活性溶液加 热的温度为约60、70或80 °C。17. 根据权利要求14所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，该活性溶液加 热的时间为约2-10小时。18. 根据权利要求14所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，该活性溶液加 热的时间为约8小时。19. 一种诱发微藻细胞自解的活性物质，由包括下列步骤的一方法所获得： 在培养液中接种一芽胞杆菌属的菌株接种以获得菌体悬浮液； 将在该菌体悬浮液中的芽胞杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期，至该芽胞杆菌属的 菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清的状态；以及 在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清之后，将 该菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，其中该活性溶液中含有诱发微藻细胞 自解的活性物质。20. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该芽胞杆菌属的菌株 包括苏云金芽胞杆菌。21. 根据权利要求20所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该苏云金芽胞杆菌包 括苏云金芽胞杆菌BCRC 14683或保藏编号为DSM 29807的苏云金芽胞杆菌ITRI-G1。22. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该培养液的成分包括 蛋白胨与酵母菌提取物。23. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中培养在该菌体悬浮液 中的该菌该芽胞杆菌属的菌株约2-3天以达生长稳定期之后。24. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中培养该芽胞杆菌属的 菌株的温度为约20-40 °C。25. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该减压蒸馏程序的蒸 馏温度为约40-90 °C。26. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该减压蒸馏程序的压 力为约 65_55〇hPa。27. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该减压蒸馏程序的蒸 馏温度为约50°C，而该减压蒸馏程序的压力为约llOhPa。28. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该方法进一步包括， 将该活性溶液以高效液相色谱分离出该诱发微藻细胞自解的活性物质。29. 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，其中该方法进一步包括， 将该活性溶液加热，以避免其中的该诱发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性。30. 根据权利要求29所述的诱发微藻细胞自解的活性物质，该活性溶液加热的温度为 约50-90°C，而加热的时间为约2-10小时。31. -种诱发微藻细胞自解的方法，包括： 将微藻细胞与根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质接触，以诱发微 藻细胞自解。32. 根据权利要求31所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中将微藻细胞与根据权利要 求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质接触的步骤包括： 将该微藻细胞与含该诱发微藻细胞自解的活性物质的该活性溶液混合以形成一混合 液；以及 将该混合液静置或将该混合液持续搅拌后静置，以使该微藻细胞自解并沉降。33. 根据权利要求32所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该微藻细胞占该混合液的 约 4_50wt %。34. 根据权利要求31所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中将微藻细胞与根据权利要 求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质接触的步骤包括： 将该微藻细胞与含该诱发微藻细胞自解的活性物质的活性溶液混合以形成一混合液； 以及 将该混合液静置，以使该微藻细胞自解并沉降。35. 根据权利要求34所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中将该混合液静置约5-30小 时。36. 根据权利要求34所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中将该混合液静置于室温。37. 根据权利要求31所述的诱发微藻细胞自解的方法，进一步包括，在将微藻细胞与 根据权利要求19所述的诱发微藻细胞自解的活性物质接触之前，先将含该诱发微藻细胞 自解的活性物质的该活性溶液混合进行加热，以避免其中的该诱发微藻细胞自解的活性物 质聚集而降低活性。38. 根据权利要求37所述的诱发微藻细胞自解的方法，将含该诱发微藻细胞自解的活 性物质的该活性溶液加热的温度为约50-90°C，而加热的时间为约2-10小时。39. 根据权利要求33所述的诱发微藻细胞自解的方法，进一步包括，在该微藻细胞沉 降之后，回收该混合液的上清液，以回收于该上清液中的该诱发微藻细胞自解的活性物质。40. 根据权利要求39所述的诱发微藻细胞自解的方法，进一步包括，将该上清液进行 加热，以避免其中的诱发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性。41. 根据权利要求40所述的诱发微藻细胞自解的活性物质的制造方法，该上清液加热 的温度为约50-90°C，而加热的时间为约2-10小时。42. 根据权利要求31所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中微藻细胞为一单细胞藻类 微生物，具有细胞壁外壳保护。43. 根据权利要求31所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该微藻细胞为新鲜存活状 态的微藻细胞。44. 根据权利要求31所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该微藻细胞包括小球藻 (Chlorella sp·)、拟球藻（Nannochloropsis sp·)、扁藻（Tetraselmis sp·)、等鞭金藻 (Isochrysis galbana)或杜氏藻（Dunaliella sp. ) 〇45. -种诱发微藻细胞自解的方法，包括： 在培养液中接种一芽胞杆菌属的菌株接种以获得菌体悬浮液； 将在该菌体悬浮液中的菌该芽胞杆菌属的菌株培养至少至生长稳定期之后； 在该芽胞杆菌属的菌株于该菌体悬浮液中形成聚集且该菌体悬浮液变为澄清之后，将 该菌体悬浮液取出； 将取出的菌体悬浮液进行减压蒸馏程序，以获得活性溶液，其中该活性溶液中含有诱 发微藻细胞自解的活性物质； 将该微藻细胞与含该活性溶液混合以形成一混合液；以及 将该混合液静置，以使该微藻细胞自解并沉降。46. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该芽胞杆菌属的菌株包括 苏云金芽胞杆菌。47. 根据权利要求46所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该苏云金芽胞杆菌包括苏 云金芽胞杆菌BCRC 14683或保藏编号为DSM 29807的苏云金芽胞杆菌ITRI-G1。48. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该培养液的成分包括蛋白 胨与酵母菌提取物。49. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中培养在该菌体悬浮液中的 该菌该芽胞杆菌属的菌株约2-3天以达该生长稳定期之后。50. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中培养该芽胞杆菌属的菌株 的温度为约20-40 °C。51. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该减压蒸馏程序的蒸馏温 度为约40-90 °C。52. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该减压蒸馏程序的压力为 约 65-550hPa。53. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该微藻细胞占该混合液的 约 4_50wt %。54. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中将该混合液静置约5-30小 时。55. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中其中将该混合液静置于室 温。56. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，进一步包括，在将该微藻细胞 与该活性溶液混合之前，先将该活性溶液混合进行加热，以避免其中的该诱发微藻细胞自 解的活性物质聚集而降低活性。57. 根据权利要求56所述的诱发微藻细胞自解的方法，该活性溶液加热的温度为约 50-90°C，加热的时间为约2-10小时。58. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，进一步包括，在该微藻细胞沉 降之后，回收该混合液的上清液，以回收于该上清液中的该诱发微藻细胞自解的活性物质。59. 根据权利要求58所述的诱发微藻细胞自解的方法，进一步包括，将该上清液进行 加热，以避免其中的诱发微藻细胞自解的活性物质聚集而降低活性。60. 根据权利要求59所述的诱发微藻细胞自解的方法，该上清液加热的温度为约 50-90°C，加热的时间为约2-10小时。61. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中微藻细胞为一单细胞藻类 微生物，具有细胞壁外壳保护。62. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该微藻细胞为新鲜存活状 态的微藻细胞。63. 根据权利要求45所述的诱发微藻细胞自解的方法，其中该微藻细胞包括小球藻、 拟球藻、扁藻、等鞭金藻或杜氏藻。
【文档编号】C12R1/89GK105985986SQ201510085027
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月17日
【发明人】白明德, 韩忠正, 卢文章, 万皓鹏, 张嘉修, 陈俊延, 张馨月
【申请人】财团法人工业技术研究院