一种生物法制备脂肪醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物法制备脂肪醇的方法。本发明首次揭示一种用生物法来催化脂肪酸或脂肪酸甲酯生成脂肪醇的方法，该方法适用于饱和脂肪醇及不饱和脂肪醇的制备，且特别有利于降低不饱和脂肪酸的生产成本。
【专利说明】
一种生物法制备脂肪醇的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工领域，更具体地，本发明涉及一种生物法制备脂肪醇的方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪醇是具有8至22个碳原子链的脂肪族的醇类，有些脂肪醇为不饱和脂肪醇。 脂肪醇在自然界中并不大量存在，因此，需要利用人工方法进行合成，以满足其工业应用所 需。
[0003] 目前，不饱和脂肪醇是通过化学法来合成的，由于C = C不饱和双键的存在，利用 化学法来还原羧酸到醇需要用到一些贵重的金属催化剂，而且选择性并不是很好。因此，本 领域还需要发掘一些新的制备不饱和脂肪醇的方法，以降低成本，提高制备效率。
[0004] 现有技术中，用生物法来选择性还原不饱和脂肪酸的相关方法目前还没有报导。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种生物法制备脂肪醇的方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种制备脂肪醇的方法，所述方法包括：以脂肪酸为底 物，利用羧酸还原酶将脂肪酸转化为脂肪醛；利用醛还原酶将脂肪醛转化为脂肪醇。
[0007] 在一个优选例中，所述的脂肪酸如下获得：以脂肪酸酯为底物，利用酯水解酶将脂 肪酸酯转化为脂肪酸。
[0008] 在另一优选例中，所述的脂肪酸酯包括（但不限于）：脂肪酸甲酯，脂肪酸乙酯，月旨 肪酸丙酯，脂肪酸丁酯等；较佳地为脂肪酸甲酯。
[0009] 在另一优选例中，所述的羧酸还原酶包括：MsCAR，MmCAR (Mycobacterium marinum,UniProt accession number B2HN69)，NsCAR(Nocardia sp. NRRL 5646)；
[0010] 所述的醛还原酶包括：AlrA 或 YjgB(E. coli，AAC77226)
[0011] 所述的酯水解酶包括：CALB，HDE，Lc α E7, BioH，YbaC 或 TesA。
[0012] 在另一优选例中，所述的羧酸还原酶、醛还原酶、酯水解酶是重组表达的酶。
[0013] 在另一优选例中，所述的方法还包括：利用EntD或Sfp(phosphopantetheine transferase，磷酸泛酰疏基乙胺转移酶；其中，EntD基因来自于大肠杆菌Escherichia coli，sfp基因来自于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)促进羧酸还原酶的活性。
[0014] 在另一优选例中，所述的MsCAR具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；和/或
[0015] 所述的AlrA具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；和/或
[0016] 所述的Lc α E7具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列或SEQ ID N0:6中第33-570 位所示的氨基酸序列；优选地是氨基酸序列如SEQ ID N0:6中第33-570位所示的截短体； 和/或
[0017] 所述的EntD具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。
[0018] 在另一优选例中，羧酸还原酶的表达盒、醛还原酶的表达盒被串联于一个表达质 粒中；$父佳地，该表达质粒中还串联有酯水解酶的表达盒；更佳地，该表达质粒中还串联有 EntD的表达盒。
[0019] 在另一优选例中，所述的脂肪酸为不饱和脂肪酸，所述的脂肪醇为不饱和脂肪醇， 所述的脂肪醛为不饱和脂肪醛，所述的脂肪酸酯为不饱和脂肪酸酯；或
[0020] 所述的脂肪酸为饱和脂肪酸，所述的脂肪醇为饱和脂肪醇，所述的脂肪醛为饱和 脂肪醛，所述的脂肪酸酯为饱和脂肪酸酯。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种重组的表达构建物，所述的表达构建物中包括： 羧酸还原酶的表达盒，醛还原酶的表达盒；较佳地，该表达质粒中还包括：酯水解酶的表达 盒；更佳地，该表达质粒中还包括：EntD的表达盒。
[0022] 在另一优选例中，所述的表达构建物是重组表达载体。
[0023] 在另一优选例中，所述的表达载体是pEZ07或pEZOl载体。
[0024] 在本发明的另一方面，提供一种重组的细胞，所述的细胞中包括所述的表达构建 物。
[0025] 在另一优选例中，所述的细胞是原核细胞。
[0026] 在另一优选例中，所述的原核细胞是大肠杆菌细胞。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种发酵法制备脂肪醇的方法，所述方法包括：培养所 述的重组的细胞，并在培养体系中添加脂肪酸或脂肪酸酯作为反应底物，从而获得脂肪醇。
[0028] 在另一优选例中，所述发酵法制备脂肪醇的方法中，细胞的培养条件是 33±4°C (较佳地为 33±2°C )，pH6. 8±0. 2,溶氧 30% ±20%，通风量 4±2vvm。
[0029] 在另一优选例中，所述发酵法制备脂肪醇的方法中，细胞是大肠杆菌，以IPTG诱 导细胞表达。
[0030] 在本发明的另一方面，提供一种用于制备脂肪醇的试剂盒，所述的试剂盒中包 括：
[0031] 包含有羧酸还原酶的表达盒、醛还原酶的表达盒、酯水解酶的表达盒的表达构建 物或细胞；较佳地，所述的表达构建物或细胞还包含酯水解酶的表达盒；更佳地，所述的表 达构建物或细胞还包含EntD的表达盒。
[0032] 在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括反应底物：脂肪酸（包括：饱和或不饱和 脂肪酸）或脂肪酸酯（包括：饱和或不饱和脂肪酸）。
[0033] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0034] 图 1、pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD 质粒构建图。
[0035] 图2、3L发酵罐中生物催化过程图（实施例3)。
[0036] 图3、发酵液的后处理过程图（实施例4)。
【具体实施方式】
[0037] 本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种用生物法来催化脂肪酸或脂肪酸甲酯 生成脂肪醇的方法。本发明的方法适用于饱和脂肪醇及不饱和脂肪醇的制备，且特别有利 于降低不饱和脂肪酸的生产成本。
[0038] 术语
[0039] 如本文所用，如本文所用，所述的"表达盒"或"基因表达盒"是指包含有表达目的 多肽（本发明中为羧酸还原酶、醛还原酶、酯水解酶或EntD)所需的所有必要元件的基因表 达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包 括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
[0040] 如本文所用，所述的"构建物"或"表达构建物"是指重组DNA分子，它包含预期的 核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的"构建物"通常被包含在表达载 体中；这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期的适 合的调控元件。"调控元件"在这里指的是可一定程度上控制核酸序列表达的核苷酸序列。 可作为典范的调控元件包括增强子，内核糖体进入位点（IRES)，复制起点，多腺苷酸化信 号，启动子，转录终止序列，以及上游调节区，这些调控元件有助于核酸的复制、转录、转录 后修饰等。
[0041] 如本文所用，所述的"可操作地连接"或"操作性连接"是指两个或多个核酸区域 或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定 位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被"可操作地连接" 到该核酸序列上。
[0042] 如本文所用，所述的"脂肪醇"包括"饱和脂肪醇"以及"不饱和脂肪醇";较佳地为 "不饱和脂肪醇"。
[0043] 反应原理
[0044] 一种方案是：以脂肪酸为底物，利用羧酸还原酶将脂肪酸转化为脂肪醛；之后，利 用醛还原酶将脂肪醛转化为脂肪醇。
[0045] 另一种方案是：以脂肪酸酯为底物，利用酯水解酶将脂肪酸酯转化为脂肪酸，再以 脂肪酸为底物，利用羧酸还原酶将脂肪酸转化为脂肪醛；之后，利用醛还原酶将脂肪醛转化 为脂肪醇。
[0046] 以生产9-癸烯醇为例，反应方法如下：
[0048] 酶或多肽及其编码核酸
[0049] 本发明首次实现了利用羧酸还原酶、醛还原酶，以及可选的酯水解酶或EntD进行 脂肪醇的生产制备。
[0050] 所述的羧酸还原酶包括（但不限于）：MsCAR，MmCAR，NsCAR ;所述的醛还原酶包括 (但不限于）：AlrA，YjgB ;所述的酯水解酶包括（但不限于）：CALB，HDE，LcaE7，BioH，YbaC 或TesA。作为本发明的优选方式，还利用利用EntD或sfp促进羧酸还原酶的活性。
[0051] 在本发明中，上述的酶或多肽可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植 物或微生物。此外，所述的酶或多肽也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重 组技术来生产重组酶或多肽。
[0052] 多种适合的酶或多肽可被应用于本发明。所述的酶或多肽包括全长的酶或多肽或 其生物活性片段（或称为活性片段）。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的酶或多肽的氨基酸序列也包括在本发明中。酶或多肽的生物活性片段的含义是指作 为一种多肽，其仍然能保持全长的酶或多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活 性片段至少保持50%的全长酶或多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持 全长酶或多肽的 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或100% 的活性。酶或多肽或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替 换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术， 所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域 人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活 性。见 Watson 等 Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224〇
[0053] 本发明也可采用经修饰或改良的酶或多肽，比如，可采用为了促进其半衰期、有效 性、代谢和/或多肽的效力而加以修饰或改良的酶或多肽。所述经过修饰或改良的酶或多 肽可以是与天然存在的酶或多肽具有较小的共同点，但也能发挥与野生型相同或基本相同 的功能，且不会带来其它不良影响。也就是说，任何不影响酶或多肽的生物活性的变化形式 都可应用于本发明中。
[0054] 本发明还包括了编码所述的酶或多肽的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其 互补链。作为本发明的优选方式，可对各酶或多肽的编码序列进行密码子优化，以提高表达 效率。编码酶或多肽的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的 方法获得。在获得了编码所述的酶或多肽的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适 的表达构建物（如表达载体）中，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细 胞，得到所要的多肽。
[0055] 表达构建物及宿主
[0056] 本发明还包括了包含编码所述酶或多肽的生物活性片段的核酸分子的表达构建 物。所述的表达构建物可包括一个或多个编码所述酶或多肽的基因表达盒，还可包含与所 述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于多肽的表达。所述的表达调控序列 的设计是本领域公知的。表达调控序列中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启 动子。例如，诱导型的启动子可实现更可控的多肽表达以及化合物生产，有利于工业化应 用。
[0057] 作为本发明的优选方式，提供了一种表达构建物，其包括以下酶的基因表达盒：羧 酸还原酶的表达盒，醛还原酶的表达盒；较佳地，还包括：酯水解酶的表达盒；更佳地，该表 达质粒中还包括：EntD的表达盒。
[0058] 表达构建物的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，在得知了所需 选择的酶或多肽之后，本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。编码酶或多肽的基因 序列可以被插入到不同的表达构建物（如表达载体）中，也可以被插入到同一表达构建物 中，只要在转入到细胞后酶或多肽能够被有效地表达即可。
[0059] 此外，含有编码所述酶或多肽的生物活性片段核酸序列的重组细胞也包括在本发 明中。该"细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等； 常用的真核细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。作为本发明的优选方式，所述的 细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞；例如，所述大肠杆菌是W3110。
[0060] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为 原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用例如CaCl 2S MgCl2等方法处理，所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进 行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显 微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0061] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的酶或多肽。根据 所用的宿主细胞，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在培养的适当阶段加入底物，来 实现脂肪醇的生产。
[0062] 生产方法
[0063] 本发明提供了一种制备脂肪醇的方法，包括：以脂肪酸为底物，利用羧酸还原酶将 脂肪酸转化为脂肪醛；利用醛还原酶将脂肪醛转化为脂肪醇。较佳地，所述的脂肪酸如下获 得：以脂肪酸酯为底物，利用酯水解酶将脂肪酸酯转化为脂肪酸。
[0064] 作为本发明的优选方式，提供了一种发酵法制备脂肪醇的方法，所述方法包括： 培养所述的重组的细胞，使之产生羧酸还原酶、醛还原酶，以及可选的酯水解酶或EntD，并 在培养体系中添加脂肪酸或脂肪酸酯作为反应底物，从而获得脂肪醇。作为本发明的优 选方式，采用大肠杆菌进行重组表达所述的酶或多肽，重组细胞的培养条件是33±2°C， pH6. 8±0. 2,溶氧30% ±20%，通风量4±2vvm。当应用大肠杆菌作为表达宿主时，采用 IPTG进行诱导酶或多肽的表达。
[0065] 在获得反应产物后，可以采用本领域已知的方法将脂肪醇从反应液（发酵液）中 分离出来。一种较为优选的方法如图3所示。
[0066] 在本发明的较佳实施例中，列举了生物催化9-癸烯酸甲酯生成9-癸烯醇的方法， 通过酯水解酶将底物水解为9-癸烯酸（9-DA)，然后通过羧酸还原酶直接将9-癸烯酸还原 为9-癸烯醛，最后通过醛还原酶还原9-癸烯醛为9-癸烯醇。在这个过程中，不饱和C = C双键始终没有变化，不受到这些酶的影响而保留。
[0067] 实施例中，尽管主要以生产9-癸烯醇作为举例，但是应理解，其它饱和或不饱和 的脂肪酸酯或脂肪酸为底物来生产相应的脂肪醇也是可以的。例如用9,12-二烯十三酸甲 酯生成9,12-二烯十三酸、9,12-二烯十三醛、9,12-二烯十三醇。
[0068] 本发明采用生物法生产脂肪醇，其优势是选择性还原，可以在不影响C = C双键的 情况下选择性的还原羧酸基团，具有100 %的选择性。与化学法相比，生物催化反应条件更 加温和，不使用重金属以及有机溶剂，是绿色环保的新方法，具有无可比拟的优势。
[0069] 本发明的方法，通过提供一种新的绿色环保的生物方法来合成不饱和脂肪醇，同 时降低不饱和脂肪醇的制造成本以获得工业上的应用。
[0070] 试剂盒
[0071] 基于本发明的方法改进，还提供了一种用于制备脂肪醇的试剂盒，所述的试剂盒 中包括：包含有羧酸还原酶的表达盒、醛还原酶的表达盒、酯水解酶的表达盒的表达构建物 或细胞；较佳地，所述的表达构建物或细胞还包含酯水解酶的表达盒；更佳地，所述的表达 构建物或细胞还包含EntD的表达盒。各表达盒可被串联于一个表达构建物（如表达载体） 上，也可分别位于不同的表达构建物（如表达载体）上。各表达盒可存在于一个表达宿主 (细胞）中，也可存在于不同的表达宿主（细胞）中。
[0072] 此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，以说明各材料的使用方法、反应顺 序，便于本领域技术人员使用。
[0073] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0074] 实施例 1、构建质粒 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD
[0075] 根据 SEQ ID N0:l、3、5,合成 MsCAR 基因片段（SEQ ID N0:l)、AlrA 基因片段（SEQ ID NO: 3)和Lea E7基因片段（SEQ ID NO: 5中第97-1713位），分别连入pUC57载体（苏 州金唯智生物技术有限公司），分别获得质粒pUC57-MsCAR、pUC57-AlrA和pUC57-Lc a E7。
[0076] 利用PCR方法分别从质粒pUC57-MsCAR和pUC57-AlrA上扩增基因 MsCAR和AlrA， 引物见表1。两基因扩增产物分别带酶切位点Ncol/Xhol和XhoI/BamHI，将两基因扩增产 物分别进行酶切，回收后的片段与NcoI/BamHI双酶切的质粒pEZ07 (通过转移pTrc99A的 Laclq基因和pTre启动子片段到pCL1920质粒的LaeZ α基因前获得pEZ07,克隆pTrc99A 的引物为 GGCATCCGCTTACAGACA 和 TTGTCGGTGAACGCTCTCCTGA。pTrc99A 和 pCL1920 都获自 Biovector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心）一起通过T4 DNA连接酶进行连接，并转 化大肠杆菌DH5 α完成重组质粒pEZ07-MsCAR-AlrA的构建。
[0077] 然后，利用PCR方法从质粒pUC57_Lc α E7上扩增基因 Lc α E7,其两端均分别带有 限制性酶切位点EcoRI/Hindlll，将两基因分别进行酶切，回收后的片段与EcoRI/Hindlll 双酶切的质粒pEZ07-MsCAR-AlrA -起通过T4 DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌 DH5 α，完成重组质粒 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc α E7 的构建。
[0078] 以大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增基因 EntD (SEQ ID Ν0:7)，扩增引物为 EntD-BamHI-F和 EntD-EcoRI-R，将扩增得到的 EntD 片段与质粒pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc α E7 分别用相同的限制性内切酶BamHI、EcoRI进行酶切，回收后通过Τ4 DNA连接酶进行连接， 完成pEZ07-MsCAR-AlrA-LcaE7-EntD的构建，如图1。启动子为Tre，每个基因前都设置 rbs位点（序列为AAGGAG)用于蛋白转录。获得的质粒pEZ07-MsCAR-AlrA-LcaE7-EntD转 化大肠杆菌，获得重组菌株 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110。
[0079] 表1、重组菌株构建引物表
[0082] 实施例2、通过重组菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110将9-癸烯酸甲酯 转化为9-癸烯醇
[0083] 通过在生产宿主中外源性表达酯水解酶、羧酸还原酶和醛还原酶将底物脂肪酸甲 酯（具体为9-癸烯酸甲酯）转化为脂肪醇（具体为9-癸烯醇），反应式如下：
[0085] 具体来说，将质粒pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD转化入大肠杆菌W3110,在添 加100mg/L壮观霉素的LB板中挑选相应的转化子。将pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/ W3110的转化子接种于3mL添加100mg/L壮观霉素的LB+1%甘油的培养基中，然后在培养 箱内33°C培养过夜。从过夜的培养基中取100uL转移到50mL(2%接种量）同样培养基的 250mL烧瓶中，然后在培养箱内33°C培养至0D600达到0. 5~0. 6,添加终浓度为ImM的 IPTG，同时添加400uL纯的9-癸烯酸甲酯（终浓度为7g/L)，在诱导后3小时，18小时时分 别取发酵液400uL于2mL离心管中，加入800uL的4-甲基-2-戊酮，将离心管置于涡旋振荡 器上剧烈震荡，从发酵液中萃取出反应剩余的9-癸烯酸甲酯，中间产物9-癸烯酸，9-癸烯 醛和产物9-癸烯醇，震荡30分钟后将离心管在12000rpm离心1分钟，取上层4-甲基-2-戊 酮萃取层，转移到2mL新离心管中，加入无水硫酸钠干燥，然后继续在12000rpm离心1分 钟，取上清4-甲基-2戊酮溶液进行GC检测。GC检测方法具体为：进样口 280°C，分流比 10:1，流速3ml每分钟，柱温起始100°C，25 °C每分钟升至246 °C，30 °C每分钟升至290 °C并 保留2分钟，检测器300°C。本菌株在上述培养条件下9-癸烯醇在3h时转化率为19. 0%， 18h时转化率为94. 9%。
[0086]
[0087] 经测定，反应过程中，不饱和C = C双键始终没有变化，并不受到所表达的酶或表 达体系的影响。
[0088] 实施例3、在3L发酵罐中转化9-癸烯酸甲酯为9-癸烯醇
[0089] 所用培养基如表2所示。
[0090] 表2、以9-癸烯酸甲酯为底物的发酵培养基成分
[0091]
[0092] 挑取活化的单菌落（重组菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110)接入种子 培养基中，200rpm，30°C培养过夜；按5%的接种量接种到含有0. 95L发酵培养基的3L发酵 罐中，发酵参数控制为：温度33°C，pH6. 8,溶氧30%，通风量4vvm，搅拌转速与溶氧偶联，通 过流加补料培养基控制发酵液中甘油浓度为4-8g/L ;发酵2h后加入IPTG (终浓度为ImM) 诱导，诱导lh开始流加9-癸稀酸甲酯，流加周期为每7~8min流加 ls(流速为10mL/min)， 发酵过程如图2。发酵68h，共添加底物100g，转化率95%。
[0093] 实施例4、9_癸烯醇的分离和提纯
[0094] 将发酵罐中发酵液转移到5L四口瓶中于80°C加热2小时，然后用浓盐酸调节至 pH = 2. 0,加入等体积的乙酸乙酯，搅拌器充分搅拌萃取后7000rpm离心10分钟，倒出乙 酸乙酯和水相，分液漏斗分离水相和乙酸乙酯相，离心沉淀用乙酸乙酯重悬再搅拌萃取， 7000rpm离心10分钟后倒出乙酸乙酯层，加入新的乙酸乙酯重复上述步骤2次，然后合并乙 酸乙酯萃取液，旋蒸浓缩得到粗产品80g，再将粗产品进行油浴减压精馏，外温105°C，得到 纯度大于99%的9-癸稀醇65g。
[0095] 实施例5、通过重组菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110将9-癸烯酸转化 为9-癸烯醇
[0096] 将 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110(该发酵不需要 Lc α E7,但该基因的存 在没有影响）的转化子接种于3mL添加100mg/L壮观霉素的LB+1%甘油的培养基中，然后 在培养箱内33°C和250rpm培养过夜。从过夜的培养基中取100uL转移到50mL(2%接种量） 同样培养基的250mL烧瓶中，然后在培养箱内33°C和250rpm培养至0D600达到0. 5~0. 6， 添加终浓度为ImM的IPTG，同时添加100uL纯的9-癸烯酸（终浓度为1. 8g/L)，在诱导后 3小时，18小时时分别取发酵液400uL于2mL离心管中，加入800uL的4-甲基-2-戊酮，将 离心管置于涡旋振荡器上剧烈震荡从发酵液中萃取出反应剩余的9-癸烯酸，中间体9-癸 烯醛，和产物9-癸烯醇，震荡30分钟后在12000rpm离心1分钟，取上层4-甲基-2-戊酮 有机层，转移到2mL新离心管中，加入无水硫酸钠干燥，12000rpm，1分钟离心，取上清4-甲 基-2戊酮有机溶液进行GC检测。GC检测方法具体为：进样口 280°C，分流比10:1，流速3ml 每分钟，柱温起始100 °C，25 °C每分钟升至246 °C，30 °C每分钟升至290 °C并保留2分钟，检测 器300°C。本菌株在上述培养条件下9-癸烯醇在3h时转化率为18. 2%，18h时转化率为 93. 6%〇
[0097] 实施例6、在3L发酵罐中转化9-癸烯酸为9-癸烯醇
[0098] 所用培养基如表3所示。
[0099] 表3、以9-癸稀酸为底物的发酵培养基成分
[0100]
[0101] 挑取活化的单菌落（重组菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110,该发酵不 需要Lc α E7,但该基因的存在没有影响）接入种子培养基中，200rpm，30°C培养过夜；按5% 的接种量接种到〇. 95L发酵培养基的3L发酵罐，发酵参数控制为：温度33°C，pH6. 8,溶氧 30%，通风量2vvm，搅拌转速与溶氧偶联，通过流加补料培养基控制发酵液中甘油浓度为 4-8g/L ;在发酵罐中生长至0D600达到0. 5~0. 6,添加终浓度为ImM的IPTG，同时开始流 加9-癸稀酸，流加周期为每7~8min流加 Is (流速为10mL/min)，发酵24h，共添加底物 20区，转化率98%。
[0102] 实施例 7、通过重组菌株 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110 将 9,12-二烯 十三酸甲酯转化为9,12-二烯十三碳-1-醇
[0103] 将 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110 的转化子接种于 3mL 添加 lOOmg/L 壮观霉素的TB培养基中，然后在培养箱内33 °C和250rpm培养过夜。从过夜的培养基中 取100uL转移到50mL(2%接种量）同样培养基的250mL烧瓶中，然后在培养箱内33°C和 250rpm培养至0D600达到0. 5~0. 6,添加终浓度为ImM的IPTG，同时添加200uL纯的9， 12-二烯十三酸甲酯（终浓度为4g/L)，在诱导后3小时，18小时时分别取发酵液400uL于 2mL离心管中，加入800uL的4-甲基-2-戊酮，将离心管置于涡旋振荡器上剧烈震荡30分 钟，然后在12000rpm离心1分钟，取上层4-甲基-2-戊酮萃取层，转移到2mL新离心管中， 加入无水硫酸钠干燥，12000rpm，1分钟离心，取上清4-甲基-2戊酮溶液用进行GC检测。 GC检测方法具体为：进样口 280°C，分流比10:1，流速3ml每分钟，柱温起始100°C，25°C每 分钟升至246°C，30°C每分钟升至290°C并保留2分钟，检测器300°C。
[0104] 结果，本菌株在18h时转化率为90%。
[0105] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种制备脂肪醇的方法，其特征在于，所述方法包括： 以脂肪酸为底物，利用羧酸还原酶将脂肪酸转化为脂肪醛；利用醛还原酶将脂肪醛转 化为脂肪醇。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸如下获得：以脂肪酸酯为底 物，利用酯水解酶将脂肪酸酯转化为脂肪酸。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于， 所述的羧酸还原酶包括：MsCAR，MmCAR或NsCAR ; 所述的醛还原酶包括：AlrA或YjgB ; 所述的酯水解酶包括：CALB，HDE，Lc α E7, BioH，YbaC或TesA。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：利用EntD或Sfp促进羧酸还原酶 的活性。5. 如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的MsCAR具有SEQ ID NO: 2所示的 氨基酸序列；和/或 所述的AlrA具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；和/或 所述的Lea E7具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO: 6中第33-570位所 示的氨基酸序列；优选地是氨基酸序列如SEQ ID N0:6中第33-570位所示的截短体；和/ 或 所述的EntD具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，羧酸还原酶的表达盒、醛还原酶的表达 盒被串联于一个表达质粒中；$父佳地，该表达质粒中还串联有酯水解酶的表达盒；更佳地， 该表达质粒中还串联有EntD的表达盒。7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸为不饱和脂肪酸，所述的 脂肪醇为不饱和脂肪醇，所述的脂肪醛为不饱和脂肪醛，所述的脂肪酸酯为不饱和脂肪酸 酯；或 所述的脂肪酸为饱和脂肪酸，所述的脂肪醇为饱和脂肪醇，所述的脂肪醛为饱和脂肪 醛，所述的脂肪酸酯为饱和脂肪酸酯。8. -种重组的表达构建物，其特征在于，所述的表达构建物中包括：羧酸还原酶的表 达盒，醛还原酶的表达盒；较佳地，该表达质粒中还包括：酯水解酶的表达盒；更佳地，该表 达质粒中还包括：EntD的表达盒。9. 一种重组的细胞，其特征在于，所述的细胞中包括权利要求8所述的表达构建物。10. -种发酵法制备脂肪醇的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求9所述 的重组的细胞，并在培养体系中添加脂肪酸或脂肪酸酯作为反应底物，从而获得脂肪醇。11. 一种用于制备脂肪醇的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括： 包含有羧酸还原酶的表达盒、醛还原酶的表达盒、酯水解酶的表达盒的表达构建物或 细胞；较佳地，所述的表达构建物或细胞还包含酯水解酶的表达盒；更佳地，所述的表达构 建物或细胞还包含EntD的表达盒。
【文档编号】C12P7/04GK105985987SQ201510093004
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月2日
【发明人】谢新开, 胡志浩, 江君君, 田峰, 李晓辉, 杜好勉
【申请人】苏州安捷生物科技有限公司, 苏州汉酶生物技术有限公司