乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒及其使用方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒及其使用方法和应用；该试剂盒包括：核酸扩增试剂和杂交试剂；其中，所述核酸扩增试剂包括：如SEQ ID NO.1?2所示的引物；杂交试剂包括：如SEQ ID NO.3?31所示的探针。该试剂盒的使用方法包括：1)样本的核酸提取；2)扩增试剂配制；3)PCR扩增；4)杂交反应；5)荧光反应；6)检测；7)根据检测反应体系中的荧光信号值来确定HBV的耐药性突变和基因型情况。本发明能够同时检测10个乙肝耐药突变位点和4种基因型，并能减少人工操作步骤，提高测试速度、通量。
【专利说明】
乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒及其使 用方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种乙型肝炎病毒（HBV)的检测试剂盒及其使用方法和应用，特别是 涉及一种乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒及其使用方法和应用。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎是一种由HBV感染引起的疾病，呈全球性分布，全世界有超过20亿的人 群感染过HBV，其中，有3亿5千万为慢性HBV感染者。我国是世界上乙肝和肝癌患者最多 的国家，约占全球四分之一以上（9300万乙肝病毒携带者和2000万慢性乙肝患者）。使用 核苷类似物治疗乙肝已经成为目前全世界临床治疗乙肝的主流，但在乙肝治疗过程中，不 能正确理解抗病毒治疗的意义和采取规范的抗病毒治疗，已使乙肝病毒变异、耐药逐渐成 为抗病毒治疗道路上最大的绊脚石。
[0003] 5种常见的核苷类乙肝治疗药物：拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替 诺福韦酯。用于核苷初治患者时，某些核苷类药物的耐药发生率相对较高，如拉米夫定和阿 德福韦的五年耐药率分别70%和29%。
[0004] HBV国内分型情况：HBV被划分为A-ι九个基因型，我国主要存在A、B、C、D四个基 因型，以B型和C型为主，共约占90%以上。不同的乙型肝炎病毒基因型对现有药物治疗可 能存在不同的治疗响应，乙肝的基因分型检测越来越被关注。
[0005] 乙型肝炎耐药和分型检测方法如下：
[0006] 目前使用的方法主要检测基因型耐药，包括直接测序、聚合酶链式反应-限制性 片段长度多态性（PCR-RFLP)、序列特异性PCR、线性探针杂交技术（LiPA)、反向膜杂交及固 相基因芯片等，但对各种方法的准确度作对比与评价的报道不多。
[0007] 其中，直接测序是最直接的方法，能检测多个位点突变和区别基因型，是临床上用 的最多的方法，但该方法操作繁琐，检测时间长，费用较高，而且在出现混合突变或者混和 基因型情况下，只能检测到占种池20 %量的序列。
[0008] PCR-RFLP方法是一种简明和较为完善的方法，以错配PCR结合限制性片段长度多 态性方法，快速检测患者体内YMDD变异株的发生情况，该方法通过错配PCR引入独特的酶 切位点，再用酶切分析，图谱简单，容易判断，此方法具有较好的可靠性和可行性，但由于酶 切方法只能检测单点突变，对于可能伴随其它变异需经过测序分析，因此实际应用中应结 合PCR-RFLP筛检和PCR产物克隆后测序互相证实和补充。
[0009] 线性探针杂交技术除了能够对HBV进行基因分型外，能够同时检测耐药株和野生 株，结果相对准确，但检测通量低，操作繁琐，价格昂贵。
[0010] 对于反向膜杂交，读取速度快，缺点是通量低，操作繁琐，易污染，结果读取因人而 异。
[0011] 固相基因芯片是将寡核苷酸片段作为探针有序以及高（或低）密度地固定于基质 载体上，与待测的用荧光（或者生物素）标记的待测核酸按照碱基配对原则进行杂交，该方 法实现高通量检测，但是操作繁琐，自动化程度低。
[0012] 因此，乙肝耐药和分型检测试剂盒仍由国外产品主导，价格昂贵，在国内尚无普遍 应用，无法满足我国对于乙肝病毒耐药与分型的市场需求，因而，急需要开发一种操作简 便、价格低、快速准确、高通量的乙肝耐药和分型检测试剂盒。
【发明内容】
[0013] 本发明要解决的技术问题是提供一种乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检 测试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒是一种人类乙肝耐药和基因分型的液相芯片检测 试剂盒，其是基于液相芯片检测法，采用带条码的磁珠结合不同的探针，再通过荧光信号来 判断耐药位点的突变情况和基因型，对临床用药具有指导意义，而且该试剂盒具有操作简 便、灵敏度高且能检测多个耐药位点突变和常见基因型等优点。
[0014] 本发明中，以人类看家基因 β-globin作为内标和HBV病毒同时经历核酸提取、 PCR扩增、杂交等过程，可以监测整个检测过程，保证结果的有效性。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明的乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂 盒，包括：核酸扩增试剂和杂交试剂；
[0016] 其中，所述核酸扩增试剂包括：如SEQ ID N0. 1-2所示的引物；
[0017] 杂交试剂包括：如SEQ ID N0. 3-31所示的探针【即如SEQ ID N0. 3-30所示的用于 耐药突变位点和基因型检测的探针、如SEQ ID N0. 30所示的内标探针（1C)以及如SEQ ID NO. 31所示的质控（QC)探针】。
[0018] 所述SEQ ID N0. 2所示引物的5'端还连接有生物素（BIOTIN)。
[0019] 所述SEQ ID N0. 3-31所示探针的5'端可标记有amin〇-C6。
[0020] 进一步地，所述杂交试剂包括：与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探针。通过上述探针与有编号的磁珠上氨基结合成整体，一个编号连接一个 探针，在本发明中使用上述探针可对乙肝耐药10个位点和4个基因型在同一样本孔中进行 检测，实现高通量检测，检测时间短，操作简便可实现自动化检测。
[0025] 上述的29个探针（SEQ ID Nos :3-31)包括以下：
[0026] 抗拉米夫定，替比夫定药物的5个突变类型：173 (V - L)，180 (L - Μ)，181 (A - T)， 204(M -W(M-I)以及对应的 4 个正常对照（V173，L180，A181，M204);
[0027] 抗阿德福韦酯药物的3个突变类型：181 (A -Τ) ΛΑ -V)，236 (N - T)以及对应 的2个正常对照（A181，N236);
[0028] 抗恩替卡韦药物和替诺福韦酯药物的6个突变类型：169(1 - T)，184(T - G)， 202 (S - G) AS - I)，250 (Μ - V)，194 (A - Τ)以及对应的 5 个正常对照（1691，184Τ，202S， 250M，194A);以及
[0029] 区分4基因型的探针A、B、C、D。
[0030] 所述与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探针，其制备方法 可为包括以下步骤的方法：
[0031] A.将29种不同编号（如可为1~29)的磁珠溶液（如1ml)分别转移到管中，离 心（如2500~3500rpm离心1~3分钟），去除上清液；其中，磁珠溶液的浓度可为250K个 磁珠 /ml ;该磁珠可米用商业化产品；
[0032] B.取MEST溶液（如200~400 μ 1)分别加入每管中，离心（如2500~3500rpm 离心1~3分钟），去除上清液；
[0033] 其中，MEST溶液是含体积浓度为0· 01% -0· 05% Tween20(吐温20)和50mM~ 100mM pH5~7的MES(2-吗啉乙磺酸）的混合溶液；
[0034] C.重复步骤B -次；
[0035] D.加入水（优选超纯水125 μ 1)、4XMEST溶液（即含体积浓度为0· 04% -0· 20% Tween20和200mM~400mM pH5~7的MES混合溶液，优选取75 μ 1 4XMEST溶液），并且 分别对应每种磁珠加入如SEQ ID Ν0. 3-31所示的探针；
[0036] 其中，探针浓度优选为50~100 μ M，探针的加入量可为10~20 μ 1。
[0037] Ε·配制含10mg/ml~5mg/ml EDC(N_(3_二甲基氨丙基）_Ν'-乙基碳二亚胺， 10mg，购自SIGMA公司）的MEST溶液，将其加入到每个磁珠管中，震荡（室温）；
[0038] 如可将1管EDC(N-(3-二甲基氨丙基）-N'_乙基碳二亚胺，10mg，购自SIGMA公 司）从-18°C新鲜取出，加入1~2ml冷MEST溶液（2~8°C )，震荡混匀后，迅速取60~ 80 μ 1加入到每个磁珠管中，震荡后，放入恒温震荡仪中，室温震荡1000~1400rpm，15~ 30分钟；
[0039] F.重复步骤E -次；
[0040] G.将TNT溶液（如500~800 μ 1)加入磁珠管中，震荡混匀，离心（如2500~ 3500rpm离心1~3分钟），去除上清液；
[0041] 其中，TNT 溶液是含 25 ~50mM Tris-HCl、0. 05 ~0· 2M NaCl、0. 01 ~0· 05vol% (体积百分数）Tween 20的溶液；
[0042] Η·重复步骤G -次；
[0043] I.将浓度为lg/100ml~5g/100ml的SDS溶液（如500~800 μ 1)加入磁珠管 中，缓慢滚动混匀，尽量避免气泡的产生，离心（如2500~3500rpm离心1~3分钟），去除 上清液。
[0044] J.重复步骤G-次，用上述TNT溶液洗涤磁珠。
[0045] K.加入TE溶液（如1. 5ml)，得到与带有编号的磁珠进行偶联后的探针。也可进 行如下操作：加入TE溶液（如1.5ml)后，2~8°C保存，备用。磁珠制备完成。其中，TE溶 液是含有10~30mM Tris-HCl和1~5mM EDTA的pH7~8的溶液。
[0046] 所述核酸扩增试剂还可包括：核酸扩增所需的其他试剂，如包括：KC1、Tris-HCl 缓冲液、Taq 酶、UNG 酶、dNTPs 和 MgCl2。
[0047] 所述杂交试剂还包括：杂交液、荧光反应液、杂交洗液和检测液。
[0048] 其中，杂交液的组分为：TMAC(四甲基氯化铵）2~5M、Tris-HCl 20~60mM pH8、 N_ 月桂醜肌氛酸纳（Sarkosyl)O. lg/100ml ~0· 5g/100ml、EDTA 4 ~8mM。
[0049] 突光反应液包括：SAPE(链霉亲和素-R-藻红蛋白，Streptavidin R-Phycoerythrin Conjugate) ;SAPE可采用商业化产品。其中，SAPE其可与被探针捕获的 PCR产物上的Biotin相结合，最终在芯片荧光检测仪上进行检测。
[0050] 杂交洗液的组分为：Na2HP040 . 2 ~0· 6M、NaH2P0425mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、 体积浓度为10~30%的Tween20。
[0051] 检测液的组分为：Na2HP040 . 2 ~0· 6M、NaH2P0425mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、体 积浓度为10~30%的Tween20、体积浓度为0· 2~0· 5%的Triton x-100(聚乙二醇辛基 苯基醚）。
[0052] 另外，所述试剂盒还可包括：核酸提取试剂、阳性对照品（即HBV耐药和分型检测 阳性对照品）、阴性对照品、杂交质控品以及内标。
[0053] 其中，所述核酸提取试剂包括：磁珠悬浮液。
[0054] 所述磁珠悬液，可采用商业化产品，如可包括：chemagen公司的顺磁性氧化娃纳 米磁珠的悬浮液（磁珠为购自chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠，该磁珠可通过纳米 技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁 珠）。
[0055] 另外，所述核酸提取试剂还可包括以下组分：
[0056] 1)裂解液，其是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氰 酸胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为2M~6M，TritonX-100或 Tween-20的体积浓度为1 %~2% ;
[0057] 2)结合液，其是含高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液；其中，高氯酸盐 包括：高氯酸钠；醋酸盐包括：醋酸钠；有机溶剂包括：乙醇；高氯酸盐的浓度优选为 17g/100mL~30g/100mL，醋酸盐的浓度优选为lg/100mL~10g/100mL，有机溶剂的体积浓 度优选为40 %~60%。
[0058] 优选地，结合液的配制方法为：取200g_300g高氯酸钠、20g_40g醋酸钠溶解于少 量纯化水中，然后加入400-600mL无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0059] 3)洗液A，其是含高氯酸钠、醋酸盐和乙醇的水溶液，其中，高氯酸钠的浓度优选 为lOg/lOOmL~30g/100mL，醋酸盐（包括：醋酸钠）的浓度优选为4g/100mL~15g/100mL， 乙醇的体积浓度优选为35%~50%。
[0060] 优选地，洗液A的配制方法为：取200g-300g高氯酸钠、40g-60g醋酸钠、溶解于少 量纯化水中，然后加入350ml-500ml无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0061] 4)洗液B，其为体积浓度40%~80%的乙醇；
[0062] 5)洗脱液，其为 10 ~20mM ρΗ8· 0 的 Tris-HCl。
[0063] 6)蛋白酶 K。
[0064] 7) RNA 的聚合酶 A (Poly Α)。
[0065] 上述阳性对照品，优选地，其是包含如SEQ ID NO. 32所示序列的质粒（即一种HBV 突变质粒），监测样本测试过程的准确性。其中，如SEQ ID NO. 32所示序列是根据HBV基因 的180M和204V突变以及其它8个野生型位点169、173、181、184,194, 202, 236、250和基因 B型而设计的。另外，更优选地，上述阳性对照品为包含如SEQ ID N0. 32所示序列的pUC57 质粒。
[0066] 阴性对照品，是由HBV病毒阴性血清液配制为阴性对照品，监控样本测试过程的 准确性。
[0067] 优选地，杂交质控品，是如SEQ ID N0. 33所示的一段核酸序列；该杂交质控品的中 间序列与如SEQ ID N0. 31所示的质控探针相互补，因此，用QC探针检测该杂交质控品，检 测信号标示为HQC。监控整个杂交过程的准确性。杂交质控品的序列为5' -3'：TGAAGAGGA ATATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAACGATAGC(SEQ ID Ν0· 33)。
[0068] 优选地，内标为一种包含人类看家基因 β -globin序列的质粒，更优选包含人类 看家基因 β-globin序列的pUC57质粒，进一步优选包含人类看家基因 β-globin序列的 5'端连接有SEQ ID NO. 1序列且3'端连接SEQ ID N0. 2序列的pUC57质粒，即进一步优选 包含如SEQ ID N0. 34所示的pUC57质粒。内标扩增时，内标模板和样本得引物都为表1所 /_J、1 〇
[0069] SEQ ID Ν0· 34 :5'-GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCGAACCGGTGAGTGTGGCT CCACAGGGTGAGC CTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCT-3'。
[0070] 另外，本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，即利用上述试剂盒检测乙肝病毒 的耐药性突变和基因型的方法（可利用96孔板进行的检测方法），包括步骤：
[0071] 1)样本的核酸提取
[0072] 利用上述的核酸提取试剂，并按照常规的磁珠法，对样本、上述阳性对照和阴性对 照同时进行核酸提取，得到PCR模板，并且上述内标在进行核酸提取之前加入每个样本中， 内标的加入量可为5~10 μ 1/样本；
[0073] 其中，样本包括：血清或者血浆等；
[0074] 2)扩增试剂配制：
[0075] 反应Α液，其组分为：盐缓冲液、Taq酶、UNG酶和dNTPs ;
[0076] 其中，盐缓冲液的终浓度为含30~60mM KC1的10~20mM ρΗ8· 0-8. 5的Tris-HCl 缓冲液；
[0077] Taq 酶 3 ~7U/test (3 ~7U/ 次检测）；
[0078] UNG 酶 0· 1 ~0· 5U/test (0· 1 ~0· 5U/ 次检测）；
[0079] dNTPs (10 ~30mM dATP，10 ~30mM dTTP，10 ~30mM dCTP，10 ~30mM dGTP，10 ~ 30mM dUTP)〇
[0080] 反应B液：含如SEQ ID NO. 1所示的引物F和如SEQ ID NO. 2所示的引物R的 MgCl2溶液；其中，引物F的浓度为50~ΙΟΟηΜ，引物R的浓度为200~500nM，MgCl 2的浓 度为 20-60mM ;
[0081] 将反应A液和反应B液混合形成扩增试剂。其中，反应A液和反应B液的混合体 积比可为1:2~1:4 ;
[0082] 3) PCR扩增：在步骤1)中的PCR模板中分别加入步骤2)的扩增试剂进行PCR扩 增反应；
[0083] 其中，对于反应A液中的UNG酶，在开始PCR扩增步骤之前，进行37°C保温2mins， 随后50°C保温5mins对UNG酶进行灭活。
[0084] PCR扩增方法包括以下步骤：
[0085] Step 1 :37°C 2min 1 个循环；
[0086] Step 2 :5CTC 5min 1 个循环；
[0087] Step 3 :94°C 5min 1 个循环；
[0088] St印 4 :94°C 30s，6(TC 45s ;50 个循环；
[0089] Step 5 ：72°C 7min ；
[0090] St印 6:10。(：保存；
[0091] 4)杂交反应：将与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探针 和上述杂交液混合后（每种磁珠在每个测试中为25~50个），加入到PCR产物中，放置恒 温振荡器上50~60°C、1200~1400rpm进行杂交反应15-30min，同时，杂交质控品参与整 个杂交过程,监测杂交的有效性。
[0092] 5)荧光反应：吸除杂交反应物的上清，将底部的磁珠中加入上述荧光反应液【如， SAPE (购自QIAGEN，稀释浓度至2~8 μ g/ml)反应液100~200 μ 1】，放入振荡器上振荡反 应 5_15min〇
[0093] 6)检测：荧光反应产物用上述杂交洗液洗涤后，加入上述检测液，在液相芯片检 测仪上进行荧光检测；具体可为：将荧光反应产物用洗板机进行条洗，用上述杂交洗液洗 板3-6次，冲液量350 μ 1，静置间隔20-60秒每次，洗板结束后加入50~100 μ 1上述检测 液，在液相芯片检测仪上进行荧光检测。
[0094] 7)根据检测反应体系中的荧光信号值来确定HBV的耐药性突变和基因型情况。 [0095] 再者，本发明还公开了上述试剂盒的应用，即所述试剂盒用于检测以下的耐药位 点和乙型肝炎病毒型别；
[0096] 其中，耐药位点包括：I169T、V173L、L180M、A181V/T、T184G、Α194Τ、S202G/I、 M204V/I、N236T、M250V，即第169位的I - Τ的突变位点、第173位的V - L的突变位点、第 180位的L - Μ的突变位点、第181位的A - V的突变位点或第181位的A - T的突变位 点、第184位的T - G的突变位点、第194位的A - T的突变位点、第202位的S - G的突 变位点或第202位的S - I的突变位点、第204位的Μ - V的突变位点或第204位的Μ - I 的突变位点、以及第250位的Μ - V的突变位点；
[0097] 型别包括：乙型肝炎病毒基因型Α、基因型Β、基因型C和基因型D。
[0098] 本发明的试剂盒采用磁珠提取法用于HBV核酸提取，该法运用纳米技术对超顺磁 性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在 微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在 Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）的作用下,使血液、动物组织、食品、病原微生物等 样本中的细胞裂解，然后向裂解液中加入磁珠，当溶液的pH值小于6. 5时，磁珠选择性的与 提取的DNA/RNA结合，此时将吸附有DNA/RNA的磁珠置于磁场中，通过缓冲液去除没有被吸 附的杂质（蛋白等），然后将磁珠置于pH值8. 5的缓冲液中，纯化的DNA/RNA即可进入缓冲 液中，然后用于作为后续PCR扩增的模板。磁珠法提取核酸既可以保证较高的核酸提取效 率，同时有利于HBV核酸检测过程自动化的实行。
[0099] 本发明采用基因芯片杂交原理，设计了针对乙肝耐药区域和乙肝分型区域的引 物，进过PCR扩增HBV的特异性核酸序列，针对不同的耐药位点和不同基因型，设计针对HBV 耐药位点杂交探针和基因分型探针，与带编码的磁珠进行偶联，经过PCR得到的扩增产物 与固定在带编码磁珠上的已知序列的单链核酸探针进行杂交。与探针杂交成功的PCR产物 通过自身末端所带的生物素 biotin与后加入的链霉亲和素-藻红蛋白SAPE结合产生荧光 信号。将磁珠洗涤后在Applied Biocode 1000A荧光分析平台上读取磁珠的编码及磁珠上 因与DNA杂交产生的荧光信号来判断与何种探针结合，从而进行HBV分型和耐药位点检测。
[0100] 由此可知，本发明与直接测序法比较，本发明的试剂盒操作简单、价格便宜、易实 现自动化且灵敏度优于直接测序法；与PCR-RFLP方法相比较，本发明的试剂盒，可以检测 多位点的突变，而且实现高通量的检测；与荧光定量PCR相比较，本发明的试剂盒检测多达 10个耐药位点和4种国内主要基因型的检测，免于荧光定量PCR的通道限制；与线性探针 杂交技术相比较，本发明的试剂盒通量高、价格便宜、操作相对简单；与固相芯片相比较，本 发明的试剂盒具有通量高、灵敏度高、可实现自动化操作等优点。
[0101] 此外，本发明还具有如下有益效果：
[0102] 1)本发明采用人类看家基因为内标对整个HBV检测过程进行监控，有效地避免了 样本在采集、运输保存以及在提取过程和杂交过程中的操作不当而造成的假阴性；
[0103] 2)本发明采用芯片杂交方法，并能够同时检测10个乙肝耐药突变位点和4种基因 型，跟荧光定量PCR相比较，能在同一个检测孔中实现多位点的检测，不受荧光通道限制， 并能够有效地提高样本处理通量，可实现自动化检测；
[0104] 3)本发明同时能够准确分辨出：5种药物耐药性，包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩 替卡韦、替比夫定和替诺福韦酯，对于临床用药有重要的指导意义；
[0105] 4)本发明整合了自动化核酸提取设备与核酸扩增，杂交设备，大大减少了人工操 作步骤，提高了测试速度、通量。
【具体实施方式】
[0106] 为详细说明本发明的技术内容、特征、所能实现的目的及效果，以下通过具体实施 例对本发明进行详细的说明。
[0107] 另外，以下涉及的试剂如未特别说明，则为商业化产品。
[0108] 第一实施方式
[0109] 本实施方式中提供了一种乙肝耐药突变和基因型检测试剂盒，试剂盒（24人份） 的主要组成如下：
[0110] 1、A 盒：储存于 2-8°C
[0111] 表1核酸提取试剂
[0112]
[0113] 其中，裂解液是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫 氰酸胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为4M，TritonX-100或 Tween-20的体积浓度为1. 5% ;
[0114] 结合液，其配制方法为：取200g高氯酸钠、30g醋酸钠溶解于少量纯化水中，然后 加入500ml无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0115] 蛋白酶 K :外购于 Roche 公司，5-10 μ L/sample。
[0116] RNA 的聚合酶 A (Poly A):外购于 chemagen 公司，5-10 μ L/sample。
[0117] 磁珠悬浮液：chemagen公司的顺磁性氧化娃纳米磁珠的悬浮液（磁珠为购自 chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠）。
[0118] 洗液A，其配制方法为：取250g高氯酸钠、50g的醋酸钠、溶解于少量纯化水中，然 后加入450ml无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。
[0119] · 2、B 盒：储存于-18°C
[0120] 表2核酸扩增试剂
[0121]
[0122] 上述核酸扩增试剂中，一些组分的配制如下：
[0123] 反应液厶，其组分为疋11打6『（2〇11111^8-!1(：1?!18.3,6〇11111((：1)、丁&9酶31]/ test(3U/次检测）和 UNG 酶 0· lU/test(0. 1U/次检测）、dNTPs(10mM dATP, 10mM dTTP, 10mM dCTP, lOmM dGTP, lOmM dUTP)〇
[0124] 反应液B，其组分为：如SEQ ID NO. 1所示的引物F(100nM)、如SEQ ID NO. 2所示 的引物R(500nM)和MgCl250mM。其中，SEQ ID NO. 2所示引物的5'端还连接有生物素。
[0125] 阴性对照品：是由HBV病毒阴性血清液配制为阴性对照品。
[0126] 阳性对照品：将包含如SEQ ID NO. 32所示序列的pUC57质粒（由上海生工合成） 配制成浓度5X104IU/ml。
[0127] 杂交质控品，是SEQ ID NO. 33所示的核酸序列，浓度为0. 01 μ Μ。
[0128] 内标是包含如SEQ ID NO. 34所示序列的pUC57质粒（由上海生工合成），浓度为 2X105IU/ml〇
[0129] 3、C 盒：储存于 2_8°C
[0130] 表3杂交试剂
[0131]
[0132] 上述杂交试剂中，一些试剂配制如下：
[0133] 杂交液的组分：TMAC(四甲基氯化铵，购自SIGMA公司，品号：T3411-500ML)5M、 Tris-HCl 60mM pH8、Sarkosyl(N-月桂酰肌氨酸钠，购自SIGMA公司，品号： L5125-100G)0.5g/100ml、EDTA 8mM。
[0134] 磁珠杂交液的制备：
[0135] 每个编号（共29种编号）的带有探针的磁珠取2ml (共50K个磁珠），将磁珠悬浮 液震荡混匀，离心6000rpm，3分钟，放置于离心管专用磁板架上，缓慢将上清液完全吸出。 将磁珠留于管底部。分别加入200 μ 1上述杂交液，充分混合后将29种磁珠混合在50ml离 心管中。加入杂交液至12ml。充分摇匀，按600μ1每管分装，为一套试剂24人份用量。
[0136] 其中，编号的带有探针（如SEQ ID Ν0. 3-31所示的探针）的磁珠的制备方法，如 下：
[0137] A.将29种编号为1~29的磁珠溶液1ml分别转移到管中，3500rpm离心1分钟， 去除上清液；其中，磁珠溶液的浓度为250K个磁珠 /ml ;其中，磁珠购自美国公司Applied Biocode (货号：44-B-0102);
[0138] B.取400 μ 1 MEST溶液分别加入每管中，3000rpm离心3分钟，去除上清液；
[0139] 其中，MEST溶液是含体积浓度为0· 05% Tween20的lOOmM pH5的MES溶液；
[0140] C.重复步骤B-次；
[0141] D.加入 125μ 1 超纯水、75μ 1 4XMEST(400mM MES。!15、0.20%了￥661120)，并且分 别对应每种磁珠加入10 μ 1如SEQ ID NO. 3-31所示的探针（订购自上海生工公司）；同时， SEQ ID N0. 3-31所示探针的5'端标记有amin〇-C6。另外，探针浓度可为80 μ M。
[0142] 其中，探针与磁珠编号的对应如下：
[0143]
[0144]
[0145] Ε·将1管EDC(10mg购自SIGMA公司）从-18°C新鲜取出，加入1ml冷的上述MEST 溶液（2~8°C )，震荡混匀后，迅速取60 μ 1加入到每个磁珠管中，震荡后，放入恒温震荡仪 中，室温震荡1400rpm，30分钟；
[0146] F.重复步骤E-次；
[0147] G.将800 μ 1 TNT溶液加入磁珠管中，震荡混匀，3500rpm离心1~3分钟，去除上 清液；
[0148] 其中，TNT 溶液是含 50mM Tris-HCl、0. 2M NaCl、0. 05% Tween 20 的溶液；
[0149] Η·重复步骤G-次；
[0150] I.将800 μ 1浓度为lg/100ml的SDS溶液加入磁珠管中，缓慢滚动混匀，尽量避免 气泡的产生，3500rpm离心3分钟，去除上清液。
[0151] J.重复步骤G-次，用上述TNT溶液洗涤磁珠。
[0152] K.加入1. 5ml TE溶液，2~8°C保存，备用。磁珠制备完成。其中，TE溶液是含有 30mM Tris-HCl 和 5mM EDTA 的 pH7 ~8 的溶液。
[0153] 上述杂交洗液的组分：Na2HP040 . 6M、NaH2P0455mM、NaCl 0. 50M、体积浓度为30%的 Tween20〇
[0154] 检测液的组分：Na2HP040 . 6M、NaH2P0455mM、NaCl 0· 50M、体积浓度为 30% Tween20、 体积浓度为〇· 2%的TritonX-100。
[0155] 以下实施例中使用上述试剂盒做性能指标测试。
[0156] 一、样本准备
[0157] 1、采样
[0158] 样本采集：检测用样本为血清或血浆样本，采集及储存过程避免样本间交叉污染。 已知肝素抑制PCR扩增反应，以血浆做待测样本时应采用EDTA或柠檬酸钠抗凝，严禁用肝 素抗凝。
[0159] 2、标本保存
[0160] 分离的血清/血浆样本2~8°C保存不超过72小时。更长时间保存时，可将分离 出的血清/血浆样本转移到新的无菌采血管或离心管中-18°C以下保存。冷冻保存的样本 检测前取出室温溶解混匀测定。样本冻融次数建议不超过6次。
[0161] 3、标本运输
[0162] 在运输过程中需保证试剂盒的保存温度，可利用干冰保持较低的温度。
[0163] 二、检验方法
[0164] 1、HBV核酸的提取
[0165] 本试剂盒采用磁珠法对HBV核酸进行提取。本实例用EZbeads核酸提取仪为例进 行说明。
[0166] 1.1实验前准备
[0167] A.将B盒中的阳性对照品、阴性对照品和内标取出，平衡至室温并混匀。
[0168] B.配制蛋白酶K/Poly A混合液：
[0169]
[0170] C.在样本制备用96孔深孔反应盘中预分装下列试剂：
[0171]
[0172] 1. 2待测样本核酸提取过程
[0173] A.取300 μ L血清或血浆样本和300 μ L阳性对照，300 μ L阴性对照分别加入到预 分装试剂的反应盘Α2~Η2或Α8~Η8孔中，同时每个孔分别加入25 μ L内标。每块反应 盘可处理16个样本。每台仪器可同时放入2个反应盘处理32个样本。
[0174] Β.将金属条对准反应盘的Α6~Η6及Α12~Η12列底部，并将反应盘及金属条固 定于Ezbead System-32核酸提取仪上，进行核酸提取。提取程序见下表
[0175] 表4提取程序
[0176]
[0177] C.待程序结束后，取下反应盘，吸取洗脱液进行PCR扩增反应（洗脱液如有磁珠残 留，以靠磁方式去除。如果提取的样本当天不进行扩增，则要放-18°C以下保存）。
[0178] 2、核酸扩增
[0179] 2. 1HBV反应混合液配制：
[0180] 根据待测样本的数量，按照下列比例配制HBV反应混合液
[0181]
[0182] 注：配制HBV反应混合液时，请计算阴阳性对照的数量。
[0183] 配制的HBV反应混合液需振荡混匀，离心20秒去除气泡后再分装到PCR扩增用反 应管中。
[0184] 2.2HBV 扩增参数：
[0185] A.在PCR扩增用反应管中分装15 μ 1 HBV反应混合液（PCR扩增用反应管推荐使 用 Axygen 0· 2ml 平盖八联管，Cat No :管 PCR-0208-C、盖 PCR-2CP-RT-C);
[0186] B.取制备好的样品核酸10 μ 1 (浓度彡1000IU/ml)到加入上述PCR扩增反应管 中，盖上盖子，轻微震荡混匀，离心20秒去除气泡；
[0187] C.将PCR扩增用反应管放到PCR仪上进行扩增；
[0188] D.循环条件设置：
[0189] Step 1 :37°C 2min 1 个循环；
[0190] Step 2 :5CTC 5min 1 个循环；
[0191] Step 3 :94°C 5min 1 个循环；
[0192] St印 4 :94°C 30s，6(TC 45s ;50 个循环；
[0193] Step 5 ：72〇C 7min ；
[0194] Step 6 :10 °C 保存；
[0195] 其中，对于反应A液中的UNG酶，在开始PCR扩增步骤之前，进行37°C保温2mins， 随后50°C保温5mins对UNG酶进行灭活。
[0196] E.当PCR反应进入10°C保存状态时取出，PCR结束。
[0197] 三、探针杂交及结果读取
[0198] 3. 1将上述C盒中的磁珠杂交液（含有探针磁珠的杂交液）充分混匀，使磁珠均匀 悬浮在杂交液中，将20 μ L磁珠杂交液分别加入到扩增结束的PCR反应管中，放入恒温震荡 器中，50°C 30分钟。
[0199] 3. 2将100 μ L已稀释好的洗液C加入到PCR反应管中，与管中液体充分混合后全 部移入96孔微孔板中。
[0200] 将96孔微孔板放置在磁板架上，静置1分钟后，缓慢将液体吸出，磁珠留在孔底。
[0201] 3. 3将SAPE在洗液C中稀释250倍后，取100 μ L加入每个留有磁珠的微孔板中。 在振荡器上震荡5分钟。
[0202] 3. 4将96孔板移至带磁板洗板机上，选择条洗模式，洗板5次，冲液量350 μ L，静 置间隔40秒每次。
[0203] 3. 5洗板结束后，每孔加入100 μ L检测液，放入Applied Biocode (ABC)信号读取 仪读取荧光信号。（如有气泡，需将气泡去除后再放入信号读取仪）。
[0204] 四、结果判定
[0205] 1、结果分析由软件（如HBV genotyping&DRM软件，苏州新波生物技术有限公司） 来完成，各个探针的cutoff值已设置在分析软件中。
[0206] 2、各个探针设定突变信号cutoff值如下表：
[0207]
[0208]
[0209] -般判定顺序如下：
[0210] 1)、HQC 判定
[0211]
[0212] 2)、NC 判定
[0213]
[0214] 3)、PC 判断
[0215]
[0216] 4)、一般样本判定
[0217]
[0218] 3、常见结果判定如下：
[0219]
[0221] 注：1C信号在阳性样本中，信号值可以忽略。
[0222] 只有QC、IC为阳性时，说明样品中存在HBV DNA。
[0223] 本实施方式的试剂盒可以对乙肝耐药突变位点和基因分型进行定性检测，并且可 对10个耐药突变位点（169、173、180、181、184、194、202、204、236、250)进行检测，同时可对 国内常见四种基因型A、B、C和D型进行分型检测，因此，可用于临床上对HBV患者在长期用 药产生的耐药突变进行监测，对于用药具有重大的参考价值。
[0224] 五、本实施例产品的性能指标如下：
[0225] 1、检测限度：1000IU/ml。
[0226] 2、检测型别和耐药位点为：A、B、C、D共4种基因型，169、173、180、181、184、194、 202、204、236、250 共 10 个位点。
[0227] 3、干扰试验：本品检测不受样本中甘油三酯（5mg/ml)、血红蛋白（0. 5mg/ml)、胆 红素（30mg/ml)的影响。
[0228] 4、交叉反应试验：本品检测不受标本中巨细胞病毒、EB病毒带状疱疹病毒、单纯 疱疹病毒I，Π 型、丙肝病毒、HIV-2型病毒的影响。
[0229] 5、标本类型试验：本品对血清、EDTA抗凝血浆、枸橼酸钠抗凝血浆三种类型的标 本具有一致的检测效率。
[0230] 6、抗病毒药物：本品检测不受标本中抗病毒药物（齐多夫定、利巴韦林等）的影 响。
[0231 ] 7、自身抗体：本品检测不受标本中ANA (抗核抗体）、ΑΜΑ (抗线粒体抗体）等自身 免疫性抗体的影响。
[0232] 本发明利用微编码磁珠为基础的液相芯片技术作为技术平台，综合HBV在国内感 染型别和常见耐药位点突变情况进行试剂盒的开发，使其可同时鉴别4种不同基因型别和 10个耐药位点，对于长期服药的乙型肝炎病人的治疗起到一定的辅助作用。
[0233] 实施例1使用上述试剂盒检测临床样本中的HBV耐药突变情况和常见基因型的判 别。
[0234] 用上述试剂盒对100例感染乙肝病毒临床样本进行检测，取临床样本300 μ 1用 试剂盒Α盒在Ezbeads上进行提取，分4次进行提取，同时提取的有阴性对照和阳性对照， 将提取的样本DNA用试剂盒B盒按照试剂盒要求进行扩增反应，扩增结束后，取扩增产物 10 μ 1与磁珠杂交液混合，加1个杂交对照孔，进行杂交反应，按照试剂盒要求得到每个样 本的信号值，在软件中判别结果。将Α盒中提取的DNA，用SEQ ID Ν0. 1-2所示的引物进行 扩增后，得到的扩增产物，上海生工公司提供测序服务，并提供测序报告，将本试剂盒的检 测结果和测序金标准相比较，统计结果见下表。
[0235] 本发明与金标准（测序法）比较结果
[0236]
[0238] 部分样本检测信号值结果如下：
[0239]
[0245] 上述试剂盒对100份未知临床样本进行检测，对于10个耐药突变位点（169,173， 180，181，184，194,202,204,236,250)和4个国内常见基因型（基因型A，基因型B，基因型 C，基因型D)，具有很好的检测能力，与测序结果比较符合率100 %，准确性高。
【主权项】
1. 一种乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒，其特征在于，包括：核酸 扩增试剂和杂交试剂； 其中，所述核酸扩增试剂包括：如SEQ ID NO. 1-2所示的引物； 杂交试剂包括：如SEQ ID NO. 3-31所示的探针。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述SEQ ID NO. 2所示引物的5'端还连 接有生物素； 所述SEQ ID NO. 3-31所示探针的5'端标记有amin〇-C6 ; 所述杂交试剂包括：与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探针。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述与带有编号的磁珠进行偶联后的如 SEQ ID NO. 3-31所示的探针的制备方法为包括以下步骤的方法： A. 将29种不同编号的磁珠溶液分别转移到管中，离心，去除上清液； B. 取MEST溶液分别加入每管中，离心，去除上清液； 其中，MEST溶液是含体积浓度为0. 01% -0. 05% Tween20和50mM~lOOmM pH5~7的 2-吗啉乙磺酸的混合溶液； C. 重复步骤B -次； D. 加入水、4XMEST溶液，并且分别对应每种磁珠加入如SEQ ID NO. 3-31所示的探针； E. 配制含10mg/ml~5mg/ml N-(3-二甲基氨丙基）-N' -乙基碳二亚胺的MEST溶液， 将其加入到每个磁珠管中，震荡； F. 重复步骤E -次； G. 将TNT溶液加入磁珠管中，震荡混匀，离心，去除上清液； 其中，TNT 溶液是含 25 ~50mM Tris-HCl、0.05 ~0.2M NaCl、0.01 ~0.05vol%Tween 20的溶液； H. 重复步骤G -次； I. 将浓度为lg/l〇〇ml~5g/100ml的SDS溶液加入磁珠管中，离心，去除上清液； J. 重复步骤G -次，用上述TNT溶液洗涤磁珠； K. 加入TE溶液，得到与带有编号的磁珠进行偶联后的探针；其中，TE溶液是含有10~ 30mM Tris-HCl 和 1 ~5mM EDTA 的 pH7 ~8 的溶液。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述步骤A中，磁珠溶液的浓度为250K个 磁珠 /ml ; 步骤D中，探针浓度为50~100 μ Μ。5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增试剂还包括：KCl、Tris-HCl 缓冲液、Taq酶和UNG酶、dNTPs和MgCl2; 所述杂交试剂还包括：杂交液、荧光反应液、杂交洗液和检测液； 其中，杂交液的组分为：四甲基氯化铵2~5M、Tris-HCl 20~60mM pH8、N-月桂酰肌 氨酸钠 〇· lg/l〇〇ml ~0· 5g/100ml、EDTA 4 ~8mM ; 荧光反应液包括：链霉亲和素-R-藻红蛋白SAPE ; 杂交洗液的组分为：Na2HP04 0· 2 ~0· 6M、NaH2P04 25mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、体 积浓度为10~30%的Tween20 ; 检测液的组分为：Na2HP04 0· 2 ~0· 6M、NaH2P04 25mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、体积 浓度为10~30%的Tween20、体积浓度为0· 2~0· 5%的Triton X-100。6. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、阳性 对照品、阴性对照品、杂交质控品以及内标。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂包括：磁珠悬浮液； 阳性对照品，是包含如SEQ ID NO. 32所示序列的质粒； 阴性对照品，是由HBV病毒阴性血清液配制为阴性对照品； 杂交质控品，是如SEQ ID NO. 33所示的核酸序列； 内标，是包含人类看家基因 β-globin序列的质粒。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品是包含如SEQ ID NO. 32 所示序列的PUC57质粒； 所述内标为包含如SEQ ID NO. 34所示序列的pUC57质粒； 所述核酸提取试剂还包括以下组分： 1) 裂解液，其是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氰酸 胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为2M~6M，TritonX-100或 Tween-20的体积浓度为1 %~2% ; 2) 结合液，其是含高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液；其中，高氯酸盐包括：高 氯酸钠；醋酸盐包括：醋酸钠；有机溶剂包括：乙醇；高氯酸盐的浓度为17g/100mL~ 3(^/1001^，醋酸盐的浓度为1 8/1001^~1(^/1001^，有机溶剂的体积浓度为40%~60%; 3) 洗液A，其是含高氯酸钠、醋酸盐和乙醇的水溶液，其中，高氯酸钠的浓度优选为 10g/100mL~30g/100mL,醋酸盐的浓度为4g/100mL~15g/100mL,乙醇的体积浓度为 35%~50% ; 所述醋酸盐包括：醋酸钠； 4) 洗液B，其为体积浓度40 %~80 %的乙醇； 5) 洗脱液，其为 10 ~20mM pH8. 0 的 Tris-HCl ; 6) 蛋白酶K。 7. RNA的聚合酶A。9. 一种如权利要求1所述的乙型肝炎病毒的耐药突变位点和基因型检测试剂盒的使 用方法，其特征在于，包括步骤： 1) 样本的核酸提取 利用权利要求7所述的核酸提取试剂，并按照磁珠法，对样本、阳性对照和阴性对照同 时进行核酸提取，得到PCR模板，并且内标在进行核酸提取之前加入每个样本中； 其中，样本包括：血清或者血楽； 2) 扩增试剂配制： 反应A液，其组分为：盐缓冲液、Taq酶、UNG酶和dNTPs ; 其中，盐缓冲液的终浓度为含30~60mM KC1的10~20mM pH8. 0-8. 5的Tris-HCl缓 冲液； Taq酶3~7U/次检测； UNG酶0. 1~0. 5U/次检测； dNTPs 10 ~30mM ; 反应B液：含如SEQ ID NO. 1所示的引物F和如SEQ ID NO. 2所示的引物R的1%(：12溶 液；其中，引物F的浓度为50~ΙΟΟηΜ，引物R的浓度为200~500nM，MgCl2&浓度为20~ 60mM ； 将反应A液和反应B液混合形成扩增试剂；其中，反应A液和反应B液的混合体积比为 1:2 ~1:4 ; 3. PCR扩增：在步骤1)中的PCR模板中分别加入步骤2)的扩增试剂进行PCR扩增反 应； 其中，对于反应A液中的UNG酶，在开始PCR扩增步骤之前，进行37°C保温2mins，随后 50°C保温5mins对UNG酶进行灭活； PCR扩增方法包括以下步骤： Step 1 :37°C 2min 1 个循环； St印 2 :50°C 5min 1 个循环； Step 3 :94°C 5min 1 个循环； St印 4 :94°C 30s，6(TC 45s ;50 个循环； Step 5 ：72〇C 7min ； Step 6 :10 °C 保存； 4) 杂交反应：将与带有编号的磁珠进行偶联后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探针和权 利要求5所述的杂交液混合后，加入到PCR产物中，50~60°C、1200~1400rpm进行杂交反 应15-30min，同时，杂交质控品参与整个杂交过程； 5) 荧光反应：吸除杂交反应物的上清，将底部的磁珠中加入权利要求5所述的荧光反 应液，振荡反应5-15min ; 6) 检测：荧光反应产物用权利要求5所述的杂交洗液洗涤后，加入权利要求5所述的 检测液，在液相芯片检测仪上进行荧光检测； 7) 根据检测反应体系中的荧光信号值来确定HBV的耐药性突变和基因型情况。10. -种如权利要求1~8中的任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒 用于检测以下的耐药位点和乙型肝炎病毒型别； 其中，耐药位点包括：第169位的I - T的突变位点、第173位的V - L的突变位点、第 180位的L - Μ的突变位点、第181位的A - V的突变位点或第181位的A - T的突变位 点、第184位的T - G的突变位点、第194位的A - T的突变位点、第202位的S - G的突 变位点或第202位的S - I的突变位点、第204位的Μ - V的突变位点或第204位的Μ - I 的突变位点、以及第250位的Μ - V的突变位点； 型别包括：乙型肝炎病毒基因型Α、基因型Β、基因型C和基因型D。
【文档编号】C12Q1/68GK105986039SQ201510041667
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】张健, 陈丽丽, 张淼
【申请人】苏州新波生物技术有限公司