冰结构蛋白质的制作方法

冰结构蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明涉及核酸构建体，其包含：编码冰结构蛋白质(ISP)的核酸序列，所述ISP包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者与其至少80％同一的序列，或者包含在SEQ ID NO:1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少80％同一的序列；以及有效连接至所述冰结构蛋白质的核酸序列的控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。所述构建体可在产生ISP的方法中使用，其中所述ISP在丝状真菌宿主细胞中表达。CBS 12490320090701
【专利说明】冰结构蛋白质 发明领域
[0001 ] 本发明涉及包含编码冰结构蛋白质（ice structuring protein，ISP)的核酸序列 的核酸构建体。本发明还涉及包含所述核酸的表达载体并且涉及包含所述核酸构建体或者 所述表达载体的丝状真菌宿主细胞。本发明还涉及一种用于产生ISP的方法，涉及通过这样 的方法可获得的ISP，涉及ISP，涉及包含这种ISP的食物组合物，涉及一种使用所述ISP制备 食物组合物的方法，以及涉及所述ISP在食物组合物中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 具有潜在许多应用可能性的一组受关注蛋白质是冰结构蛋白质（ISP)，其通常被 称为抗冻蛋白质（antifreeze protein，AFP)。
[0004] Warren等人(US5118792)已经建议在冷冻前将经纯化的ISP直接加入食物产品中 以改善冷冻储存期间的保藏特征。W090/13571A1教导了通过使用分离形式的抗冻多肽抑制 冰晶生长或者抑制冰再结晶，来改善食物产品的耐冷冻性的方法。在过去已经提出了ISP在 食物和非食物中的大量应用，例如Griff ith和Vanya Ewart(1995)Biotechnology Advances 13: 375-402和EP2602263A2中所例示的。然而，由于使用ISP的高成本，许多应用 当前在经济上是不可行的。
[0005] 使用此类ISP的成本必须尽可能低，以允许开发许多不同的应用。虽然当前使用源 自大洋鲶(ocean pout)的AFP III型HPLC12进行工业规模的冰淇淋生产，但是与以经济上 有吸引力的价格大量生产ISP相关联的困难阻碍了其在其它工业应用中的使用。可在不同 应用中使用的理想ISP将在低浓度时具有高活性，低成本，轻易可得并且使用简单。
[0006] 通过选择每摩尔蛋白质具有高冰结构活性的ISP来获得低成本的ISP使用。最深入 研究和工业使用的ISP (源自大洋鲶的III型AFP)用于在-6 °C下的30 %蔗糖溶液中获得再结 晶抑制的最小浓度已经被报告为>700nM(Smallwood等（1999)Biochem.J. 340: 385-391; Tomczak等（2003)Biochem. Biophys · Res · Comm.311:1041-1046)。因此，在应用中需要相对 高的ISP浓度来获得令人满意的结果。联合利华公司(Unilever)已经报导冰淇淋应用中ISP (III型AFP)的浓度为约50mg/kg(w/w)(Lewis(2006)Application for the Approval of Ice Structuring Protein Type III HPLC 12 Preparation for use in Edible Ices, Regulation(EC)No 258/97 of the European Parliament and of the Council of 27th January 1997 Concerning Novel Foods and Novel Food Ingredients)，此等效于7μΜ的 此ISP。还有已经报导的是，可用3-25μΜ的III型AFP来抑制冰晶生长（Li和Hew( 1991) Protein engineering 4:1003-1008)。以更低的所需剂量产生类似效果的ISP将有益地降 低这些蛋白质的使用成本并且将开拓开发另外应用的可能性。
[0007] 此外，每kg发酵液中ISP的高度表达将导致降低的成本价格和低使用成本。高度表 达还将产生仅需要最少纯化的更纯产品，从而进一步降低成本价格。
[0008] 然而目前在文献中描述的ISP的生产率低。来自大洋鲶的III型AFP在发面酵母 Saccharomyces cerevisiae中的表达已经被报导为困难的（US 6914043 B1)并且当培养液 的上清液未稀释时仅为可检测到，这暗示了低水平表达。
[0009]此外，Leucosporidium的ISP(LelBP)在Escherichia coli或者Pichia pastoris 中的表达被描述为在摇瓶中介于2. 1和61 .2毫克/升培养液之间（Park等（2012) Cryobiology 64:286-296)，虽然这两种微生物过去的记录是成功地以高水平表达异源蛋 白。
[0010] 近来Lee等人已经汇总了关于已知ISP的表达的所有文献，并且总结出表达水平不 超过 175mg/l(Lee等（2013)Appl .Microbiol .Biotechnol .97:3383-3393)。他们提出ISP应 用极大地受到经济实惠的生产系统的缺乏的阻碍。
[0011]相同的作者通过分批补料和在降低的温度下加入甲醇来诱导生产的组合将LelBP 的生产率增大到了约300mg/l。由于发酵中的低生产率，蛋白质必须在其可用于进一步实验 之前浓缩和纯化，从而导致了非常不良的产率和最终的高成本价格。此类措施可有助于实 验室规模的发酵，但是对于工业生产来说并不经济实惠。由于当前描述的ISP的使用成本 高，因此ISP在工业中的使用是有限的。
[0012]除了使用成本以外，还重要的是终产品具有关于食物产品中ISP应用的GRAS(-般 被认为是安全的)状态。在文献中描述的许多ISP是在微生物体中表达或者是使用缺乏此状 态的工艺生产的，并且因此不能用于食物应用中。举例来说，LelBP当前是在Pichia pastoris中表达的，Pichia pastoris是一种需要加入有毒甲醇来诱导LeIBP表达的酵母 (Lee 等人（2013))〇
[0013]因此，存在对高活性、低成本、可以食品级形式轻易获得并且使用简单的ISP的需 要。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明基于来自Leucosporidium sp.的冰结构蛋白质(AFP19)在丝状真菌中的成 功表达。AFP19在丝状真菌中的表达水平惊人地、异常地高，比文献中描述的在细菌或者酵 母中的表达要高得多。
[0016]此外，在丝状真菌中表达的AFP19在极低浓度下表现出了非常良好的冰再结晶抑 制活性。此ISP表现为在约20nM对冰再结晶具有活性，比所发现的来源于大洋鲶的当前工业 标准III型AFP的浓度低35倍。
[0017]惊人地，AFP19在丝状真菌中的生产率在摇瓶规模下高于lg/Ι。相同蛋白质在摇瓶 规模下于酵母或者细菌中的生产率已经在文献中被报导为低15-500倍(命名为LelBP)。因 此，在丝状真菌中表达的AFP19的使用成本将比所有目前已知的ISP低得多。因此，相较于目 前已知的ISP，使用在丝状真菌中表达的AFP19将使很多工业应用成为经济上可行的。
[0018]此外，看起来在丝状真菌中产生的ISP是稳定的蛋白质:可能的稳定化特性是N-糖 基化或者〇-糖基化和/或在N末端由焦谷胺酸封闭。
[0019] 根据本发明，由此提供了核酸构建体，其包含：
[0020] 编码冰结构蛋白质（ISP)的核酸序列，所述ISP包含SEQ ID N0:1所示的序列或者 与其至少80%同一的序列，或者包含SEQ ID N0:1中的第21至261位氨基酸所示的序列或者 与其至少80%同一的序列；以及有效地连接至此序列的
[0021] 控制序列，其允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。
[0022]本发明还提供了：
[0023]-表达载体，其包含本发明的核酸构建体；
[0024]-丝状真菌宿主细胞，其包含本发明的核酸构建体或者表达载体；
[0025]-用于产生冰结构蛋白质（ISP)的方法，所述方法包括：
[0026] -提供丝状真菌宿主细胞，所述丝状真菌宿主细胞包含编码ISP的核酸序列，所述 ISP包含SEQ ID NO: 1所示的序列或者与其至少80%同一的序列，或者包含SEQ ID NO: 1中 的第21至261位氨基酸所示的序列或者与其至少80%同一的序列，
[0027] 其中所述核酸序列有效地连接至控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝 状真菌宿主细胞中表达；
[0028] -在适用于产生冰结构蛋白质的条件下培养丝状真菌宿主细胞；以及任选地
[0029] -回收冰结构蛋白质；
[0030] -能够通过本发明方法获得的冰结构蛋白质；
[0031] -冰结构蛋白质，所述冰结构蛋白质包含SEQ ID NO: 1所示的序列或者与其至少 80%同一的序列，或者包含SEQ ID N0:1中的第21至261位氨基酸所示的序列或者与其至少 80%同一的序列，其中：
[0032] 至少一个氨基酸是经修饰的氨基酸；
[0033] 至少一个氨基酸是0-甘露糖基化的;或者
[0034]所述蛋白质具有除2GlcNac和2个己糖单元以外的糖基化模式；
[0035] -食物组合物，其包含本发明的冰结构蛋白质；
[0036] -用于制备食物组合物的方法，所述方法包括将根据本发明的冰结构蛋白质与一 种或多种食物成分组合；
[0037] -本发明的冰结构蛋白质在食物组合物中的用途;以及
[0038] -本发明的食物组合物或者用途，其中所述食物组合物是冷冻糖食产品，诸如冰淇 淋或冰糕(sorbet)。
[0039] 附图简述
[0040] 图1示出用于AFP19基因克隆的pGBT0P-16载体的物理图谱。pGBT0P-16载体衍生自 在W02011/009700中描述的pGBT0P-12载体。除了pGBT0P-12以外，其还含有来源于E. coli、 用于正向选择EcoRI和Pac I克隆位点之间的插入的存在的ccdB基因。Pac I限制性位点替代 了 pGBTOP-12中存在的SnaBI限制性位点。
[0041 ] 图2示出在PNG酶F(PNGase F)处理前和后，对来源于Aspergillus niger的AFP19 的LC MS/MS大小测定。
[0042]图3示出在用PNG酶f进行去糖基化前后的AFP形式的检测质量。C末端截短形式的 焦谷胺酸化AFP在图中用灰色矩形指示。162Da代表己糖的质量。
[0043] 图4示出用来源于Aspergillus niger的AFP19生产的冰沙（sorbet ice)的融化行 为。
[0044] 图5示出用来源于Aspergillus niger的AFP19生产的冰淇淋的融化行为。
[0045] 序列表描述
[0046] SEQ ID NO: 1示出Leucosporidium的ISP(AFP19)的蛋白质序列。此序列由用于 Leucosporidium中有效分泌的20个氨基酸的信号序列和推定的241个氨基酸的成熟蛋白质 序列组成。Leucosporidium的AFP19的氨基酸序列还示出为Swiss-Prot/TrEMBL (登记号： C7F6X3)和基因库登记号ACU30807.1。
[0047] SEQ ID NO:2示出用于在Aspergillus niger中表达SEQ ID NO: 1的密码子适应的 DNA序列。
[0048] SEQ ID NO:3示出用于在Aspergillus niger中表达SEQ ID NO: 1的密码子适应的 DNA序列，该密码子适应的DNA序列含有用于在Aspergillus表达载体中亚克隆的附加限制 性位点。
[0049] 发明详述
[0050] 贯穿本说明书和所附权利要求书，词语"包含"、"包括"和"具有"及其变体可解释 为包含性的。也就是说，这些词语意指可能包括上下文允许但没有具体描述的其它要素或 整数。
[0051] 本文中不使用数量词修饰时是指一个(种)或者一个(种）以上（即，一个(种)或至 少一个(种））语法上的物品对象。举例来说，"要素"可意指一个要素或者一个以上的要素。 [0052] 本发明涉及例如来源于Leucosporidium sp.的冰结构蛋白质（ISP)(诸如AFP19) 在丝状真菌中的表达，AFP19的全长氨基酸序列示出于SEQ ID NO: 1中。此类蛋白质在丝状 真菌中的表达水平已经表现为出乎意料和异常地高；比在文献中描述的细菌或者酵母中的 表达水平要高得多。
[0053]此外，使用丝状真菌表达的本发明的ISP可在化学水平上与从野生型来源分离的 等价蛋白区分或者与在细菌或者酵母中表达的等价蛋白区分。
[0054]本发明的ISP可用于制备食物组合物，例如冰淇淋或冰糕。
[0055] 本发明的ISP的使用向最终食物组合物或者此类组合物的制备赋予了大量优点。
[0056] 例如关于食物组合物的制备，本发明的ISP的使用使得在冷冻食物组合物的制备 中（例如在冰淇淋或冰糕的制备中）硬化减缓。这可允许使用较大的包装尺寸和/或在气流 冷冻中的硬化期间使用较少的功率输入。此外，本发明的ISP的使用甚至可导致冰淇淋和冷 冻点心生产期间硬化步骤的省略，从而允许具有更少能量成本的更快生产工艺。此外，本发 明的ISP的使用可使得能够减少食物组合物(诸如冰淇淋或冰糕)制备期间稳定剂的使用。 [0057]对于使用本发明的ISP制备的食物组合物本身，此类食物组合物可具有增长的货 架期而没有品质损失(相较于未使用本发明的ISP制备的相应食物组合物）。特别地，使用本 发明的ISP制备的食物组合物可比不是使用此类ISP制备的食物组合物更抗热击，并且有可 将此类食物组合物存储在比不使用此类ISP制备的食物组合物的更高的温度下。此类食物 组合物的质量可为较不易受到伴随此类食物产品的运输和零售处理发生的温度波动的影 响。
[0058] 此外，使用本发明的ISP制备所得的食物组合物可具有改善的质地特性，例如所得 食物组合物可更紧实(firm)且具有更高的膨胀率(overrun)，从而使得此类食物组合物的 制备需要更少的成分，并且融化可减少而使得滴出更少（同样与不是使用本发明的ISP制造 的等价食物组合物相比较）。
[0059] 因此，本发明涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含:编码冰结构蛋白质（ISP)的 核酸序列，以及有效连接至所述核酸序列的控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在 丝状真菌宿主细胞中表达。可将核酸构建体并入载体(诸如表达载体)和/或宿主细胞中，以 便实现ISP的表达。
[0060] 术语"核酸构建体"在本文中指核酸分子，所述核酸分子是单链或双链的，是从天 然存在的基因中分离出来的，或者更典型地已经被修饰而含有以不是天然存在的方式组合 和邻接(juxtaposed)的核酸区段。也就是说，根据本发明的核酸构建体是重组构建体，SP非 天然存在的核酸构建体。当核酸构建体含有表达编码序列所需的所有控制序列时，术语核 酸构建体与术语"表达盒"同义，其中所述控制序列有效连接至所述编码序列。
[0061 ]本发明的核酸构建体包含编码冰结构蛋白质（ISP)的核酸序列。
[0062]出于本发明的目的，"冰结构蛋白（ISP)"或者替代地"抗冻蛋白（AFP)"或者"冰结 合蛋白"是指能够结合小冰晶以便抑制冰晶的生长和再结晶的多肽。可如实施例4中所描述 地测量再结晶抑制（1?1)(参见1'〇111〇2&1<:等人（2003)13;[0(3116111.13;[(^115^.1^8· Comm .311:1041-1046) 0
[0063] ISP还可以为或者为相较于不包含ISP的相同溶液能够造成或者增大溶液的熔点 和冰点之间的差异的多肽，即为能够增大溶液的热滞后的多肽。可使用克利夫顿纳升渗透 压仪（Clifton nanolitre osmometer)来测量热滞后。
[0064]核酸序列(包括在本发明的核酸构建体中）编码包含以下的ISP:
[0065]在SEQ ID NO: 1中示出的氨基酸序列或者与其至少80%同一的序列；或者，
[0066] 在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的氨基酸序列或者与其至少50%、 60%、70%或者80%同一的序列。
[0067] SEQ ID NO: 1示出Leucosporidium的ISP(AFP19)的蛋白质序列。此序列由用于使 得在Leucosporidium中进行有效分泌的20个氨基酸的信号序列和推定的241个氨基酸的成 熟蛋白质序列组成。
[0068]在本发明的核酸构建体中，核酸序列可编码这样的ISP，所述ISP包含在SEQ ID NO: 1中示出的序列或者与其至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的 序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少85%、至 少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列。
[0069]也就是说，在本发明的核酸构建体中使用的核酸序列可与在SEQ ID N0:1中示出 的氨基酸序列或者SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的氨基酸序列共享至少50%、 60 %、70 %、80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %的序列同 一性。
[0070] 在本发明的核酸构建体中，核酸可编码包含可从Leucosporidium属的北极酵母 (arctic yeast)获得的氨基酸序列的ISP。
[0071] 出于本发明的目的，在本文中限定，为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸序列 的序列同一性百分比，出于最佳比较目的而比对所述序列。为了最佳化两个序列之间的比 对，可在所比较的两个序列中的任意一者中引入空位。此类比对可在所比较序列的全长上 进行。或者，所述比对可在较短的长度上进行，例如在约20、约50、约100或者更多个核酸/碱 基或氨基酸上。序列同一性是在所报告的比对区域中两个序列之间的相同匹配百分比。 [0072]在丝状真菌中实际表达的ISP的氨基酸序列可不包含理论上由所述核酸序列编码 的所有那些氨基酸。举例来说，氨基酸序列可比理论上由所述核酸序列编码的氨基酸序列 更短，例如由于从ISP的N末端和/或C末端缺失氨基酸(相较于所预测的序列）。举例来说，所 述氨基酸序列可比所预测的SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸的成熟序列短一个、两个、 三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或者十二个或者更多个氨基酸。在这 种情况下，同一性可以在排除那些理论上存在但是实际上不存在的氨基酸的比对的基础上 计算。
[0073]因此，核酸序列(包括在本发明的核酸构建体中）可编码包含以下的ISP:
[0074] 在SEQ ID NO: 1的第21至260位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至259位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至258位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至257位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至256位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至255位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至254位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至253位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至252位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至251位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至250位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至249位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至248位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至247位氨基酸中示出的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO: 1的第21至246位氨基酸中示出 的氨基酸序列，或者与上述任一序列至少50 %、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列。
[0075] 在另一优选方案中，ISP的氨基酸序列已根据如在W02010/102982描述的方法进行 了修饰，从而产生了在丝状真菌中进一步改善的表达。
[0076]两个序列之间的序列比较和序列同一性百分比的确定可使用数学算法实现。技术 人员将了解到该事实，若干不同的计算机程序可用来比对两个序列和确定两个序列之间的 同一性（Kruskal，J·B·(1983)An overview of sequence comparison，D·Sankoff和 J·B·Kruskal编，Time warps , string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison,第1-44页Addison Wesley)。两个氨基酸序列之间或 者两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的Needleman和 Wunsch算法计算（Needleman，S.B.和Wunsch，C.D. (1970)J.Mol .Biol ·48,443-453)。氨基酸 序列和和核苷酸序列两者均可通过算法比对。已经在计算机程序NEEDLE中实施了 Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0 版或更高版本，EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2〇00) Rice,P.Longden，I.和Bleasby，A.Trends in Genetics 16,(6)第276-277,页〈http:// emboss. bio informat ics .nl/>)。对于蛋白质序列，使用EBL0SUM62作为取代矩阵。对于核苷 酸序列，使用EDNAFULL。所使用的可选参数为空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人 员将理解，所有这些不同的参数将得到稍有不同的结果，但是当使用不同算法时，两个序列 的总体同一 1性百分比并未显著改变。
[0077]用如上所述的程序NEEDLE进行比对之后，查询序列和本发明序列之间的序列同一 性百分比计算如下:将比对中显示出两个序列中的相同氨基酸或者相同核苷酸的相应位置 的数目除以减去比对中的空位总数之后的比对总长度。在本文中定义的同一性可通过使用 N0BRIEF选项从NEEDLE中获得并且在程序的输出中标记为"最长同一性"。
[0078]本发明的核酸序列和蛋白质序列还可用作"查询序列"以执行对公共数据库的检 索，从而例如识别其它家族成员或相关序列。此类检索可使用Altschul，等.（1990) J .Mol · Biol · 215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2 · 0版本)来执行。BLAST核苷酸检索可用 NBLAST程序，得分=100、字长=12来执行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。 BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序，得分= 50、字长=3来执行，以获得与本发明的蛋白质分 子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空位比对，可使用如在Altschul等，（1997) Nucleic Acids Res.25(17) :3389-3402中描述的空位化BLAST(Gapped BLAST)。当利用 BLAST和空位化BLAST程序时，可使用相应程序（例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见 http: //www · nebi · nlm · nih · gov/的国家生物技术信息中心的主页。
[0079] 编码ISP的核酸序列有效地连接至控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在 丝状真菌宿主细胞中表达。
[0080] 术语"有效连接"在本文中被定义为以下构造:其中控制序列放置在相对于ISP编 码序列适当的位置处，以使得所述控制序列指引RNA或者mRNA的产生和任选地从所述(m) RNA翻译的多肽的产生。
[0081] 术语"控制序列"在本文中被定义为包括mRNA和/或多肽在体外或者宿主细胞内表 达所需或者对所述表达有利的所有组件。每一控制序列对于编码多肽的核酸序列来说可为 天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于：前导序列、夏因-达尔加诺序列（Shine-Del garno sequence) 、 最佳的 翻译起始序列 （如在Kozak ,1991 ，J.Biol. Chem. 266:19867-19870中所描述的）、多聚腺苷酸化序列、肽原序列、前肽原序列、启动子、信号序列，以及转 录终止子。用于优化表达的信号序列描述于W02010/121933中。控制序列至少包括启动子， 以及转录终止信号和翻译终止信号。控制序列可经优化以用于其特定目的。在本发明中使 用的优选的经优化控制序列是在W02006/077258中描述的那些，其以引用方式并入本文。 [0082] 一个或多个控制序列可为在Leucosporidium(例如，ISP从其中初始分离的 Leucosporidium)并非天然存在的控制序列。
[0083] 控制序列可具有接头以引入特定的限制性位点，从而促进控制序列与编码多肽的 核酸序列的编码区的连接。
[0084] 控制序列可为合适的启动子序列（启动子）。术语"启动子"在本文中定义为结合 RNA聚合酶并且指引所述聚合酶到编码ISP的核酸序列的正确下游转录起始位点的DNA序 列。RNA聚合酶有效地催化与编码区的合适DNA链互补的信使RNA的组装。术语"启动子"还将 被理解为包含：用于在转录到mRNA后进行翻译的5 '非编码区（在启动子和翻译起始之间）， 顺式作用转录控制元件如增强子，以及能够与转录因子相互作用的其它核苷酸序列。
[0085] 本发明的核酸构建体可为这样的核酸构建体，其中控制序列包含与编码ISP的核 酸并非天然相关联的启动子。
[0086] 启动子可为适用于丝状真菌宿主细胞的任何合适的启动子序列，其表现出转录活 性，包括突变、截短和杂合启动子，并且可从编码与丝状真菌宿主细胞同源(天然的）或者异 源的（外源的)胞外或者胞内多肽的多核苷酸获得。启动子可为组成型启动子或者诱导型启 动子。
[0087] 启动子可为诱导型启动子。启动子可为碳水化合物诱导型启动子。可使用的碳水 化合物诱导型启动子为淀粉、纤维素、半纤维素(诸如木聚糖和/或木糖诱导型）启动子。另 一些诱导型启动子是铜诱导型启动子、油酸诱导型启动子。适用于丝状真菌的启动子是可 选自以下组的启动子，包括但不限于：从编码以下的多核苷酸获得的启动子:A. 〇ryZae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定 α-淀粉酶、A.niger或A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖内切酶 (xlnA)或者β-木糖酶(xlnd)、T.reesei纤维二糖水解酶I(CBHI)、R.miehei脂酶、A. oryzae 碱性蛋白酶、A.oryzae磷酸丙糖异构酶、A.nidulans乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡 糖苷酶（WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(W0 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(W0 00/56900)、Fusarium oxysporum 膜蛋白酶样蛋白酶（WO 96/00787)、 Trichoderma reeseiP-葡糖苷酶、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶II、Trichoderma reesei葡聚糖内切酶I、Trichoderma reesei葡聚 糖内切酶II、Trichoderma reesei葡聚糖内切酶III、Trichoderma reesei葡聚糖内切酶 IV、Trichoderma reesei葡聚糖内切酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II、Trichoderma reeseiP-木糖酶，以及NA2_tpi启动子（来源于编码 A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合体），及其突 变、截短和杂合启动子。启动子的另一些示例是在W02006/092396和W02005/100573中描述 的启动子，它们以引用方式并入本文。启动子的使用的再一些示例描述于W02008/098933和 PCT/EP2-13/062490中。启动子还可为组成型启动子。
[0088] 控制序列还可为合适的转录终止子(终止子)序列，即藉由丝状真菌细胞识别以终 止转录的序列。终止子序列有效连接至编码多肽的核酸序列的3'末端。在本发明中可使用 在所述细胞中有功能的任意终止子。本领域中的技术人员已知何种类型的终止子可用于如 本文所描述的微生物宿主细胞。
[0089] 用于丝状真菌细胞的优选终止子序列是从丝状真菌基因的任意终止子序列获得 的，更优选地来自Aspergillus基因，甚至更优选地来自A.oryzaeTAKA淀粉酶的基因，编码 A.niger葡糖淀粉酶(glaA)的基因，编码A.nidulans氨基苯甲酸合酶的基因、编码A.niger α_葡糖苷酶的基因，编码trpC和/或Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
[0090] 控制序列还可为最佳的翻译起始序列（如在Kozak，1991，J.Biol.Chem.266: 19867-19870中所描述），或者5'非翻译序列，其为对通过丝状真菌宿主细胞进行翻译来说 重要的mRNA的非翻译区域。翻译起始序列或者5'非翻译序列有效连接至编码多肽的编码序 列的5'末端。每一控制序列可为对于编码多肽的核酸序列天然或外源的。控制序列可经优 化以用于其特定目的。
[0091] 合适的5'非翻译序列可为在真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因之前，在A.oryzae TAKA 淀粉酶和Aspergillus磷酸丙糖异构酶基因之前，以及在A.niger葡糖淀粉酶glaA、a-淀粉 酶、木聚糖酶和植酸酶编码基因之前的那些多核苷酸。
[0092] 控制序列还可为对通过丝状真菌宿主细胞翻译来说重要的mRNA的非翻译区域。
[0093] 前导区（或者信号)序列可有效连接至编码多肽的核酸序列的5'末端。在本发明中 可使用在所述细胞中有功能的任意前导区。前导序列可为来源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基 因 （glaA--18个氨基酸和24个氨基酸两个版本，例如来源于Aspergillus)，α-因子基因 (酵母，例如Saccharomyces和 Kluyveromyces)或者α-淀粉酶（amyE、amyQ 和 amyL)和喊性蛋 白酶aprE以及中性蛋白酶基因（Bacillus)的那些，或者如在W02010/121933中所描述的信 号序列。
[0094] 用于丝状真菌细胞的优选前导区（或者信号序列）是从在A.oryzaeTAKA淀粉酶和 A.niger glaA以及植酸酶之前的多核苷酸获得的。
[0095] 另一些控制序列可从Penicillium IPNS基因或者pcbC基因、β微管蛋白基因中分 离。在W0 01/21779中提及的所有控制序列由此以引用方式并入本文。
[0096] 控制序列还可为多聚腺苷酸化序列，其为有效连接至核酸序列的3'末端并且当转 录时被微生物宿主细胞(突变体或亲本)识别为添加多聚腺苷酸残基到经转录mRNA中的信 号的序列。在本发明中可使用在所述细胞中有功能的任意多聚腺苷酸化序列。
[0097] 用于丝状真菌细胞的优选多聚腺苷酸化序列是从编码A.oryzae TAKA淀粉酶、 A.niger葡糖淀粉酶、A.nidulans氨基苯甲酸合酶、Fusarium oxysporum胰蛋白酶样蛋白酶 以及A.nigera-葡糖苷酶的多核苷酸获得的。
[0098] 为了促进表达，编码ISP的核酸序列可为合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可在密 码子使用方面经过优化，优选地根据在W02006/077258和/或PCT/EP2007/055943(公开为 TO2008/000632)中描述的方法，它们以引用方式并入本文。PCT/EP2007/055943提出了密码 子对优化。密码子对优化是其中编码多肽的核苷酸序列已经在其密码子使用方面，尤其是 在所使用的密码子对方面经修饰以获得编码ISP的核苷酸序列的改善表达和/或所编码ISP 的改善生产的方法。密码子对被定义为编码序列中的一组两个连续三联体(密码子）。
[0099] 因此，本发明的核酸构建体可为其中编码ISP的核酸为经密码子对优化以用于丝 状真菌宿主细胞中表达的核酸构建体。
[0100] 为了促进ISP的表达和/或翻译，编码ISP的核酸序列可包含在表达载体中，以使得 编码ISP的基因有效连接至合适的控制序列，以用于体外或者在丝状真菌宿主细胞中表达 和/或翻译。也就是说，本发明提供包含本发明的核酸构建体的表达载体。
[0101] 表达载体可为任意载体(例如，质粒或者病毒），其可便利地经受重组DNA程序并且 可导致编码多肽的多核苷酸的表达。载体的选择将通常取决于载体与载体将引入其中的细 胞的相容性。载体可为线性或者闭环质粒。载体可为自主复制载体，即，作为染色体外的实 体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微小染色体，或者人 工染色体。自主保持的克隆载体可包含AMA1序列（参见例如Aleksenko和Clutterbuck (1997),Fungal Genet.Biol.21:373-397)〇
[0102] 或者，载体可为当引入丝状真菌宿主细胞中时，整合到基因组中并与其已经整合 至其中的染色体一起复制的载体。整合型克隆载体可整合于宿主细胞的染色体中的随机或 者预定靶基因座处。在本发明的一个优选实施方案中，整合型克隆载体包含与宿主细胞的 基因组中的预定靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，以用于将克隆载体靶向整合至此预 定基因座。为了促进靶向整合，克隆载体优选地在细胞转化之前为线性化的。线性化优选地 执行以使得克隆载体的至少一端但是优选地任一端侧接与靶基因座同源的序列。侧接靶基 因座的同源序列的长度优选地为至少30bp，优选地至少50bp，优选地至少O.lkb，甚至优选 地至少0.2kb，更优选地至少0.5kb，甚至更优选地至少lkb，最优选地至少2kb。优选地，靶向 整合到丝状真菌宿主细胞的基因组中（即，整合于预定靶基因座中）的效率是随着宿主细胞 的同源重组能力的增大而增大的。
[0103] 优选地，克隆载体中同源侧接的DNA序列是与靶基因座同源的，其来源于高度表达 的基因座，意味它们来源于能够在宿主细胞中以高水平表达的基因。能够高水平表达的基 因，即高度表达基因，在本文中被定义为在例如诱导条件下，其mRNA可构成总细胞mRNA的至 少0.5 % (w/w)的基因，或者，其基因产物可构成总细胞蛋白质的至少1 % (w/w)的基因，或 者，在分泌基因产物的情况下，其可分泌达到至少ο. lg/1的水平(如在EP357 127B1中所描 述的）。
[0104] 给出了大量优选高度表达的真菌基因，例如：来源于Aspergilli、Chrysosporium 或Trichoderma的淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、醇脱氢酶基因、木聚糖酶基因、甘油醛磷酸 脱氢酶基因，或者纤维二糖水解酶(cbh)基因。出于这些目的，最优选的高度表达基因为葡 糖淀粉酶基因，优选地A.niger葡糖淀粉酶基因、A.oryzae TAKA淀粉酶基因、A.nidulans gpdA基因 、Trichoderma reesei cbh基因，优选地cbhl，Chrysosporium lucknowense cbh 基因，或者来源于P.chrysogenum的cbh基因。
[0105] 可将本发明的核酸构建体的多于一个的拷贝插入丝状真菌宿主细胞中以增加由 包含在所述核酸构建体中的核酸序列编码的ISP的产生(过表达）。这可通过以下方式完成： 优选地通过整合到所述DNA序列的其基因组拷贝中，更优选地通过将所述DNA序列靶向整合 于在先前段落中所定义的高度表达基因座之一处。或者，这可通过包含与核酸序列一起的 可扩增选择性标记基因来进行，当细胞含有经扩增拷贝的选择性标记基因从而含有额外拷 贝的所述核酸序列时，可以通过在合适选择性试剂的存在下培养细胞来进行选择。为了增 加待过表达的DNA序列的甚至更多的拷贝数，可使用如在W098/46772中描述的基因转换技 术。
[0106] 载体系统可为单一载体或质粒，或者两种或更多种载体或质粒，所述载体或者质 粒合起来含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA，或者转座子。
[0107] 载体优选地含有一种或多种选择性标记，所述选择性标记允许容易地选择转化细 胞。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或者病毒抗性、重金属抗性，使得 原养型转化为营养缺陷型，等等。选择性标记可在为表达盒的表达载体上引入细胞中，或者 可在单独的表达载体上引入细胞中。
[0108] 用于丝状真菌细胞的选择性标记可选自以下组:包括但不限于:amdS(乙酰胺酶）、 argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar(草胺膦乙酰转移酶）、bleA(腐草霉素结合酶）、hygB(潮 霉素磷酸转移酶）、niaD(硝酸还原酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶）、sC(硫酸腺苷酰 转移酶）、NAT或者NTC(诺尔丝菌素)和trpC(氨基苯甲酸合酶），以及来源于其它物种的等同 物。用于Aspergi 1 lus和Penicil 1 ium细胞中的优选为amdS(参见例如EP 635574 B1、 EP0758020A2、EP1799821A2、W0 97/06261A2)，和A.nidulans或A.oryzae的pyrG基因，以及 Streptomyces hygroscopicus的bar基因。更优选地使用amdS基因，甚至更优选地使用来自 八.11丨(11113118或4.11丨861'的3111(13基因。一个最优选的选择性标记基因是融合至A.nidulans gpdA启动子的A.nidulans amdS编码序列（参见EP 635574 B1)。另一些优选的AmdS标记是 在W02006/040358中描述的那些。还可以使用来源于其它丝状真菌的AmdS基因（W0 97/ 06261)。
[0109] 优选地，在引入表达构建体之后从经转化的丝状真菌宿主细胞中使任何选择标记 缺失，以便获得不含选择标记基因、能够产生ISP的经转化宿主细胞。
[0110]用于连接如上所述的元件以构建本发明的表达载体的程序是本领域中的技术人 员熟知的（参见例如，Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3 版，CSHL Press，Cold Spring Harbor, NY, 2001;和 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley InterScience，NY,1995)〇
[ΟΙ11 ]此外，标准分子克隆技术如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶限制性修饰、Southern分 析、细胞转化等是本领域中的技术人员已知的并且例如由Sambrook等（1989) "Molecular Cloning:a laboratory manual^,Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor ,New York和Innis等（1990)〃PCR protocols,a guide to methods and applications〃Academic Press，San Diego描述。
[0112] 适用于本发明的核酸可根据标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作 为模板和合适的寡核苷酸引物来扩增。如此扩增的核酸可克隆到合适的载体中并且通过 DNA序列分析来表征。
[0113] 优选地，靶向整合到宿主细胞的基因组中（即，整合到预定靶基因座中）的效率随 着宿主细胞的同源重组能力的增大而增大。细胞的此类表型优选地涉及如在W02005/ 095624中描述的缺陷hdfA或者hdfBc3W02005/095624公开了一种用于获得包含增大效率的 靶向整合的丝状真菌细胞的优选方法。
[0114] 本发明由此提供了包含本发明的核酸构建体或者表达载体的丝状真菌宿主细胞。
[0115] 丝状真菌宿主细胞可为Eumycota和Oomycota亚门的任意丝状形式细胞（如 Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义的）D丝状真菌的特征为菌丝壁 由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖，以及其它复合多糖构成。营养生长通过菌丝 伸长而进行并且碳代谢是专性需氧的。
[0?16] 丝状真菌宿主细胞可为Trichocomaceae类的任意丝状形式的细胞（如Houbraken 和Samson在Studies in Mycology 70:1-51.2011中所定义的）D在另一个优选实施方案中， 丝状真菌宿主细胞可为Aspergillaceae、Thermoascaceae和Trichocomaceae三个科中任意 一个科的任意丝状形式的细胞，它们适应Trichocomaceae分类 D合适的丝状真菌宿主细胞 可为在Houbraken和Samson，2011(同上）中的图1中所描述的分支2: Aspergillus中的那些。
[0117] 适用于本发明的合适的丝状真菌宿主细胞包括但不限于以下的细胞： Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、 Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、 Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、 Pleurotus、Schizophy1lum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、 Tolypocladium^PTrichoderma〇
[0118] 优选的丝状真菌细胞属于以下物种:Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、 Myceliophthora、PeniciIlium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或 Trichoderma属，并且最优选地属于以下物种：Aspergillus niger、Acremonium alabamense、Aspergi1lus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、 Aspergillus fumigatus^Talaromyces emersonii>Rasamsonia emersonii>Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Fusarium oxysporum、Fusarium venenatum、 Myce1iophthora thermophila、Trichoderma reesei、Thielavia terrestris或 Penicillium chrysogenunu更优选的宿主细胞属于Aspergillus属，更优选地宿主细胞属 于Aspergillus niger物种。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞时， 所述宿主细胞优选地是CBS 513.88、CBS124.903,或其衍生株。
[0119] 公众可从大量菌种保藏单位轻易获得若干丝状真菌菌株，所述菌种保藏单位为诸 如：美国模式培养物保藏所(ATCC)、德国布朗施维格的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、皇家科学院真菌生物多 样性研究中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、美国北方农业研究所培养 物保藏中心（Agricultural Research Service Patent Culture Col lection, Nor them Regional Research Center，NRRL)，以及俄国莫斯科的俄罗斯科学院的全俄罗斯微生物保 藏中心（俄文缩写为VKM，英文缩写为RCM)。可用于本发明的情形中的菌株可为： Aspergillus niger CBS 513.88、CBS124.903、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IF0 4177、ATCC 1011、CBS205.89、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、 P· chrysogenum CBS 455 ·95、P· chrysogenum威斯康星54-1255(ATCC28089)、PeniciIlium citrinum ATCC 38065、Penici11ium chrysogenum P2、Rasamsonia emersoni i ATCC16479、CBS393.64、IF031232、IMI116815、Thielavia terrestris NRRL8126、 Talaromyces emersonii CBS 124.902、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921'Aspergillus sojae ATCC11906、Myceliophthora thermophila Cl、Garg 27K、VKM_F 3500 D、Chrysosporium lucknowense Cl、Garg 27K、VKM-F 3500 D、ATCC44006,以及它们的衍生株。
[0120] 优选的丝状真菌宿主细胞如A.niger宿主细胞，例如可含有一个、多个或所有以下 修饰:非核糖体肽合酶缺陷，优选地非核糖体肽合酶npsE缺陷（参见W02012/001169)，pepA 缺陷，葡糖淀粉酶（glaA)缺陷，酸稳定的α-淀粉酶(amyA)缺陷，中性α-淀粉酶(amyBI和 amyBII)缺陷，草酸水解酶(oahA)缺陷，一种或多种毒素缺陷，优选地赭曲毒素和/或伏马菌 素，prtT缺陷，hdfA缺陷，包含为S376W突变的SEC 61修饰，其中用色氨酸取代丝氨酸376和/ 或包含改变的扩增子，如在W02005/123763和/或W02011/009700中所定义的。这些和其它可 行的宿主修饰还描述于 W02012/001169、W02011/009700、W02007/062936、W02006/040312S 恥2004/070022、恥2013/135729、恥2014/013074、恥2014/013073中。
[0121] 本领域中的技术人员知晓如何用本发明的一种或多种核酸构建体或者表达载体 来转化细胞。
[0122] 丝状真菌宿主细胞的转化可通过任何适当已知的方法来进行，包括例如电穿孔方 法、粒子轰击或者微粒轰击、原生质体法和农杆菌(Agrobacterium)介导转化(AMT)。用于转 化的程序由 J · R · S · Fincham，Transformat ion in fungi . 1989,Microbiological reviews · 53,148-170 中描述。
[0123] 转化可涉及由以下组成的过程：原生质体形成，原生质体转化，以及细胞壁再生， 以本来已知的方式。用于Aspergillus细胞转化的合适程序描述于EP 238 023和Yelton等 人，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474中。用 于使用Agrobacterium tumefaciens转化Aspergillus和其它丝状真菌宿主细胞的合适程 序描述于例如De Groot等人，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nat Biotechnol.1998,16:839-842中。勘误发表于Nat Biotechnol 1998 16:1074。用于转化Fusarium物种的合适方法由Malardier等，1989,Gene 78:147156 或者在W0 96/00787中描述。可应用的另一些方法例如使用基因枪转化的方法，如在 Christiansen等，Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus，Erysiphe graminis f.sp.hordei.l995，Curr Genet.29:100_102中所描述的。
[0124] 本发明还提供了一种用于产生冰结构蛋白质（ISP)的方法，所述方法包括：
[0125] a.提供丝状真菌宿主细胞，所述丝状真菌宿主细胞包含编码ISP的核酸序列，所述 ISP包含SEQ ID NO: 1中示出的序列或者与其至少80%同一的序列，或者包含SEQ ID NO: 1 的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少80%同一的序列，
[0126] 其中所述核酸序列有效连接至控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝状 真菌宿主细胞中表达；
[0127] b.将丝状真菌宿主细胞在适合于产生冰结构蛋白质的条件下培养;以及任选地
[0128] c.回收冰结构蛋白质。
[0129] 通常，ISP是例如在培养步骤期间从宿主细胞中分泌出来的。
[0130] 在步骤a.中，突变微生物宿主细胞可为如本文所描述的本发明的丝状真菌宿主细 胞。
[0131] 在步骤b.中，步骤a.的丝状真菌宿主细胞是在有助于ISP表达的条件下培养的。突 变微生物细胞是使用本领域中已知的方法在适用于产生ISP的营养培养基中培养的。例如， 细胞可通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵，或者 固态发酵），在合适培养基中并且在允许ISP产生和/或分离的条件下运行的实验室或者工 业发酵罐中培养。培养使用本领域中已知的程序，在包含碳和氮源以及无机盐的合适营养 培养基中发生（参见例如，Bennett, J.W.和 LaSure，L·，编，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA, 1991)。合适的培养基可从商业供应商商购获得或者可使用公 开的组合物(例如，在美国模式培养物保藏所的目录中）制备。
[0132] 如果ISP分泌到营养培养基中，则ISP可从培养基中直接分离。如果ISP未分泌，则 其可从细胞裂解液中分离。
[0133] 在步骤c.中，可任选地分离ISP。ISP可通过本领域中已知的方法分离。例如，ISP可 通过常规程序从营养培养基分离，所述常规程序包括但不限于离心分离、过滤、提取、喷雾 干燥、蒸发，或者沉淀。然后可将分离的ISP通过本领域中已知的多种程序进一步纯化，所述 程序包括但不限于层析法（例如，离子交换、亲和层析、疏水层析、聚焦层析，以及尺寸排 阻）、电泳程序（例如，制备式等电聚焦）、差异溶解(例如，硫酸铵沉淀），或者提取(参见例 如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden,编VCH Publishers,New York, 1989)。在一些应用中，ISP可在基本上不从培养液中分离的情况下使用;培养基与生物质分 离可为足够的。
[0134] 在本发明的方法中，ISP的生产率可为至少lg/L、至少2g/L、至少5g/L，诸如10g/L 或者更高。
[0135] 本发明还提供了一种通过如本文所描述的本发明方法能够获得的冰结构蛋白质。
[0136] 本发明还提供了冰结构蛋白质，所述冰结构蛋白质包含在SEQ ID NO: 1中示出的 序列或者与其至少80%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出 的序列或者与其至少80%同一的序列，其中：
[0137] 至少一个氨基酸是经修饰的氨基酸，例如包含在其N末端的焦谷氨酸修饰；
[0138] 至少一个氨基酸是0-甘露糖基化的，例如包含一个、两个、三个、四个或者更多个 〇-甘露糖基化；
[0139] 蛋白质具有不同于2GlcNac和2个己糖单元的糖基化模式，例如2GlcNac和三个、四 个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者更多个己糖单元;或者
[0140] 所述蛋白质在C末端缺失 VVQKRSNARQWL、VQKRSNARQWL 和KRSNARQWL。
[0141] 也就是说，所述蛋白质可具有相对于SEQ ID N0:1中示出的蛋白质，在C末端的一 个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或者十二个或者更多个氨 基酸截短。
[0142] 在此类冰结构蛋白质中，经修饰的氨基酸可为焦谷氨酸，任选地存在于蛋白质的N 末端（即，在对应于SEQ ID NO: 1中的第21位氨基酸的氨基酸处）。
[0143] 本发明的冰结构蛋白质可包含2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和10个己糖(Hex)单元。 本发明的冰结构蛋白质可在对应于参照SEQ_ID NO: 1的S80和/或T84的位置处被0-甘露糖 基化。最丰富形式的AFP19含有一个0-甘露糖基团。
[0144] 本发明的ISP可包含在SEQ ID NO: 1中示出的氨基酸序列或者与其至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261 位氨基酸中示出的序列或者与其至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同 一的序列。
[0145] 例如可通过本发明的方法获得的本发明的ISP可在食物组合物制备中使用。因此， 本发明提供包含例如可通过本发明的方法获得的本发明的ISP的食物组合物。
[0146] 优选的食物组合物是冷冻糖食产品，诸如冰淇淋、冷冻酸奶、速冻点心、雪糕、冰 糕、冰乳、乳冻、冰棍、格兰尼它冰糕和冷冻果泥、软雪糕、冰镇饮料(frappg)、雪泥、思慕雪、 刨冰、雪花冰、半冻冰糕、奶昔或者意式冰激凌。
[0147] ISP的水平可为以最终组合物的重量计从0.00001 %至0.5%。
[0148] 本发明的食物组合物，诸如冷冻糖食产品，所述冷冻糖食中固体(例如，糖、脂肪、 调味剂等等）的水平可以重量计大于4%，例如以重量计大于20%，诸如从20%至60%，例如 以最终组合物的重量计30 %至45 %。
[0149] 在冰淇淋组合物的情况下，例如，示例性成分和其量如下：
[0150] 水可为以组合物的重量计从40%至80%。
[0151] 甜味剂可为以所述组合物的重量计5%-30%，10%-25%，或者15%-20%。低热量 甜味剂诸如三氯蔗糖、糖精或者阿斯巴甜可用作甜味剂，也可使用一种或多种糖。术语糖包 括单糖、二糖、多糖、糖醇，或者它们的混合物，单糖是通式为C nH2n〇n的化合物，其中η = 3-7， 并且二糖是任意两种相同或者不同单糖的缩合产物。合适的单糖包括葡萄糖和果糖。合适 的二糖是蔗糖。甜味剂还包括玉米糖浆(也被称为葡萄糖浆），其为单糖、二糖和高级糖类以 及糖醇的混合物。
[0152] 乳固体可为以组合物的重量计5%至40%。乳固体包括非脂乳固体(乳糖、乳蛋白 和矿物质）和乳脂肪（也被称为乳脂）。乳固体可以组合物的重量计至少10%，诸如至少 15%，例如20%的量存在。所述组合物可包含至多35%，至多30%或者至多25%的乳固体。 乳固体可以奶粉形式加入组合物中。或者，可将鲜奶或者巴氏灭菌牛奶加入组合物中以提 供必需量的乳固体。
[0153] 冰淇淋组合物可包含脂肪。在这种情况下，脂肪以组合物的重量计可为2%_20%， 4%-18%，或者6%-16%。脂肪可为植物性脂肪和/或乳脂肪。
[0154] 冰淇淋组合物可包含1 %-10%，诸如2%-9%，例如3%-8%的蛋白质。蛋白质可为 小麦蛋白、大豆蛋白，或者乳蛋白。
[0155] 冰淇淋组合物可包含其它任选的成分，包括调味剂、水果/蔬菜，以及巧克力。
[0156] 本发明的ISP可与一种或多种食物成分组合以便制备本发明的食物组合物。也就 是说，本发明提供一种用于制备食物组合物的方法，所述方法包括:将本发明的冰结构蛋白 质与一种或多种食物成分组合，从而制备食物组合物。
[0157] 根据本发明的冷冻糖食产品可用适用于生产冷冻糖食品的任意方法生产。通常， 组合物的所有成分在冷冻工艺开始之前充分混合。冷冻工艺可有利地涉及硬化步骤，例如 硬化至_30°C或更低的温度。
[0158] 本发明还提供了本发明的冰结构蛋白质在食物组合物中的用途。.
[0159] 在本文中对专利文献或者作为现有技术给出的其它事物的引用不应被视为承认 文献或事物为在权利要求书中任一项的优先权日时为已知的或者其所含有的信息在权利 要求书中任一项的优先权日时为公知常识的部分。
[0160] 本文提出的每一参考文献的公开内容以引用方式整体并入本文。
[0161] 本发明通过以下实施例进一步说明： 实施例
[0162] 实施例1:AFP19基因的克隆和表达
[0163] Leucosporidium的ISP(AFP19)的蛋白质序列是根据公开的基因序列推定的并且 在SEQ ID N0:1中示出。此序列由用于在Leucosporidium中有效分泌的20个氨基酸的信号 序列和推定的241个氨基酸的成熟蛋白质序列组成。
[0164]用于使此蛋白质在Aspergillus niger中表达的密码子适应的DNA序列被设计为 含有附加的限制性位点以用于在Aspergi 1 lus表达载体中亚克隆。密码子适应是如W02008/ 000632中描述地执行的。编码SEQIDN0:1的ISP蛋白的基因的DNA序列在SEQIDN0:2中示 出。
[0165] 葡糖淀粉酶glaA启动子的翻译起始序列已经修饰成5'-CACCGTCAAA ATG-3'并且 在表达构建体的产生中使用最优的翻译终止序列5'-TAAA-3'（如W02006/077258所详述）。 将含有葡糖淀粉酶启动子的部分和ISP编码基因等的DNA片段(SEQ ID N0:3)完全合成，纯 化，并且用EcoRI和PacI消化。pGBT0P-16载体（图1)通过EcoRI/PacI消化而线性化，并且随 后将线性化的载体片段通过凝胶提取纯化。将DNA片段克隆到pGBT0P-16载体中，并且将所 得载体命名为PGBT0PAFP-19。随后，用此pGBT0PAFP-19载体，按照使用pGBAAS-4的共转化方 案，使用在W0 2011/009700和其中的参考文献中所描述的菌株和方法来转化A.niger GBA 306,并且在含乙酰胺的培养基上选择，以及根据标准程序进行菌落纯化。A.niger GBA306 最终来源于CBS124.903(保藏在荷兰真菌培养物保藏中心，荷兰乌得勒支）。转化和选择是 如W0 98/46772和W0 99/32617中所描述地执行的。使用特异于AFP19基因的引物，通过PCR 选择含有AFP19基因的菌株，以验证pGBT0PAFP-19表达盒的存在。选择单一转化体，将其命 名为AFP19-3,并进一步影印培养(replicaplated)以获得单一菌株接种体。
[0166] 实施例2:AFP19在Aspergillus niger中的发酉孝和纯化
[0167] 制备新鲜的A.niger AFP19-3芽孢。向含有100ml发酵培养基l(10%W/v的玉米浸 渍固体，1 %w/v 的葡萄糖·Η2〇,0· 1 %w/v 的 NaH2P〇4.H2〇,0.05%w/v 的 MgSCU. 7H2〇,0.025%w/ v的Basildon，pH 5.8)、具有挡板的4个50〇1111摇瓶中接种107个芽孢。将这些预培养物在34 °C下和170rpm下孵育16-24小时。从所述预培养物中取50ml用于接种到含有1升发酵培养基 2( 15%w/v麦芽糖，6%w/v细菌大豆蛋白胨，1 · 5%w/v(NH4)2S〇4,0 · 1 %w/v NaH2P〇4.H2〇， 0.1%w/v MgS〇4.7H2〇,0.1%w/v L-精氨酸，8%〇w/v Tween_80,2%〇w/v Basildon，2%w/v MES，pH 5.1)的4个5升大小的摇瓶中并且在34°C和170rpm下振荡培养。培养四天后，通过添 加3.5g/l的苯甲酸钠并在30°C下保持六小时来进行细胞灭活。随后，将10g/l CaC12和45g/ 1珍珠岩C25加入培养液中。使用滤布和过滤器DE60/EKS P和K250(Pall)进行一步过滤。将 残留在过滤器中的滤饼用1.1L的无菌milliQ水冲洗。然后使用0.22m GP Express PLUS膜 (Mi 11 ipore)进行无菌过滤。在Pel 1 icon 2"迷你"超滤系统上使用Biomax5k盒(Mi 11 ipore) 进行超滤，并用50mM pH 5.6的乙酸钠冲洗。在所有步骤中纯化样品的蛋白质组合物是用4-12%SDS-PAGE控制的并且发现其为>90%的纯AFP19。通过测量A260/A280来在所有步骤中 控制蛋白质浓度。所述浓度是根据公式c(mg/ml) = (1.55*A280)-(0.76*A260)确定的。最终 获得蛋白质浓度为30.8mg/ml的150ml样品，这指示AFP19的生产率为>lg/kg发酵液。将最终 制品冻干并且在使用前一直贮藏在_20°C下。
[0168] 实施例3:AFP19基因在Aspergillus oryzae中的表达和发酉孝
[0169] 将Aspergillus oryzae菌株CBS205.89(保藏在荷兰真菌培养物保藏中心，荷兰乌 得勒支，并且为公开可得的）用作宿主，并且将在实施例1中描述的环状载体pGBTOPAFP-19 载体和pGBAAS-4按照共转化方案使用。如W0 98/46772和W0 99/32617中所描述地进行转 化，并且在含有乙酰胺、添加有20mM氯化铯的培养基上进行选择。根据标准程序纯化菌落。 使用特异于AFP 19基因的引物，通过PCR选择含有AFP 19基因的菌株，以验证pGBTOPAFP-19表 达盒的存在。选择单一转化体，将其命名为AFPao-7,并进一步影印培养以获得单一菌株接 种体。作为对照，用质粒pGBT0P-16代替pGBT0AFP-19转化Aspergillus oryzae菌株，并且通 过影印培养来获得单一菌株接种体。如实施例2中所描述地制备和培养新鲜的A. oryzae AFPao-7芽胞。在30°C和170rpm在摇瓶中培养72小时。通过离心收获上清液并且在进一步分 析之前将其一直贮藏在-20 °C下。
[0170] 使用上清液的SDS-PAGE分析来确定由Aspergillus oryzae AFPao-7产生的AFP19 蛋白质的浓度，并与来自实施例2的来源于Aspergillus niger的相对较纯的AFP19的连续 稀释液进行比较。在相同凝胶上平行分析缺乏AFP19基因的对照菌株的培养上清液。在用考 马斯亮蓝染色凝胶之后，定量分析染色并且将其与来源于A.niger的AFP19的连续稀释液进 行比较。由Aspergillus oryzae产生的AFP19的量估计为0.4g/l，明显大于在摇瓶中于 Pichia pastoris内产生的61.2mg/l的LeIBP(Park等人，2012年，同上）。此量是通过在推定 对照菌株上清液的染色强度后使用布拉德福(Bradford)蛋白染色法测量上清液中的总蛋 白浓度来确认的。
[0171] 实施例4:对来源于Aspergillus niger的AFP19的分析
[0172] 使用LC-MS/MS进一步鉴定在实施例2中从Aspergillus niger中分离出来的 AFP19。为此，将在实施例2中分离的lmg AFP19蛋白质在100mM NH4HCO3中稀释至100μg/ml。 为了去糖基化，将1〇〇μ1此溶液在90°C下加热10分钟。加入15μ1 PNG酶F(Sigma，lUAU)，然 后在lOOOrpm和37 °C的恒温混匀仪中孵化4小时。在测量前将1 %甲酸加入样品中。作为对 照，分析未经处理的AFP19蛋白质。
[0173] 关于LC-MS/MS分析，在Acquity I-class-Synapt G2_S(Waters)上，使用以下参数 来分析样品：柱:Waters Acquity UPLC BEH300 C4 1·7μπι3〇〇Α孔径，2.1X50mm柱。柱温： 75°C。注入体积:5μ1。流动相A: 0.1 %的甲酸水溶液。流动相B: 0.1 %的甲酸乙腈溶液。通过 改变相A和B来施加梯度至柱，从而分离不同形式的AFP19蛋白质。
[0174] MS检测器设置为:采集质量范围是500-3500m/z，扫描时间1秒，正ESI，TOF MS分辨 率模式，使用在运行期间即时施加的Leu-Enk进行数据校正。数据频谱反褶积、电荷态剥离 是用Waters MassLynx MaxEntl软件工具执行的：输出质量分辨率=lDa/通道。损伤模型： 高斯型(FWHH=0.750Da;最小强度比= 33%左和右）。迭代至收敛。
[0175] 使用此技术在酶促去糖基化前和后测定AFP19的质量，并且将结果描绘在图2中。
[0176] 可从这些结果中得出若干结论：
[0177] · PNG酶F处理后最小形式的AFP19的大小为23446Da。此大小小于以SEQ ID N0:1 中描绘的蛋白质序列为基础所计算的分子量，假设在残基20之后除去了前序列。这表明在 A.niger中产生的AFP19缺失了部分蛋白质序列。因为所述大小并非恰好与任何氨基酸缺失 的大小符合，因此我们无法排除在A.niger中产生AFP19期间可已经发生的其它修饰。例如 可能AFP19在其N末端含有焦谷氨酸修饰。
[0178] · AFP19在大小上是异质的，甚至在PNG酶F处理后也是如此。在PNG酶F处理之后发 现有四个具有162Da的增量(一个己糖单元的大小）的峰，并且最丰富的形式是23770Da。这 指示在A. n i ger中产生的AFP 19含有附加的糖基化，所述糖基化并未被PNG酶F除去。AFP 19可 以经0-甘露糖基化为每AFP19分子多至4个甘露糖基残基，其中最丰富的形式具有2个甘露 糖基团。对于在现有技术中研究的不同形式的LelBP尚未检测到0-甘露糖基化(Lee等人， 2012，Journal of Biological Chemistry 287，11460_11468;Lee等人，2013年，同上）〇
[0179] ?最丰富的N-糖基化形式和最丰富的去糖基化形式之间的大小差异为2026Da，这 指示主要的N-糖基化形式除2个0-甘露糖之外，还含有2个N-乙酰葡糖胺(GlcNac)和10个己 糖(Hex)单元。N-糖基化AFP19和经PNG酶F处理的AFP19之间的最小尺寸差异为892Da，代表2 个GlcNac和3个Hex单元。这个结果指示，在A.niger中产生的所有AFP19形式是相较于在 P.pastoris中产生的LelBP不同地N-糖基化的（并且0-甘露糖基化的），在P.pastoris中产 生的LelBP示出为含有仅2个GlcNac和2个Hex(Bma和Man)单元(Lee等人，2012年）。
[0180] ?通过使用此方法，变得显见的是，在Aspergillus niger中产生的最丰富形式的 AFP19的分子量是25796Da。此大小不同于通过MALDI-T0F测量的天然LelBP和在E.coli或 P.pastoris中产生的非糖基化和N-糖基化形式两者的大小(Lee等人，2013年）。
[0181] 这些结果指示，AFP19明显地不同于在现有技术中研究的不同形式的LelBP。
[0182] 实施例5:对来源于Aspergillus niger和Aspergillus oryzae的AFP19的分析
[0183] 使用LC-MS/MS进一步表征在实施例2 (Aspergillus niger)和实施例3 (Aspergillus oryzae)中分离出来的AFP19。为此，将lmg △??19蛋白质在10〇1111顯411(1)3中 稀释至100μg/ml。将100μ1此溶液在90°C下加热10分钟。在用PNG酶F去糖基化之后，在用 LysC消化之后并且在用AspN消化之后，分析AFP19本身。为了去糖基化，加入15μ1 PNG酶F (Sigma，lUAU)，然后在lOOOrpm和37°C的恒温混匀仪中孵化16小时。在测量前将1%甲酸加 入样品中。作为对照，分析未经处理的AFP19蛋白质。
[0184] 关于LC-MS/MS分析，在Acquity I-class-Synapt G2_S(Waters)上，使用以下参数 来分析样品：柱:Acquity UPLC BEH300C4 1·7μπι3〇〇Α孔径，2.1X50mm柱(Waters)。柱温： 75°C。注入体积：ΙμL。流动相A: 0.1 %的蚁酸水溶液。流动相B: 0.1 %的甲酸乙腈溶液。通过 改变相A和B来施加梯度至柱，从而分离不同形式的AFP19蛋白质。
[0185] MS检测器设置为:采集质量范围是500-3500m/z，扫描时间1秒，正ESI，TOF MS分辨 率模式，使用在运行期间即时施加的Leu-Enk进行数据校正。数据频谱反褶积、电荷态剥离 是用Waters MassLynx MaxEntl软件工具执行的：输出质量分辨率=lDa/通道。损伤模型： 高斯型（FWHH=0.750Da;最小强度比=33 %左和右）。迭代至收敛。用MassLynx MaxEnt3软 件工具针对7个电荷中的最大电荷来执行ETD的数据频谱反褶积:集合成员的数目：2并且每 集合成员的迭代次数:50。
[0186] 为了消化AFP19,平行使用Lys C和Asp N。分别将20yl(2yg)Lys C或者Asp N加入 至100yl(100yg)AFP19和400yl(100yg)AFP19中。通过在37°C下孵化过夜来执行消化。将样 品用MilliQ水稀释两次并且在LC-MS/MS分析之前将样品酸化成1%甲酸。经消化的AFP19样 品的LC-MS/MS分析是在Ultimate RS 3000 Orbitrap Fusion(Thermo Fisher)上使用以下 参数进行的：柱：Zorbax XDB-C18 1.8μπι，2.1 X 50mm;窄孔保护柱2.1 X 12.5mm，5微米， Phoroshel 1 300SB-C3(Agilent)。柱温：50°C。注入体积：25μ1。流动相A: 0 · 1 % 甲酸水溶液。 流动相B: 0.1 %的甲酸乙腈溶液。通过改变相A和B来施加梯度至所述柱。
[0187] 对照AFP19序列检索数据(FDR 0· 1 % )。在Proteome Discoverer 1.4· 1 · 14上执行 数据库检索。
[0188] PNG酶F去糖基化前和后完整AFP19的反褶积质谱示出于图3中。
[0189] 这些数据显示，在A.niger中表达的AFP19在氨基末端具有焦谷氨酸。此观测结果 通过对完整酶的电子转移解离(ETD)以及通过在AFP19的LysC消化之后鉴定N末端肽来确 认。焦谷氨酸可对酶稳定性起重要作用并且尚未在关于LelBP的先前文献中描述(Lee等人， 2012年，同上；Lee等人，2013年，同上）。
[0190] 完整AFP19在去糖基化前后的LC-MS数据的比较显示:主要的N糖基化形式含有2个 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和10个己糖(Hex)单元，如图3中所指示。去糖基化的AFP19显示出 162Da的质量增量，从而指示紧接着N-糖基化，酶也经0-甘露糖基化了。这些发现通过AFP19 的AspN消化确认，其中0-甘露糖基化是在SEQ_ID NO: 1中的位置S80和T84上鉴定的。最丰富 形式的AFP19含有一个0-甘露糖基团。除了氨基末端的焦谷氨酸之外，0-甘露糖基化也可对 酶稳定性具有正向作用。同样，这些发现尚未在关于AFP的先前文献中描述(Lee等人，2012 年，同上;Lee等人，2013年，同上）。对N-糖基化和0-甘露糖基化的观测显示，在本文中描述 的AFP19的糖基化模式明显不同于天然LelBP或者在Pichia pastoris中产生的LeIBP(Lee 等人，2012年，同上）。
[0191] 关于完整AFP19在去糖基化前后的LC-MS分析进一步显示，在A.niger中表达的酶 具有C末端截短。所观测到的质量23444Da、23543Da和23770Da分别对应于在N末端具有焦谷 氨酸且在 C 末端缺失VVQKRSNARQWL、VQKRSNARQWL 和 KRSNARQWL 的AFP19。
[0192] 还对在Aspergillus oryzae中表达的AFP19(样品产生于实施例3中）进行上述实 验。这些数据确认在A. oryzae中表达也导致AFP在N末端具有焦谷氨酸，并且N-糖基化和0-甘露糖基化模式高度类似于在A.niger中表达的AFP19的N-糖基化和0-甘露糖基化模式。此 外，在我们的样品中既没有检测到来自E. coli的天然LelBP的质量(25565Da)，也没有检测 到来自先前报告的P.past〇ris(Lee等人，2013年）的糖基化LelBP的质量（26198Da)和非糖 基化LelBP的质量（25150Da)。
[0193] 实施例6:使用来自Aspergillus niger的AFP进行冰再结晶抑制
[0194] 来源于大洋鲶的III型AFP在30%蔗糖中的RI终点由两个不同作者报告为>700nM (511^11￥〇〇(1等人，1999年，同上;1'〇11^231^等人，2003年，同上）。1?1终点是低于其就不再能够 检测到RI活性的浓度。因为RI终点是用于测定ISP在抑制冰重结晶方面的有效性的重要参 数，我们决定在30 %鹿糖中使用经修改、基本上如在Tomczak等人，2003年，同上中描述的一 样的激冷板测定(splat assay)来测定AFP 19的RI终点。
[0195] 向30%(w/v)蔗糖溶液补充作为对照的100mg/l乳清蛋白分离物(WPI--墨林斯 (Mul 1 ins)乳清），或者补充根据实施例2制备的来自Aspergillus niger的4000、80和20nM 的八??19。关于此实验，将231^六?？19溶于4.61111蒸馏水中，并且从此溶液在30%蔗糖溶液中 制备50倍、2500倍、10000倍的稀释液。
[0196] 将10微升这些溶液用来制备显微样品并且安放到装备有冷冻台的Zeiss Axiophot显微镜上。使用装备在所述显微镜上的CCD摄像机进行成像。放大倍数是6.3倍并 且随着时间跟踪样品中的晶体形成。
[0197] 首先，将所述样品以每秒90°C的速率冷却直至-60 °C。在此之后以相同的速率将此 样品加温至-6 °C，并且随着时间跟踪冰晶形成。在0分钟、3分钟、9分钟和60分钟之后，摄像 并将所述图像用于使用Linksys32软件（Linkam Scientific Instruments)测量平均冰晶 大小。此实验的结果示出于表1中，表1清楚地显示AFP19抑制冰再结晶。随着时间变化未检 测到冰晶生长，即使当AFP19的浓度仅为20nM时也是如此。然而，具有WPI的对照样品随着时 间推移表现出晶体大小的明显升高。
[0198] 这些结果显示，在30%蔗糖中，AFP19的RI终点明显低于20nM。此值比所报道的来 自大洋鲶的III型AFP的RI终点（Tomczak等人，2003年，同上：780nM)要低得多。因此，在抑制 冰再结晶方面，AFP19比当前行业标准的III型HPLC12AFP有效得多。
[0199] 表1:随着时间推移，冰晶的最小尺寸和最大尺寸(微米)
[0201 ] 实施例7:用来自Aspergillus niger的AFP19生产的冰糕
[0202]冰糕是通过混合100克糖、400ml水和60克柠檬汁生产的。将对照蛋白质(WPI)或者 根据实施例2制备的来源于Aspergillus niger的AFP19以40nM或者400nM加入。冰糕是通过 将此混合物在标准设置下的Gel5桌上式制冰机(CRM/Telme)中以560g批量处理而产生的。 在生产后，将所述冰糕从机器取出并立即以每部分100克冷冻和贮藏在-30°c下达到分析前 所需的天数(最多4周）。
[0203] 实施例8:对用来自Aspergillus niger的AFP19生产的冰糕的感官分析
[0204] 在评定前的15分钟将部分如在实施例7中描述的冰糕从冰箱中取出并使其在室温 下温热。通过5人组成的专家小组执行感官分析并且评定冰糕的可勺取性(800(^313；[1；^7)、 颜色、口感、风味和整体外观。所有评定员同意，用根据实施例2制备的来源于Aspergillus niger的AFP19制造的冰糕显著不同于对照冰糕。发现相较于对照冰糕，AFP19冰糕在外观上 更白、用勺子挖取时更紧实，并且具有更顺滑的口感。未在风味感觉中发现明显差异。
[0205] 实施例9:用来自Aspergillus niger的AFP19生产的冰糕的融化行为
[0206] 使在实施例6中生产的冰糕在25 °C的控制温度下在1mm的网筛上融化。收集融化物 并不断地在天平上测量重量。此实验的结果可参见图4。在用根据实施例2制备的来源于 Aspergillus niger的AFP19制造的冰糕和对照冰糕之间观察到明显的融化行为差异。用 AFP19制造的冰糕保持冷冻更长的时间段。此效应在40nM AFP19和400nM AFP19两者均可以 观测到。
[0207] 实施例10:用来自Aspergillus niger的AFP19生产的冰淇淋
[0208] 冰淇淋是通过混合以下物质生产的： 乳奶油 286g
[0209] 脱脂奶粉 206g 糖 240g
[0210] 葡萄糖浆 80g
[0211] 使用热水达到总共2kg。
[0212] 通过在设置于95°C下的水浴中加热30分钟来对混合物进行巴氏灭菌。将混合物冷 却并且在4 °C下熟化16h。将混合物均化并过滤，然后分离成各650g的3部分:一个是没有添 加的对照，一个部分获得了根据实施例2制备的来源于Aspergillus niger的40nM AFP19， 以及一个部分获得了根据实施例2制备的来源于Aspergillus niger的400nM AFP19。冰淇 淋是通过将批料在标准设置下的Gel5桌上式制冰机(CRM/Telme)中处理而产生的。在生产 后，将所述冰淇淋从机器取出并立即以每部分100克冷冻和贮藏在_30°C下达到分析前所需 的天数(最多4周）。
[0213] 对使用AFP19生产的冰淇淋的感官分析得到了如针对在实施例8中的冰糕的生产 所描述的相同的结论:相较于对照冰淇淋，用AFP19制造的冰淇淋均在用勺子挖取时更紧实 并且具有更顺滑的口感。
[0214] 实施例11:用来自Aspergillus niger的AFP19生产的冰淇淋的融化行为
[0215]使在实施例10中生产的冰淇淋在25 °C的控制温度下在1mm的网筛上融化。收集融 化物并不断地在天平上测量重量。此实验的结果可参见图5。在用根据实施例2制备的来源 于Aspergillus niger的AFP19制造的冰淇淋和对照冰淇淋之间观察到明显的融化行为差 异。用AFP19制造的冰淇淋保持冷冻更长的时间段。此影响在40nM AFP19和400nM AFP19两 者均可以观测到，这比冰淇淋中来源于大洋鲶的III型HPLC12AFP的推荐剂量(7μΜ)要低得 多（Lewis，2006年，同上）。
[0217] 与被保藏的微生物相关的说明
[0218] (PCT Rule 13bis)
[0219]
[0220] 表 PCT/R0/134(1992年7月）。
【主权项】
1. 核酸构建体，其包含： 编码冰结构蛋白质（ISP)的核酸序列，所述冰结构蛋白质包含在SEQ ID NO: 1中示出的 序列或者与其至少80%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出 的序列或者与其至少80%同一的序列；以及有效连接至所述核酸序列的 控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在丝状真菌宿主细胞中表达。2. 根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸序列编码ISP，所述ISP包含在SEQ ID NO: 1中示出的序列或者与其至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同 一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的所述序列或者与其至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列。3. 根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中所述核酸编码ISP，所述ISP具有能够从 Leucosporidium属的北极酵母中获得的氨基酸序列。4. 根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述控制序列包含不与编码 ISP的核酸天然相关联的启动子。5. 根据前述权利要求中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸是经密码子对优化以 用于在所述丝状真菌宿主细胞中表达的。6. 包含根据权利要求1到权利要求5中任一项所述的核酸构建体的表达载体。7. 丝状真菌宿主细胞，其包含根据权利要求1到权利要求5中任一项所述的核酸构建体 或者根据权利要求6所述的表达载体。8. 根据权利要求7所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞是 Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、 Rasamsonia、Thielavia、Fusariuml^Trichode;rmaj^9〇9. 根据权利要求7或8所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞是 Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Fusarium venenatum和Trichoderma reesei。10. -种用于产生冰结构蛋白质（ISP)的方法，所述方法包括： -提供丝状真菌宿主细胞，所述丝状真菌宿主细胞包含编码ISP的核酸序列，所述ISP包 含在SEQ ID N0:1中示出的序列或者与其至少80%同一的序列，或者包含在SEQ ID N0:1的 第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至少80%同一的序列， 其中所述核酸序列有效连接至控制序列，所述控制序列允许所述核酸序列在所述丝状 真菌宿主细胞中表达； -将所述丝状真菌宿主细胞在适用于产生所述冰结构蛋白质的条件下培养；以及任选 地 -回收所述冰结构蛋白质。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是根据权利要求7到权利 要求9中任一项所述的丝状真菌宿主细胞。12. 根据权利要求10到11中任一项所述的方法，其中所述ISP是从所述宿主细胞分泌 的。13. 根据权利要求10到权利要求12中任一项所述的方法，其中所述ISP是以至少lg/Ι的 量产生的。14. 能够通过根据权利要求10到权利要求13中任一项所述的方法获得的冰结构蛋白 质。15. 冰结构蛋白质，所述冰结构蛋白质包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者与其至少 80%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者与其至 少80%同一的序列，其中 至少一个氨基酸是经修饰的氨基酸； 至少一个氨基酸是〇-甘露糖基化的； 所述蛋白质具有除2GlcNac和2个己糖单元外的糖基化模式;或者 所述蛋白质在 C 末端缺失 WQKRSNARQWL、VQKRSNARQWL 和 KRSNARQWL。16. 根据权利要求15所述的冰结构蛋白质，其中所述经修饰的氨基酸是在氨基末端存 在的焦谷氨酸。17. 食物组合物，其包含根据权利要求14到权利要求16中任一项所述的冰结构蛋白质。18. -种用于制备食物产品的方法，所述方法包括:将根据权利要求14到权利要求16中 任一项所述的冰结构蛋白质与一种或多种食物成分相组合。19. 根据权利要求14到权利要求16中任一项所述的冰结构蛋白质在食物组合物中的用 途。20. 根据权利要求17所述的食物组合物，根据权利要求18所述的方法或者根据权利要 求19所述的用途，其中所述食物组合物是冷冻糖食产品，例如冰激凌或冰糕。
【文档编号】C12N15/81GK105992822SQ201480065622
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2014年12月2日
【发明人】芮妮·马赛尔·钟·德, 彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司