多孔结构及其制造方法

多孔结构及其制造方法
【专利摘要】根据本发明的多孔结构在其孔内部具有聚合酶链式反应(PCT)的引物，并且因此不同于仅表面用于扩增和检测的一般结构，甚至其内部部分也可使用，从而使反应性最大化。此外，相应结构中所包含引物种类的区别导致同时检测数种靶核酸并且同时对其进行实时分析，由此可用于多重实时PCR。
【专利说明】
多孔结构及其制造方法
技术领域
[0001] 本说明书中描述的公开内容涉及包含引物的多孔结构、所述多孔结构的制造方法 以及使用所述多孔结构的多重实时核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法是通过克隆核酸的碱基 序列对其进行扩增的技术，并且有终点PCR(endpoint PCR)和实时PCR(real-time PCR)。迄 今，通常使用终点PCR，但是通过该方法，仅在PCR反应完成之后才可检测或量化所扩增的核 酸，因此存在以下问题:在实验之后需要单独的所得物分析步骤(例如电泳)及用于此的设 备，需要2小时或更久的长时间并且不能实时地检测或量化所扩增的核酸。例如，需要由在 反应完成之后获得的PCR产物量化第一核酸，但是由于影响分析的多种因素而难以精确地 量化第一核酸，即使采用荧光染色等也是如此。在指数期测量核酸的精确量，但是由于通过 终点PCR不能进行实时测量而难以通过其分析精确量。
[0003] 相比之下，实时PCR具有以下优势：由于每个周期测量所扩增核酸的量而可精确地 量化第一靶核酸，并且特别地可通过监测器实时地确认处于指数期(其为扩增发生的时段） 的反应。特别地，疾病诊断领域中广泛地使用多重实时核酸扩增方法(多重实时PCR)，因为 其可在单个室中通过一次实验确任多种生物标志物并且对其进行实时定量分析。
[0004] 然而，由于靶标之间的干扰随其测量数目的增加而增加，因此通过以下方法难以 进行精确测量，所述方法为用于多重实时核酸扩增并且使用探针的颜色和引物解链点的最 常用方法。因此，在需要通过同时且快速地分析很多不同种类核酸来精确地诊断疾病(例如 即时护理技术(P〇int-〇f-care technology，P0CT))的领域中难以使用多重实时核酸扩增 方法。
[0005] [引用列表]
[0006] [专利文献]
[0007] [专利文献1]韩国专利登记号10-0794699
[0008] [专利文献2]韩国专利申请公开号10-2008-0103548
[0009] 发明概述
[0010] 技术问题
[0011] 本发明的一个目的是提供为用于多重实时核酸扩增(多重实时PCR)之结构的多孔 结构、所述多孔结构的制造方法以及通过使用该结构可同时且精确地实时分析多种核酸的 多重实时核酸扩增方法。
[0012] 问题的解决方案
[0013] 为了实现上述目的，本发明的一个实施方案提供了包含孔的多孔结构，
[0014] 所述多孔结构包含作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向 引物一个或更多个方向上的引物，所述引物固定于所述孔的内部。
[0015] 另外，本发明的一个实施方案提供了用于制造多孔结构的方法，所述方法包括：
[0016]制备结构形成溶液，其包含预聚物(pre-polymer)、致孔剂以及作为聚合酶链式反 应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物中一个或更多个方向的引物；
[0017]如下以液滴(droplet)形式形成结构:使油通过微通道的一个通道，所述微通道由 包括以直角相互交叉之截面的两个通道组成，并使如上制备的结构形成溶液通过另一通道 从而使所述结构形成溶液分散在交叉截面的油相中；
[0018] 固化由此形成的结构；以及
[0019] 通过从经固化结构中除去所述致孔剂在该结构中形成孔。
[0020] 本发明的另一个实施方案提供了用于制造多孔结构的方法，所述方法包括：
[0021] 制备结构形成溶液，其包含预聚物、致孔剂以及作为聚合酶链式反应(PCR)之引物 的靶核酸的正向引物和反向引物一个或更多个方向上的引物；
[0022] 通过将如上制备的结构形成溶液点样在阵列上形成液滴形结构；
[0023]固化该结构；以及
[0024] 通过从经固化结构中除去所述致孔剂在该结构中形成孔。
[0025] 本发明的又一个实施方案提供了用于多重实时核酸扩增的设备，其包含：
[0026] -个或更多个上述的多孔结构；以及
[0027] 阵列，其具有以凹陷(well)形式图案化的表面以便布置所述多孔结构。
[0028] 另外，本发明的一个实施方案提供了多重实时核酸扩增方法，其包括：
[0029] 将一个或更多个上述的多孔结构注入室中，所述室包含具有以凹陷形式图案化之 表面的阵列，并将所述多孔结构布置在阵列上；
[0030] 将包含一种或更多种靶核酸的溶液注入所述室中并将所述溶液引入所述多孔结 构的孔中；以及
[0031 ]通过靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增靶核酸。
[0032]发明的有益效果
[0033] 根据本发明的多孔结构在孔内部具有聚合酶链式反应(PCR)引物，因此不同于仅 使用表面的典型结构，甚至该结构的内部在扩增和检测中也可得到利用，以使得反应性最 大化。
[0034] 另外，所述多孔结构用于多重实时核酸扩增(多重实时PCR)，因为其可通过改变相 应结构中所包含引物的种类来同时检测多种靶核酸并同时对其进行实时分析，并且所述多 孔结构可用于需要通过同时且快速地分析很多不同种类的核酸来精确地诊断疾病(例如即 时护理技术(P0CT))的领域。
[0035] 附图简述
[0036] [图1]图1示出了根据本发明一个实施方案之多孔结构的内部结构，并且左侧的球 形是根据本发明一个实施方案之多孔结构的示意图。具体地，右侧4个方框中左上部的图示 出了其中固定了作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一个方 向上的引物(红色）的构造，右上部的图示出了其中正发生与该引物结合之靶核酸的聚合酶 链式反应(PCR)的构造，左下部的图示出了其中固定了正向引物和反向引物一个方向上的 引物并且该引物通过接头(深蓝色）固定的构造，右下部的图示出了其中正向引物(红色)和 反向引物(浅蓝色)二者通过接头固定的构造。
[0037] [图2]图2是这样的示意图，其示出了根据本发明一个实施方案之用于制造多孔结 构的方法(左上部）、通过上述方法制造并且彼此具有不同种类靶标之多孔结构在阵列上的 布置（右上部）、在扩增核酸的同时对核酸的实时检测（右下部），以及对核酸的分析（左下 部)。
[0038] [图3]图3是示出了根据本发明一个实施方案之用于制造多孔结构的方法的示意 图，具体地其示出了通过将多孔结构形成溶液点样在阵列上形成液滴形多孔结构的步骤； 固化以液滴形制造且彼此具有不同种类靶标的多孔结构并从该多孔结构中除去致孔剂的 步骤;以及扩增核酸并同时对其进行实时检测的步骤。
[0039] [图4]图4(A)是这样的示意图，其示出了按照根据本发明一个实施方案的方法通 过使用微通道制造液滴形结构的过程，图4(B)示出了真实拍摄的该过程的照片。
[0040] [图5]图5是这样的示意图，其示出了按照根据本发明一个实施方案的方法通过将 结构形成溶液点样在阵列上制造液滴形结构的方法，在此，该结构的不同颜色表示相应结 构中包含不同种类的引物。
[0041] [图6]图6示出了室，其用于本发明的一个实施方案并且包含具有以凹陷形式图案 化之表面的阵列以便布置多孔结构。
[0042] [图7]图7是示出了多孔结构的定量PCR结果的图，所述多孔结构按照根据本发明 一个实施方案的方法制造。
[0043] [图8]图8是示出了根据本发明一个实施方案之多孔结构的照片的图，使用CCD照 相机在定量PCR之前和之后拍摄所述照片。
[0044] [图9]图9示出了经受从通道1至通道3顺序电泳，然后进行测量之根据本发明一个 实施方案的多孔结构Chl-3的照片(左侧)和每个循环测量之荧光强度的图。
[0045][图10]图10示出了使用CCD照相机在(a)qPCR之前、（b)qPCR期间（第42个循环）和 (c)qPCR之后拍摄的根据本发明一个实施方案之多孔结构Chl-3的照片。
[0046] [图11]图11示出了每个循环测量之根据本发明一个实施方案的多孔结构Chl-3的 荧光强度的图。
【具体实施方式】
[0047] 在下文，将对本发明进行详细描述。
[0048]本发明的一个实施方案提供了包含孔的多孔结构，并且所述多孔结构包含作为聚 合酶链式反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一个或更多个方向上的引物， 所述引物固定于所述孔的内部。
[0049] 在此，所述引物可为10至100个碱基对(bp)，更特别地20至50个碱基对，但是引物 序列的种类和长度可基于靶核酸而改变，并且不受限制。
[0050] 根据本发明一个实施方案的多孔结构可以是其中固定了作为聚合酶反应(PCR)弓丨 物之靶核酸的正向引物和反向引物二者的多孔结构，或者其可以是其中固定了这些中仅一 个方向上的引物的多孔结构。在固定正向引物和反向引物仅一个方向上的引物的情况下， 通过向利用多孔结构之用于多重实时核酸扩增(多重实时PCR)的设备中注入另一种引物来 增强反应性，因为这另一种引物可在多孔结构的孔中自由移动。
[0051] 例如，根据本发明一个实施方案多孔结构的颗粒尺寸可为10WI1至500μπι，更特别 地，其颗粒尺寸可为100μπι至300μπι。所述多孔结构的形状不受限制，只要其是能够在其内部 具有孔的三维结构即可，更特别地，示例可为球形形状。作为用于多孔结构的材料，可使用 能够被固化的预聚物且不受限制，并且特别地，可使用亲水性聚合物，例如聚乙二醇-二丙 烯酸酯(PEG-DA)或聚丙烯酰胺(PA)。另外，作为一个实施方案之多孔结构的孔隙率可为相 对于所述多孔结构总体积的10体积％至80体积％，更特别地50体积％至70体积％。当孔隙 率不在上述范围内时，存在多孔特性可劣化或者结构的稳定性可劣化的问题。
[0052] 根据本发明另一个实施方案的多孔结构可以是这样的多孔结构:通过包含在末端 具有丙烯酰基的引物来当引物末端的丙烯酰基化学结合于多孔结构时，将引物固定于多孔 结构。另外，作为一个实施方案，引物可通过接头连接于多孔结构，并且在此情况下当通过 接头提高了引物的自由程度时，反应性增强，所述引物的自由程度为引物可在孔中移动。接 头的长度为例如5nm至100nm，或者20nm至50nm。可使用聚合物(例如聚乙二醇)或聚合物链 (例如烷基链)作为接头，但是接头的种类不受限制，只要其可与引物和多孔结构化学结合 即可(参见图1)。
[0053] 另外，作为本发明的一个实施方案，所述多孔结构还可包含以下中的一个或更多 个:提供经固定引物之信息的编码物(encoder)和提供在孔中待扩增之核酸的定量信息的 荧光标志物。编码物意指这样的材料，其通过颜色、形状等使固定在相应多孔结构中的固定 引物彼此区别开来，例如量子点呈现出不同颜色的荧光或者可使用具有特定形状的金属、 塑料、玻璃、硅酮等。或者，可不使用编码物而通过使用彼此具有不同尺寸的多孔结构或者 指定相应多孔结构在阵列中的位置来将相应多孔结构中的引物彼此区别开来。
[0054] 荧光标志物使实时地检测靶核酸成为可能，因为其与靶核酸结合以提供荧光信 号。由于荧光标志物可固定于多孔结构并且在通过聚合酶链式反应扩增靶核酸的情况下荧 光强度还提高，因此可通过检测荧光强度来定量待扩增的靶核酸。作为荧光标志物，可使用 任一种而不受种类的限制，只要其通过与靶核酸互补性地结合而呈现出荧光即可。例如，可 使用基于花菁的染料，例如SYBR (DGreen I;在扩增双链核酸时与其结合而呈现出荧光 的内部螯合剂（interchelator )，例如EtBr; 5 '端经焚光物质(FAM等)修饰并且3 '端经猝灭 剂物质(TAMRA等)修饰之核酸的TaqMan?探针，等。在此，TaqMan?探针通过在退火步骤中杂 交而与模板DNA特异性结合但该探针上的猝灭剂抑制荧光的产生，通过杂交与模板结合的 TaqMan?探针在延伸反应时通过属于Taq DNA聚合酶之5 ' -3'核酸外切酶的活性而分解，荧 光染料与探针分离，由此猝灭剂的抑制得以解除，并呈现出荧光。或者，例如，还可使用寡核 苷酸探针(分子信标探针(Molecular Beacon probe))，其形成发夹形二级结构，并且其中 核酸的两端经荧光物质(FAM、TAMRA等)和猝灭剂物质(DABCYL等)修饰。在此，分子信标探针 以分离状态形成发夹结构，并且当荧光物质和猝灭剂物质彼此靠近存在时，抑制荧光的产 生。该探针在退火步骤中通过杂交与模板在互补区特异性结合，此时随着荧光物质与猝灭 剂物质的距离增加，猝灭剂物质的抑制得到解除，由此探针上的荧光染料呈现出荧光。与此 同时，未通过杂交结合的分子信标探针由于其维持发夹结构而不会呈现出荧光。
[0055] 本发明的另一个实施方案是用于制造如上所述之多孔结构的方法，并且提供了用 于制造多孔结构的以下方法(参见图2)，其包括：
[0056] 制备结构形成溶液，所述结构形成溶液包含预聚物、致孔剂以及作为聚合酶链式 反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一个或更多个方向上的引物；
[0057]如下形成液滴形结构：使油通过微通道的一个通道，所述微通道由包括以直角相 互交叉之截面的两个通道组成，并使如上制备的结构形成溶液通过另一通道从而使所述结 构形成溶液分散在交叉截面的油相中；
[0058] 固化由此形成的结构；以及
[0059] 通过从经固化结构中除去致孔剂在该结构中形成孔。
[0060] 作为一个实施方案，在形成液滴形结构的步骤中，可如下使结构形成溶液有效地 分散在交叉截面的油相中：使油持续地通过一个通道并使由此制备的结构形成溶液间断地 通过另一通道。在此，油的流量特别地为50至1500μ1/小时或者100至1200μ1/小时，更特别 地为200至400μ1/小时，并且结构形成溶液的流量特别地为5至ΙΟΟΟμΙ/小时或者10至500μ 1/小时，更特别地可将其调整为50至150μ!7小时。通过调整油和结构形成溶液的相应流量 及其比例可调整通过通道之液滴的颗粒尺寸，由此可调整待制造之多孔结构的颗粒尺寸。 例如，在其中油和结构形成溶液以相应的流量范围通过通道的情况下，可制备颗粒尺寸为 10至500μπι，更特别地42至200μπι的液滴。另外，通过如上所述调整相应的流量可容易地制造 具有不同颗粒尺寸的多孔结构，并且由此可不使用编码物而通过利用颗粒尺寸的差异来区 别或鉴定多孔结构中包含的引物。
[0061] 在此，油将剪切力添加于分散相之多孔结构形成溶液的流动以使其形成为液滴 形，并且使该液滴稳定而不再聚集。结构形成溶液通过之根据一个实施方案的通道可具有 通路在紧接交叉截面之后变窄的形状，在此情况下当溶液通过通道时，其有效地形成为液 滴(参见图6(B))。
[0062] 作为一个实施方案，可使用碳氟化合物(fluorocarbon，FC)油、矿物油，娃酮油、十 六烷、己烷、甲苯、苯、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、乙醚等作为油。
[0063] 另外，本发明的又一个实施方案是用于制造多孔结构的方法，并且提供了用于制 造多孔结构的以下方法(参见图3)，其包括：
[0064] 制备结构形成溶液，所述结构形成溶液包含预聚物、致孔剂以及作为聚合酶链式 反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一个或更多个方向上的引物；
[0065] 通过将如上制备的结构形成溶液点样在阵列上形成液滴形结构；
[0066]固化该结构；以及
[0067] 通过从经固化结构中除去致孔剂在该结构中形成孔。
[0068] 更特别地，作为阵列，可使用具有以凹陷形式图案化之表面的阵列以便布置多孔 结构。根据一个实施方案，可通过将多孔结构形成溶液点样在阵列上的恒定位置制造多孔 结构，并且由此可通过在阵列上的位置来使相应多孔结构中包含的不同引物彼此区别开 来，而无需分别使用编码物。
[0069] 在此，"预聚物"意指其聚合反应或缩聚反应在适当阶段停止以有利于模制聚合物 的预聚物，并且其意指处于未被固化状态以在本发明情况下容易地模制的聚合物。
[0070] 根据一个实施方案的结构形成溶液包含作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶核 酸的正向引物和反向引物中仅一个方向上的引物，并且在此情况下可向利用多孔结构之用 于多重实时核酸扩增(多重实时PCR)的设备中单独地引入另一引物。
[0071] 此外，可如下制造多个彼此包含不同引物的多孔结构:通过使用本发明的制造方 法基于靶核酸的种类来注入不同种类的引物。另外，所述结构形成溶液还可包含以下中的 一个或更多个:提供经固定引物之信息的编码物和提供待扩增核酸之定量信息的荧光标志 物。
[0072] 作为一个实施方案，制备结构形成溶液的步骤还包括通过改变该溶液中所包含致 孔剂的尺寸来调整将在多孔结构中形成之孔的尺寸。在此，例如，可使用聚乙二醇(PEG)，并 且特别地可使用 PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3000、 PEG3350、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG12000、PEG20000、PEG35000、PEG40000 等(生产商:Sigma Aldrich)作为致孔剂。
[0073] 所述微通道可如下制造:通过光刻法在晶片上将基底图案化成通道形状，然后铸 造其模具。在此，作为通过铸造模具制造之微通道的材料，可使用任何材料而不受限制，只 要其是基于硅酮的聚合物即可，例如可使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0074]此外，作为本发明的一个实施方案，多孔结构的固化为使得多孔结构得到固化同 时维持其固化之前的形状，固化方法不受限制只要可维持形状即可，并且可使用光学、化学 或热固化方法。
[0075]本发明的另一个实施方案提供了用于多重实时核酸扩增的设备，其包含：
[0076] 一个或更多个上述多孔结构；以及
[0077] 阵列，其具有以凹陷形式图案化的表面以便布置所述多孔结构。
[0078] 用于根据一个实施方案之具有以凹陷形式图案化的表面的阵列的材料可为玻璃、 塑料、聚合物、硅酮等，并且其种类不受限制。作为一个实施方案，用于多重实时核酸扩增的 设备可在各个凹陷中包含多个多孔结构，所述多孔结构包含针对各种不同靶核酸的引物或 者引物和编码物以同时检测多种靶核酸。
[0079]另外，本发明的另一个实施方案是多重实时核酸扩增方法，并且提供了多重实时 核酸扩增方法，其包括：
[0080] 将一个或更多个根据权利要求1所述的多孔结构注入室中，所述室包含具有以凹 陷形式图案化之表面的阵列，并将所述多孔结构布置在阵列上；
[0081] 将包含一种或更多种靶核酸的溶液注入用于多重实时核酸扩增之设备的室中并 将溶液引入多孔结构的孔中；以及
[0082] 通过靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增靶核酸。
[0083] 根据本发明一个实施方案的多孔结构包含作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶 核酸的正向引物和反向引物仅一个方向上的引物，并且含有靶核酸的溶液包含另一种引 物。作为一个实施方案，含有靶核酸的溶液还包含含有锁核酸(locked nucleic acid，LNA) 的引物(例如3 ' -锁核酸引物）、Taq聚合酶等。
[0084] 此外，作为一个实施方案，伴随进行实时聚合酶链式反应的步骤，本发明还包括同 时定量分析一个或更多个多孔结构的每个中聚合的核酸的步骤，因此如上所述可在扩增不 同种类靶核酸的同时对其进行实时检测和定量分析。
[0085] 实施方案
[0086]在下文，将参考本发明的实验实施例对本发明进行详细描述。说明性地提出这些 实验例仅是为了更详细地描述本发明，但是对本领域普通技术人员而言将明显的是，本发 明的范围不受这些实验实施例的限制。
[0087][实施例1]多孔结构的制造 1
[0088]下面将对根据本发明一个实施方案之用于制造多孔结构的方法进行描述。
[0089] 微通道的制造
[0090] 首先，使用光刻术在硅晶片SU-8(商品名：2050;制造商:MiCr〇Chem)上将通道图案 化成使得具有两个通道以直角相互交叉的截面的形状，从而制造模具。随后，将如下制备的 预聚物溶液倒入使用SU-8制造的模具中：以10:1混合聚二甲基硅氧烷(PDMS)溶液与固化剂 (商品名：SYJLGAMD⑩184;生产商:D0W HITECH SILICON)。在真空室中从预聚物中除去 气体，持续60分钟，将预聚物在炉中于80°C下固化90分钟并与模具分离，从而制造出PDMS微 通道。在此，该通道的宽度为120μηι，并且其高度为100μπι。
[0091] 多孔结构形成溶液的制备
[0092] 首先，通过混合94·5mL蒸馏水、3mL的100XTE缓冲液和2·5mL的10%(Tween)-20稀 释溶液来制备l〇〇ml的3Χ ΤΕΤ溶液(具有Tween 20的3Χ ΤΕ缓冲液）。此后，通过混合400μ1聚 乙二醇600(PEG 600)和200μ1 PEG700DA(生产商：Sigma Aldrich)作为致孔剂，以及50μ1 Darocur(生产商：Sigma Aldrich)和350μ1 ΤΕΤ作为光敏引发剂来制备总共lmL的水凝胶溶 液。随后，将6μ1 ImM之用于与靶核酸结合的引物与54μ1 TE缓冲液混合以获得总共100μΜ (60μ1)，并将其与水凝胶溶液(540μ1)混合，从而制备引物终浓度为10μΜ的水凝胶预聚物溶 液(600μ1)〇
[0093] 在此，靶核酸的种类为沙门氏菌属(salmonella)食物中毒性细菌(微生物资源中 心KCTC#2515)，并且分别制备以下溶液:包含以下正向引物作为引物的多孔结构形成溶液、 包含以下反向引物作为引物的多孔结构形成溶液，和包含这二者作为引物的多孔结构形成 溶液。在此，荧光标志物为SYBR?Green 1(生产商：InVitr〇gen)。
[0094] -正向引物：AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA(SEQ ID N0.1)，
[0095] -反向引物：TCA ΑΤΑ ΑΤΑ CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC(SEQ ID N0.2)。 _6] 多孔结构的制造
[0097] 通过流动聚焦（f low-focusing)方法制造液滴形结构，其中将含有1 . 8 % Krytox?表面活性剂(生产商:Dupont)的碳氟化合物(FC)油持续地注入由此制造的两个 交叉微通道的一个通道中，并将由此制备的水凝胶预聚物溶液间断地注入另一通道中以使 其分散在交叉截面中的油中。
[0098] 在此，如表1中所示调整FC油(连续相)和水凝胶预聚物溶液(分散相）的流量，使得 相应的结构具有71至131μπι的不同颗粒尺寸。
[0099] [表1]
[0101] 图4(A)是示出了根据上述方法通过使用微通道形成液滴形结构的过程的示意图， 并且图4(B)示出了真实拍摄的制造过程的照片，其中FC油的流量为300μ1/小时，而水凝胶 预聚物溶液的流量为1〇〇μ1/小时。
[0102] 此后，将由此制造的液滴形结构用紫外光(UV)以6至SmW/cm2辐照20分钟以固化。 将该结构用200μ1纯FC油清洗两次，并用200μ1具有Tween 20的TE缓冲液清洗五次以除去致 孔剂，从而制造以60%的孔隙率在结构中形成之孔的多孔结构。
[0103] [实施例2]多孔结构的制造2
[0104] 接下来，将对根据本发明另一个实施方案的多孔结构制造进行描述。
[0105] 通过与上述实施例1中相同的方法制备多孔结构形成溶液的水凝胶预聚物溶液。 此后，将彼此包含不同引物（正向引物、反向引物以及正向和反向引物）的水凝胶预聚物溶 液点样在阵列的每个孔上，从而形成液滴形结构，所述阵列具有以凹陷形式图案化的表面 以便布置多孔结构。
[0106] 此后，将由此制造的液滴形结构用紫外光(UV)以190.6mW/cm2辐照5秒以固化。将 该结构用200μ1具有Tween 20的TE缓冲液清洗五次以除去致孔剂，从而制造在结构中形成 的孔并且颗粒尺寸为120μπι的多孔结构。
[0107] [实施例3]使用多孔结构的多重实时核酸扩增
[0108] 下面将对根据本发明一个实施方案之使用多孔结构来实时扩增靶核酸的方法进 行描述。
[0109] 首先，制备室，其包含具有以凹陷形式图案化之表面的阵列以便布置多孔结构（图 6)。此后，将通过上述实施例1或2的方法制造并且彼此包含不同引物(正向引物、反向引物 以及正向和反向引物）的多孔结构注入该室中以使其安全地布置在每个凹陷中。在此，将未 安全布置在每个凹陷中但残留在凹陷周围的结构清洗掉。随后，向该室中引入8μ1 PCR Mastermix(包含聚合酶和核苷酸，生产商:Nano-Bio System Lab. )、5.4μ1蒸馏水(去离子 水)和ΙμL沙门氏菌属DNA模板（lx 106个拷贝的质粒DNA)，并且在多孔结构仅包含正向引物 和反向引物之一的情况下，向该室中注入包含另一种引物的PCR溶液。
[0110] 此后，允许根据以下温度循环进行总聚合酶链式反应(PCR)，从而扩增核酸。在此， 进行PCR反应，总共40个循环，并且每当每个循环完成时，通过测量所扩增核酸中荧光标志 物呈现出的荧光强度5秒进行定量分析。
[0111] -预变性：95°C，8秒，
[0112] -变性：95°C，3秒，
[0113] -退火和延伸:72°C，6秒。
[0114] 图7是示出了多孔结构定量PCR(qPCR)结果的图，所述多孔结构通过与实施例1之 制造方法相同的方法制造，仅固定正向引物和反向引物的正向引物，并且颗粒尺寸为120μ m，如该图中所示，可以看出PCR正常发生。
[0115] [实验实施例1]基于固定于多孔结构之引物的种类的定量PCR效率比较 [0116]进行以下实验以基于待固定于多孔结构之引物的种类比较定量PCR的效率。
[0117] 多孔结构以相同的方式制造，不同之处在于：多孔结构Chl-3通过实施例2的方法 制造，多孔结构Chi仅固定有正向引物，并且多孔结构Ch2固定有正向引物和反向引物二者。 Ch3中仅包含PCR溶液而不包含本发明的多孔结构，并且Ch3用作对照。在此，多孔结构中包 含的引物量为1〇〇μΜ，并且多孔结构的颗粒尺寸为600μπι。
[0118] 此后，通过上述实施例3的方法进行聚合酶链式反应(PCR)，总共40个循环，并且使 用CCD(电荷耦合装置)照相机在qPCR之前和之后拍摄的多孔结构照片示于图8中。另外，图9 中示出了经受从通道1至通道3的顺序电泳，然后进行测量之多孔结构Chl-3的照片（左侧） 和每个循环测量之荧光强度的图。
[0119] 由实验结果可以看出，仅固定有正向引物的多孔结构Chi的核酸扩增系数 (factor)更为优异，因为其荧光强度显著高于固定有两种引物之多孔结构Ch2的荧光强度， 如图8和图9中所示。这意味着:与在其中固定两种引物的情况相比，在其中固定一种引物的 情况下，引物的自由程度更高并且因此反应性更高。
[0120] 另外，在图9左侧所示的电泳结果中，可以看出Chi和Ch2没有条带，而Ch3存在条 带。这是因为:在Chi和Ch2中引物固定于多孔结构，因此当上样在凝胶上时没有出现条带。
[0121] [实验实施例2]基于引物固定于多孔结构的条件(存在或不存在接头）的定量PCR 效率比较
[0122] 进行以下实验以基于引物固定于多孔结构的条件比较定量PCR的效率。
[0123] 通过与上述实施例2之制造方法相同的方法以相同方式制造固定有正向引物和反 向引物的多孔结构Chi以及固定有通过接头连接之正向引物和反向引物的多孔结构Ch2,不 同之处在于:通过用161μ1的TET缓冲液清洗五次除去致孔剂。在此，多孔结构中包含的引物 的量为100μΜ，并且多孔结构的颗粒尺寸为600ym<Xh3中仅包含PCR溶液而不包含本发明的 多孔结构，并且Ch3用作对照。
[0124] 上述Ch2之固定于正向引物和反向引物的接头是聚乙二醇(PEG，n = 50)并且该接 头所固定的正向引物和反向引物如下：
[0125] -与接头连接的正向引物(长正向引物）：5'-Acrydite_PEG(聚乙二醇，n = 50)_DNA (AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA)-3'，
[0126]-与接头连接的反向引物(长反向引物）：5'-Acrydite-PEG(聚乙二醇，n = 50)-DNA (TCA ΑΤΑ ΑΤΑ CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC)-3'。
[0127] 此后，通过与上述实施例3中相同的方法进行聚合酶链式反应(qPCR)，不同之处在 于:进行qPCR，总共90个循环。图10中示出了使用CCD照相机(a)在qPCR之前、（b)在qPCR期间 (第42个循环)和( c)在qPCR之后拍摄的多孔结构的照片。因为随着循环数增加，出现荧光图 像，所以确认了 qPCR的进行。另外，每个循环测量的荧光强度的图示于图11中。
[0128] 由图11中所示的结果可以看出：作为qPCR的结果，与在Chi的情况下相比，在其中 引物通过接头连接于多孔结构之Ch2的情况下荧光强度更高，这是因为与其中引物不通过 接头连接于多孔结构的Ch 1相比，在多孔结构Ch2中引物的自由程度更高。
[0129] [工业实用性]
[0130] 根据本发明的多孔结构用于多重实时核酸扩增（多重实时PCR)，因为其可同时检 测多种靶核酸并同时对其进行实时分析，并且所述多孔结构可用于需要通过同时且快速地 分析很多不同种类的核酸来精确地诊断疾病(例如即时护理技术(P0CT))的领域。
【主权项】
1. 包含孔的多孔结构， 所述多孔结构包含作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物 一个或更多个方向上的引物，所述引物固定于所述孔的内部。2. 根据权利要求1所述的多孔结构，其中所述多孔结构固定有作为聚合酶链式反应 (PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物仅一个方向上的引物。3. 根据权利要求1所述的多孔结构，其中所述多孔结构的孔隙率为相对于所述多孔结 构总体积的10体积％至80体积％。4. 根据权利要求1所述的多孔结构，其中所述多孔结构的颗粒尺寸为10M1至500μπι。5. 根据权利要求1所述的多孔结构，其中固定于所述多孔结构之孔内部的引物在末端 包含丙烯酰基，其中所述丙烯酰基化学固定于所述多孔结构。6. 根据权利要求1所述的多孔结构，其中固定于所述多孔结构之孔内部的所述引物中 的一种或更多种引物通过接头与所述多孔结构连接。7. 根据权利要求6所述的多孔结构，其中所述接头的长度为5nm至100nm。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的多孔结构，其还包含以下的一个或更多个:提供 经固定引物之信息的编码物和提供在孔中待扩增之核酸的定量信息的荧光标志物。9. 用于制造多孔结构的方法，所述方法包括： 制备结构形成溶液，其包含预聚物、致孔剂以及作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶 核酸的正向引物和反向引物一个或更多个方向上的引物； 如下形成液滴形结构：使油通过微通道的一个通道，所述微通道由包括以直角相互交 叉之截面的两个通道组成，并使如上制备的所述结构形成溶液通过另一通道从而使所述结 构形成溶液分散在交叉截面的油相中； 固化由此形成的结构；以及 通过从经固化结构中除去所述致孔剂在所述结构中形成孔。10. 用于制造多孔结构的方法，所述方法包括： 制备结构形成溶液，其包含预聚物、致孔剂以及作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶 核酸的正向引物和反向引物一个或更多个方向上的引物； 通过将如上制备的所述结构形成溶液点样在阵列上形成液滴形结构； 固化所述结构；以及 通过从经固化结构中除去所述致孔剂在所述结构中形成孔。11. 根据权利要求9或10所述的用于制造多孔结构的方法，其中所述结构形成溶液包含 作为聚合酶链式反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物仅一个方向上的引物。12. 根据权利要求9或10所述的用于制造多孔结构的方法，其中所述结构形成溶液还包 含以下的一个或更多个:提供经固定引物之信息的编码物和提供待扩增核酸之定量信息的 荧光标志物。13. 根据权利要求9所述的用于制造多孔结构的方法，其中所述形成液滴形结构的步骤 包括通过调整所述油和所述结构形成溶液的相应流量来调整待形成之液滴的尺寸。14. 根据权利要求9或10所述的用于制造多孔结构的方法，其中所述制备结构形成溶液 的步骤还包括通过改变所述溶液中所包含致孔剂的尺寸来调整将在多孔结构中形成之孔 的尺寸。15. 用于多重实时核酸扩增的设备，其包含： 一个或更多个根据权利要求1所述的多孔结构；以及 阵列，其具有以凹陷形式图案化的表面以便布置所述多孔结构。16. 根据权利要求15所述的用于多重实时核酸扩增的设备，其包含多个多孔结构，所述 多孔结构包含针对每个不同靶核酸的引物。17. 根据权利要求15所述的用于多重实时核酸扩增的设备，其中根据其中所包含引物 的种类，一个或更多个多孔结构具有不同的颗粒尺寸。18. 多重实时核酸扩增方法，所述方法包括： 将一个或更多个根据权利要求1所述的多孔结构注入室中，所述室包含具有以凹陷形 式图案化之表面的阵列，并将所述多孔结构布置在所述阵列上； 将包含一种或更多种靶核酸的溶液注入用于多重实时核酸扩增的设备的所述室中并 将所述溶液引入所述多孔结构的孔中；以及 通过所述靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增所述靶核酸。19. 根据权利要求18所述的多重实时核酸扩增方法，其中所述多孔结构包含作为聚合 酶链式反应(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物仅一个方向上的引物，并且包含 靶核酸的所述溶液包含另一种引物。20. 根据权利要求18所述的多重实时核酸扩增方法，其中一个或更多个所述多孔结构 彼此包含不同的引物。21. 根据权利要求18所述的多重实时核酸扩增方法，所述方法还包括伴随实时扩增所 述靶核酸的步骤，同时分析一个或更多个多孔结构的每个中待聚合的核酸。
【文档编号】C12M1/38GK105992815SQ201480065116
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2014年10月28日
【发明人】金尚庆, 崔洛源, 李东珍, 郑胜元
【申请人】韩国科学技术研究院