一种新城疫病毒强毒株的荧光rt-pcr检测方法
【专利摘要】本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，先设计针对基因III、VI、VII、XII型新城疫病毒强毒株F基因的荧光RT-PCR扩增引物和探针；再提取待测样品核糖核酸（RNA），用扩增引物和探针进行荧光RT-PCR反应，根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值判定样品中是否含有新城疫病毒强毒株；本发明具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点，可实现新城疫快速检测，满足早期诊断和出入境快速检验检疫的需要，便于基层操作和推广应用。
【专利说明】_种新城疫病毒强毒株的焚光RT-PGR检测方法
[0001]
技术领域； 本发明属于动物病原检测技术领域，涉及一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方 法。
[0002]
【背景技术】： 新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) 强毒感染所引起的一种禽的急性、高度接触性传染病。新城疫强毒感染禽类后，可导致禽类 出现典型的新城疫症状和病理变化，死亡率高达100%，给养禽业造成巨大经济损失。我国农 业部将新城疫列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(0ΙΕ)将其列为法定报告疫病。在国务 院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中，新城疫被确定为国家优先防 控的动物疫病之一。
[0003] 新城疫病毒具有多样性，根据新城疫病毒致病性差异，可分为弱毒株、中等毒力株 和强毒株。根据新城疫病毒遗传学特性可分为两大类(I类和II类），其中I类新城疫病毒包 括9个基因型，均为弱毒株；II类新城疫病毒包括18个基因型，目前我国分离到的II类新城 疫病毒主要为基因 I型、II型、VI型、VII型等，其中基因 I型和II型大多为弱毒株。目前，对于 新城疫病毒的防控主要采用疫苗免疫，临床使用的活疫苗主要为La Sota株(基因 II型）和 V4株(基因 I型）。由于我国普遍使用活疫苗以及大量弱毒株的存在，从家禽中分离出新城疫 病毒并不一定说明发生了新城疫，还必须对病毒进行致病性评价。因此，单纯检测NDV的血 清学(血凝抑制试验）、分子生物学(RT-PCR)技术已无法满足进行快速确诊和早期诊断的需 求。传统的病毒致病性评价一般采用病毒分离与鉴定的方法，虽然检测的特异性强，但检测 所需的周期长，且需要一定级别的生物安全实验室，而分子生物学方法RT-PCR需要对扩增 产物进行序列测定。因此，建立一种特异性强、敏感性高，且能检测所有不同基因型新城疫 强毒株的快速有效的检测方法，对于开展疫病的早期诊断、防止疫情进一步扩散蔓延具有 重要意义。
[0004] 中国动物卫生与流行病学中心国家新城疫参考实验室多年系统的监测表明，我国 流行的新城疫强毒包括基因 ΠΙ型、VI型、VII型和XII型等多种基因型并存，给该病的快速 诊断带来巨大挑战。传统的新城疫病毒毒力测定方法为生物学试验，即依据鸡胚平均致死 时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI)、6周龄鸡静脉致病指数(IVPI)来鉴定，此方法 费时、费力，且需要在一定级别的生物安全实验室内操作，不适合大规模推广应用。常规的 RT-PCR技术结合序列测定也可鉴定病毒毒力，但与荧光RT-PCR技术相比，该方法所需时间 较长，不能满足第一时间确诊的需求。
[0005]
【发明内容】
： 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种新城疫强毒的荧光 RT-PCR检测方法，设计针对新城疫强毒F基因的荧光RT-PCR扩增引物和探针，建立能检测所 有新城疫强毒的荧光定量RT-PCR方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明先从待检样本(棉拭子、组织病料或病毒分离物）中提 取病毒基因组RNA，以新城疫强毒F基因为靶基因，通过荧光RT-PCR引物CIIH-172F、CIIH-389R和探针HP-353R对提取的RNA模板进行荧光RT-PCR扩增，并根据扩增曲线和Ct值分析被 检样品中是否含有新城疫强毒，其具体过程为： (1)、RNA提取:采用Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA，具体步 骤为：取200 yL待检样本加入1.5 mL离心管中，再加入400 yL裂解液(Lysis Buffer)，颠 倒混匀，室温静置10 min得到混合液；将混合液移入离心柱中，在8000 rpm条件下离心1 min;清空收集管，向离心柱中加入500 液I(Wash Buffer I)，8000 rpm离心1 min;清 空收集管，向离心柱中加入450 液II(Wash Buffer II)，8000 rpm离心1 min，并再次 重复此步骤1次;清空收集管，10000 rpm离心1 min，将离心柱转移至新离心管内；向离心柱 中加入100 yL RNA溶解液(Elution Buffer)，10000 rpm离心1 min，收集病毒RNA。本过程 也可用其它RNA提取试剂盒代替。
[0007] (2)、荧光 RT-PCR 扩增：采用 Invitrogen 荧光定量 RT-PCR 试剂盒（Superscript 懸 III Platinum馨One-Step Quantitative RT-PCR System)进行焚光RT-PCR反应，反应体系 (20 yL)为：Taq Mix 0.5 yL，2XRection Mix 10 yL，上游引物（20 pmolAiL)0.5 yL，下游 引物（20 pmolAiL)0.5 yL，探针（10 pmolAiL)0.5 yL，RNA模板2 yL，双蒸水6 yL;反应程 序：50 °C反转录30 min，95 °C预变性3 min后，进行94 °C 15 s，60 °C 1 min，共45个循 环，60 °C收集焚光信号。
[0008] (3)、结果判定:根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值进行结果判定，若样品出现扩增 曲线，且Ct值< 35，判定为阳性，若样品出现扩增曲线，且35<Ct值<40，判定为疑似，若样 品无扩增曲线或Ct值2 40，判定为阴性。
[0009] 本发明中所述荧光RT-PCR引物为： CIIH-172F:5，-ACAGGGTCAATCATAGT -3，； CIIH-389R:5'-GCAACCCCAAGAGCTACA -3'； 荧光RT-PCR探针HP-353R: 5 ' -ATRAAGCGTTTYTGYCTCCTTCCTCC -3 '，其中 5 ' 端连接Cy5荧 光基团，3 '端连接BHQ-3淬灭基团；探针序列中R和Y为简并碱基，R表示碱基A和碱基G的混合 物，Y表示碱基C和碱基T的混合物。
[0010] 本发明与传统的生物学方法及常规分子生物学方法相比，其方法简单、操作方便、 特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低，能够快速检测出所有的新城疫强毒，具有良好的 覆盖性和敏感性，适合高通量快速检测，而且对临床样本的检测结果与常规分子生物学检 测方法所得结果一致，能够及时对禽类染病情况以及周边环境的病毒污染状况作出确诊， 以便在最短时间内做出正确的处置，对开展疫情的早期诊断和快速预警、开展大规模主动 监测和流行病学调查，以及疫情扑灭效果评估等具有重要的意义。此外，在禽产品出入境的 快速检验检疫中也具有重要意义。
[0011]
【附图说明】： 图1为本发明实施例2的特异性检测结果，检测所用样品为I类新城疫病毒、II类新城疫 强毒、II类新城疫弱毒、禽副黏病毒4型、H5N1亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸡传 染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和双蒸水，其中II类新 城疫强毒样品经荧光RT-PCR反应后可见扩增曲线，其余病毒样品及双蒸水未出现扩增曲 线。
[0012] 图2为本发明实施例3的敏感性检测结果，检测所用7株新城疫强毒分别为pigeon/ 611已]^(1〇1^/018/2010(基因111型）、(111〇1<:/611&1^(1〇1^/017/2010(基因111型）、卩186〇11/ Guangxi/1015/2013(基因 VI型）、pigeon/Yunnan/llll/2013(基因 VI型）、chicken/ Ningxia/S020/2013(基因 VII型）、chicken/Anhui/41/2011(基因 VII 型）、Pigeon/ Guangzhou/2079/2013(基因 XII型），经荧光RT-PCR反应后所有不同基因型新城疫强毒均出 现特异性的扩增曲线，阴性对照未出现扩增曲线。
[0013] 图3为本发明实施例4的灵敏度检测结果，其中1、2、3、4、5、6、7依次为病毒含量为 105 ~10-1 EIDso/0.1 mL 的样品（pigeon/Guangxi/1015/2013)的荧光 RT-PCR 扩增曲线。
[0014]
【具体实施方式】： 下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步说明。
[0015] 实施例1:临床样品检测 本实施例的具体步骤为： (1) 、样品采集:分别采集组织样品和棉拭子在2~8 °C保存备用，其中组织样品为病死 或发病禽类的脑、肺、肝等组织;棉拭子为口咽、泄殖腔拭子； (2) 、样品处理:对每份样品分别处理 1)组织样品处理:称取待检组织样品100 mg置研磨器中，加入0.8 mL含青霉素(2000 1]/1111〇和链霉素(2 11^/1111〇的磷酸盐缓冲液(？83;?!17.0~7.4)，室温静置1~2 11或置于37 °C反应30~60 min后，再在4 °C、1000 rpm条件下离心10 min取上清液备用； 2)棉拭子处理:将棉拭子置0.8 mL含青霉素(2000 U/mL)和链霉素(2 mg/mL)的roS中 充分捻动，拧干后弃去拭子，室温静置1~2 h或置于37 °C反应30~60 min，再在4 °C、 1000 rpm条件下离心10 min取上清液备用； (3) 、病毒繁殖:取组织样品上清液或棉拭子样品上清液0.2 mL经尿囊腔接种9~11日 龄无特定病原（SPF)鸡胚，接种后在37 °C孵育3~4天，收集孵育24 h后的死胚和培养结束 时存活的鸡胚尿囊液，并测定血凝(HA)效价，保存HA阳性鸡胚尿囊液样品； (4) 、引物设计:在建立的新城疫病毒毒株资源库和基因型数据库的基础上，分析所有 新城疫强毒株(基因 ΠΙ型、VI型、VII型、XII型）和弱毒株(基因 I型、II型）的F基因序列，寻 找强毒株、弱毒株基因差异区域，设计针对所有基因型新城疫强毒株的特异性荧光RT-PCR 引物及探针，引物工作浓度为20 pmolAxL，探针工作浓度为10 pmolAxL，所用引物和探针见 表1; 表1:荧光RT-PCR检测方法所用引物、探针
(5) 、病毒RNA提取:取HA阳性鸡胚尿囊液，采用Roche公司生产的High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA，具体步骤为:取200 uL待检样本加入1.5 mL离心管中，再加入400 uL裂 解液(Lysis Buffer)，颠倒混勾，室温静置10 min得到混合液;将混合液移入离心柱中，在 8000 rpm条件下离心1 min;清空收集管，向离心柱中加入500 yUjfe液I(Wash Buffer I)， 8000 rpm离心1 min;清空收集管，向离心柱中加入450 yUjfe液II(Wash Buffer II)，8000 rpm离心1 min，并再次重复此步骤1次;清空收集管，10000 rpm离心1 min，将离心柱转移至 新离心管内；向离心柱中加入100 yL RNA溶解液(Elution Buffer)，10000 rpm离心1 min， 收集病毒RNA。
[0016] (6)、荧光 RT-PCR 反应：采用 Invitrogen 荧光定量 RT-PCR 试剂盒（Superscript? III Platinum_One_Step Quantitative RT-PCR System)进行焚光RT-PCR反应，反应体系 (20 yL)如下：
反应程序设定为50 °C 30 min;95 °C 3 min;94 °C 15 s，60 °C 1 min，45个循环， 60 °C收集焚光信号。
[0017] (7)、结果判定:根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值判定样品中是否含有新城疫强毒 株，样品出现扩增曲线且Ct值< 35，判定为阳性，样品出现扩增曲线且35<Ct值<40，判定 为疑似，样品无扩增曲线或Ct值2 40，判定为阴性。
[0018] 实施例2 :引物和探针的特异性检测 本实施例对引物和探针的特异性检测的具体过程为： (1) 、RNA提取:分别取I类新城疫病毒、II类新城疫强毒、II类新城疫弱毒、禽副黏病毒4 型、H5N1亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管 炎病毒和鸡传染性法氏囊病病毒，并对各病毒分别提取RNA，RNA的提取方法同实施例1步骤 (5)； (2) 、荧光RT-PCR反应：以引物CIIH-172F、CIIH-389R和探针HP-353R对步骤（1)中提取 的RNA模板进行荧光RT-PCR扩增，同时以双蒸水作为阴性对照，方法同实施例1步骤(6); (3) 、结果判定：以新城疫强毒为模板进行荧光RT-PCR反应后可见扩增曲线，且Ct值< 35,其它病毒和阴性对照无扩增曲线，如图1所示。
[0019] 实施例3:引物和探针的敏感性检测 本实施例对引物和探针的敏感性检测的具体过程为： (1) 、样品准备和RNA提取:选取7株分离自不同地区、不同时间、不同宿主和不同基因型 的新城疫强毒的尿囊液进行敏感性检测，分别提取RNA，RNA提取方法同实施例1步骤(5); (2) 、荧光RT-PCR反应：以引物CIIH-172F、CIIH-389R和探针HP-353R对步骤（1)中提取 的RNA模板进行荧光RT-PCR扩增，同时以双蒸水作为阴性对照，方法同实施例1步骤(6); (3 )、结果判定：以7株新城疫强毒为模板进行荧光RT-PCR反应后，均出现扩增曲线，且 ct值< 35，阴性对照无扩增曲线，如图2所示。
[0020] 实施例4:引物和探针的灵敏度检测 本实施例对引物和探针的灵敏度检测的具体过程为： (1) 、鸡胚半数感染量(EID5Q)测定:将病毒原液做10倍倍比稀释，取10-4~ΚΓ9病毒稀释 液接种鸡胚，每种病毒稀释液样品接种5枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.1 mL病毒稀释液，弃掉24 h内死亡鸡胚，连续观察5天，记录鸡胚死亡情况，按照现有Reed-Muench法计算EID50; (2) 、稀释液的制备和RNA提取:根据病毒的EID5Q值稀释样品，灵敏度检测样品包括病 毒滴度分别为1〇 5~10-2 EID5Q/(hl mL的新城疫强毒(pigeon/Guangxi/1015/2013)，分别对 上述灵敏度检测样品提取RNA，RNA提取方法同实施例1步骤(5); (3) 、以引物CIIH-172F、CIIH-389R和探针HP-353R对步骤(2)中提取的RNA模板进行荧 光RT-PCR扩增，方法同实施例1步骤(6); (4) 、结果判定:病毒滴度为105~ΠΓ1 EID5Q/0.1 mL的新城疫强毒样品经荧光RT-PCR反 应后出现扩增曲线（如图3所示），说明引物和探针对新城疫强毒样品的检测下限可达ΠΓ 1 EID50/0.1 mL。
[0021] 本实施例具有特异性强、灵敏度高的特点，检测结果与常规分子生物学检测方法 (RT-PCR方法和Sanger法测序技术)所得结果一致，该方法操作简单、快捷，只需要2~2.5小 时即可检测出新城疫强毒，且成本低廉，通过对大量临床样品进行检测，证明本方法便于基 层操作和推广应用，适合开发相应的荧光RT-PCR试剂盒，用于新城疫的临床诊断、疫情监测 和出入境检验检疫。
【主权项】
1. 一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于先进行引物和探针设 计，设计针对新城疫病毒强毒株F基因的荧光RT-PCR扩增引物和探针，再提取待测样品核糖 核酸(RNA)，用扩增引物和探针进行荧光RT-PCR反应，根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值判定 样品中是否含有新城疫病毒强毒株。2. 根据权利要求1所述的一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于 所述的引物设计:选取II类新城疫强毒株与弱毒株F基因序列，根据MEGA软件的核苷酸序列 比对结果，通过Primer Premier软件设计针对新城疫病毒强毒株的上游引物、下游引物和 探针，上游引物、下游引物扩增片段长度为218 bp，探针5'端连接荧光基团，3'端连接淬灭 基团，引物和探针序列分别为： 上游引物（CIIH-172F):5'-ACAGGGTCAATCATAGT-3' ； 下游引物（CIIH-389R):5'-GCAACCCCAAGAGCTACA-3' ； 探针（HP-353R): 5 ' - ATRAAGCGTTTYTGYCTCCTTCCTCC-3 '。3. 根据权利要求2所述的一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于 所述的荧光基团为Cy5，淬灭基团为BHQ-3。4. 根据权利要求1所述的一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于 所述的提取待测样品RNA是使用商业化RNA提取试剂盒，或用TRIZOL裂解液处理待测样品， 三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到RNA。5. 根据权利要求1所述的一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于 所述的用特异性引物和探针进行荧光RT-PCR反应：反应体系包含Taq Mix 0.5yL，2 X Rection Mix 10yL，上游引物（20 pmolAxL)0.5yL，下游引物（20 pmolAxL)0.5yL，探针（10 pmolAiL)0.5yL，RNA模板2yL，双蒸水6yL，总体积20yL;反应程序：50 °C反转录30min，95 °C 预变性3min后，进行94 °C 15s，60 °C lmin，共45个循环，60 °C收集荧光信号。6. 根据权利要求1所述的一种新城疫病毒强毒株的荧光RT-PCR检测方法，其特征在于 根据荧光RT-PCR扩增曲线和Ct值判定样品中是否含有新城疫病毒强毒株，若样品出现扩增 曲线，且Ct值< 35，判定为阳性，若样品出现扩增曲线，且35<Ct值<40，判定为疑似，若样 品无扩增曲线或Ct值2 40，判定为阴性。
【文档编号】C12Q1/70GK105986046SQ201610118137
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年3月2日
【发明人】刘华雷, 王静静, 劳秀杰, 吕艳, 郑东霞, 赵云玲, 王志亮
【申请人】中国动物卫生与流行病学中心