一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了检测细胞溶酶体中的甲醛的荧光探针，所述荧光探针的化学名称为4?肼基?N?(2?吗啉基乙基)萘酰亚胺，同时公开了其制备方法，本发明制备的荧光探针随甲醛含量的增加荧光强度显著增强，利用本发明的荧光探针通过荧光成像技术检测细胞内甲醛含量，尤其是细胞内溶酶体中的甲醛含量可于评价和研究细胞中甲醛的生理功能。
【专利说明】
一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针及其制备方法，属于有机小分 子荧光探针领域。
【背景技术】
[0002] 甲醛在染料、木材加工、纺织工业等化学工程和制药、食品工程中被广泛使用。此 外，因为甲醛具有很好的与蛋白质、DNA相结合的能力，它还是一种常见的细胞和组织、活体 防腐试剂。然而，世界卫生组织已经将甲醛评价为第三种室内化学污染物。接触泄露的甲醛 会导致一系列疾病，例如阿兹海默症、癌症、中风和流产等。研究表明，内源性甲醛主要是由 于组蛋白的脱甲基化和DNA的甲基化产生的，此外，甲胺类化合物经过SSA0酶途径也会代谢 产生甲醛。内源性甲醛在不同细胞和组织内分布是不一样的，到目前为止，仍然没有研究出 内源性甲醛的生理功能，这主要是因为目前还没有有效的工具来识别和检测活细胞、组织、 活体内的甲醛。基于此，评估细胞、组织和活体内的甲醛产生、代谢途径对于研究甲醛的生 理功能至关重要。
[0003]目前已报到的检测甲醛的方法有：辐射度量法、气相色谱法、质谱法、高效液相色 谱法等，但是这些检测操作很繁琐，应用不便，并且正在测试过程中还会对样品进行不可修 复的破坏。因此，发展一种简单快捷的测试甲醛含量的方法尤为重要。荧光探针具有高灵敏 性和专一性等特点，并且在检测过程中不会破坏样品而受到广泛关注。
[0004] 近两年，科研工作者陆续报道了一些甲醛荧光探针，例如我们2016年在德国应用 化学(Angew. Chem. Int. Ed)中报道了一种识别细胞、组织内源性甲醛的双光子甲醛荧光 探针，但是目前能够高度识别甲醛或者专一性识别甲醛的荧光探针还很少，尤其是能够识 别细胞内特殊细胞器(如溶酶体)的甲醛荧光探针还从未有人进行报道，因此，现阶段，开发 一些背景干扰小、散射干扰小、灵敏度和选择性更高，能够避免光漂白和光致毒现象产生的 甲醛荧光探针，尤其是能够识别细胞内特殊细胞器(如溶酶体)的甲醛荧光探针尤为重要。
【发明内容】
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测细胞溶酶体中甲醛的荧光探针 (Na-FA-Lyso)及其应用。利用本发明的探针通过荧光成像技术检测细胞溶酶体中的甲醛 可用于评价和研究细胞内甲醛在溶酶体中的生理功能。
[0006] 本发明所述的检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针，该荧光探针命名为4-肼基-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺，简称Na-FA-Lyso,其化学结构式如式（〗:）所示：
(f)。
[0007] 上述检测细胞溶酶体中甲醛的荧光探针（Na-FA-Lyso)的制备方法是： 制备Na-FA-Lyso:在100 mL圆底烧瓶中，加入4-溴-1，8-萘二甲酸酐（1)，氨乙基吗啉 (2)，再加入乙醇，加热回流生成化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（3);将化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（3)与水合肼(80%) (4)混合，在乙醇中加热回流搅拌，生 成化合物4-肼基-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（5)。简称:Na-FA-Lyso。
[0008] 上述Na-FA-Lyso的制备反应式如下：
[0009]本发明所述的检测细胞溶酶体中甲醛荧光探针Na-FA-Lyso应用于检测生物或者 环境中的甲醛。
[0010]上述应用中：所述荧光探针Na-FA-Lyso能专一识别甲醛，并以荧光增强方式实现 对甲醛的识别，尤其是它还可以定位识别细胞溶酶体中甲醛。
[0011] 本发明所述检测甲醛的荧光探针Na-FA-Lyso本身由于肼基的供电子能力导致a-PET效应而淬灭分子的荧光，当探针与甲醛分子作用后，化合物Na-FA-Lyso上的肼基与甲醛 发生缩合反应，转变成亚甲基肼结构，使得其供电子能力受到抑制，导致荧光强度得到大幅 度提升。
[0012] 识别机理如下：
本发明提供的甲醛荧光探针属小分子类荧光探针，目前针对甲醛识别的小分子荧光探 针报道的并不多，尤其是识别细胞溶酶体中甲醛的荧光探针并未有报道。
[0013] 实验证实，本发明提供的检测甲醛的荧光探针溶液，当向其加入甲醛后荧光显著 增强，该结果及其现象为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在激光激发荧光生物标 记领域具有潜在的应用价值。相应的，利用本发明的探针通过荧光成像技术检测甲醛可于 评价和研究细胞内甲醛的含量和生理功能，尤其是其还可以检测细胞溶酶体中的甲醛，对 研究细胞溶酶体中的甲醛生理功能有潜在的应用价值。
【附图说明】
[0014] 图1:探针Na-FA-Lyso的核磁谱图氢谱； 图2:探针Na-FA-Ly so的核磁谱图氢谱碳谱； 图3:探针Na-FA-Lyso在水相中的选择性。其中激发波长为440 nm;探针的浓度:5 μΜ， 选择性离子(或氨基酸）的浓度为2.5 mM，活性氧(或者活性氮)浓度为100 μΜ，醛酮浓度为 40 μΜ;卜28加入的离子分别为:探针、乙二醛，甲基乙二醛，丙酮酸钠，对羟基苯甲醛，三氯 乙醛，乙醛，对硝基苯甲醛，丙酮，甲醛，次氯酸钠，过氧化氢，过氧化叔丁基，过氧化叔丁醇， 一氧化氮，氯化钙，氯化镁，亚硫酸钠，亚硝酸钠，亚硫酸氢钠，硫氢化钠，L-精氨酸，谷胱甘 肽，L-半胱氨酸，D-同型半胱氨酸，D-半胱氨酸，Ν-乙酰甘氨酸，Ν-乙酰-L-半胱氨酸； 图4:探针Na-FA-Ly so与甲醛作用的滴定实验。其中激发波长为440 nm;探针的浓度:5 μΜ； 图5:探针Na-FA-Ly so与甲醛作用的动力学实验。其中激发波长为450 nm;探针的浓度： 5 μΜ。甲醛浓度为0-1100 μΜ，测试时间：0.5 h; 图6:探针Na-FA-Ly so的外源性甲醛细胞成像应用。激发波长:488 nm，发射波段:500-55〇11111;其中：&)^^细胞的明场图；13)!^1^细胞与甲醛共孵育的明场图；(3)!^1^细胞 与甲醛、化合物Na-FA-Lyso共孵育的明场图；d)HeLa细胞的荧光图；e) HeLa细胞与甲醛共 孵育的荧光图；f) HeLa细胞与甲醛、化合物Na-FA-Lyso共孵育的荧光图；g)为a)和d)的 置加图；h)为b)和e)的置加图；i)为c)和f)的置加图； 图7:探针Na-FA-Lyso的内源性甲醛细胞成像应用。激发波长:488 nm，发射波段:500-550 nm;其中：a) HeLa细胞与亚硫酸氢钠共孵育的明场图；b) HeLa细胞与亚硫酸氢钠、化 合物Na-FA-Lyso共孵育的明场图；c) HeLa细胞与化合物Na-FA-Lyso共孵育的明场图；d) HeLa细胞与亚硫酸氢钠共孵育的荧光图；e) HeLa细胞与亚硫酸氢钠、化合物Na-FA-Lyso 共孵育的荧光图；f) HeLa细胞与化合物Na-FA-Lyso共孵育的荧光图；g)为a)和d)的叠加 图；h)为b)和e)的置加图；i)为c)和f )的置加图； 图8:探针Na-FA-Lyso的溶酶体共定位细胞成像成像应用。激发波长:488 nm,发射波 段:500-550 nm;其中：a)HeLa细胞与溶酶体红色定位染料、甲醛探针Na-FA-Lyso共孵育的 明场图；b)HeLa细胞与溶酶体红色定位染料、甲醛探针Na-FA-Lyso共孵育的红色荧光图；c) HeLa细胞与溶酶体红色定位染料、甲醛探针Na-FA-Lyso共孵育的绿色荧光图；d)为a)、b)和 c)的叠加图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限 制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物的号码。
[0016] 实施例1 化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（3)的合成：
在100 mL圆底烧瓶中，加入4-溴-1，8-萘二甲酸酐（1) 1 mmol，氨乙基吗啉（2) 1.2 mm〇l，再加入乙醇5 mL，加热回流2-3 h后，冷却至室温，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2-3次， 真空干燥，得浅灰色固体4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（3)。产率:81 %。核磁共振图氢 谱和碳谱如图1和图2所示。
[0017] ΧΗ NMR (400 MHz, DMS〇-c/6) δ 8.57 (dd, J ι= 7.2 Hz, J 2 = 0.8 Hz, 1H), 8.55 (dd, /1 = 8.4 Hz, = 0.8 Hz, 1H), 8.34 (d, / = 7.6 Hz, 1H), 8.22 (d, / = 7.6 Hz, 1H), 8.00 (dd, /1 = 8.4 Hz, = 7.2 Hz, 1H), 4.18 (t, /=6.8 Hz, 2H), 3.53 (t, /= 4.8 Hz, 4H), 2.57 (t, /= 7.2 Hz, 2H), 2.47 (s, 4H); 13C 匪R (100 MHz, DMS〇-c/6 ): 163.30， 163.25， 133.09， 132.07， 131.82， 131.44， 130.20, 129.63, 129.27, 128.68, 123.11, 122.33, 66.68, 55.91, 53.87, 37.38〇 化合物4-肼基-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（5)的合成：
将化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（3) 0.2 mmol与水合肼(80%) (4) 0.5mL 混合，在1 mL乙醇中加热回流搅拌4h，冷却至室温，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2-3次，真空 干燥，残渣通过柱层析分离，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇(V/V=30 :1)，得到化合物4-肼基-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺（5)。产率:77 %。
[0018] 4 NMR (400 MHz, DMSO-c/?； ) δ 9.16 (s，1H)，8.62 (d，/ = 8.4 Hz, 1H)， 8.42 (d, /= 7.6 Hz, 1H), 8.29 (d, /= 8.8 Hz, 1H), 7.64 (t, /= 7.6 Hz, 1H), 7.25 (d, /= 8.4 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.15 (t, /= 6.8 Hz, 2H), 3.54 (s, 4H), 2.53 (t, /= 6.8 Hz, 2H), 2.46 (s, 4H) ; 13C NMR (100 MHz, DMSO-c/e): 165.05, 164.14, 154.50, 133.52, 131.87, 130.59, 129.56, 125.39, 122.94, 119.68, 108.52, 106.27, 67.49, 57.09, 54.70, 37.63〇
[0019] 实施例2 化合物Na-FA-Lyso甲醛荧光探针对不同分子或离子的选择性 配制5 mL浓度为40 mM的各种常规的离子及氨基酸的roS水溶液及浓度为1 mM的本发 明所述检测甲醛的荧光探针母液作为备用。
[0020] 加入25 yL探针母液、225 yL DMS0和500当量的各离子（或氨基酸）溶液，用磷酸 缓冲液PBS定容至5 mL，摇匀后进行荧光检测(λΜ= 440 nm，Aem= 543 nm)，建立荧光强度 与各离子（或氨基酸、活性氧、活性氮）的曲线图（结果见图3)。30 min后检测溶液的荧光 发射光谱变化，由图3可以发现，其他离子（或氨基酸）对化合物Na-FA-Lyso的荧光几乎没 有影响，而甲醛的加入使化合物Na-FA-Lyso的荧光显著增强。
[0021] 实施例3 不同浓度的甲醛对化合物Na-FA-Lyso甲醛荧光探针的荧光滴定检测 配制10 mL浓度为100 mM甲醛的水溶液及浓度为1 mM的本发明所述检测甲醛的荧光探 针母液作为备用。
[0022] 配制探针浓度为5 μΜ，分别与不同浓度的甲醛(0 - 100 μΜ)相互作用，并进行荧 光检测(λ0Χ= 440 nm，Xem= 543 nm)，计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与甲醛浓度 标准曲线。如图4所示，随着甲醛浓度的增加，反应体系荧光强度逐渐增加，当甲醛浓度达到 40 μΜ时，反应体系荧光强度达到饱和状态。
[0023] 实施例4 化合物Na-FA-Lyso甲醛荧光探针与甲醛相互作用的动力学测试 配制10 mL浓度为100 mM甲醛的水溶液及浓度为1 mM的本发明所述检测甲醛的荧光探 针母液作为备用。
[0024] 配制探针和甲醛的溶液，其浓度分别为:探针5 μΜ;甲醛浓度:0-200 μΜ。进行荧光 检测（Xex = 440 nm, Aem = 543 nm)，每隔1 min测试一次，测试30 min，计算各体系中随时 间变化的荧光强度，建立荧光强度与作用时间标准曲线。如图5所示，大约反应5 min，反应 体系荧光强度达到饱和状态。
[0025] 实施例5 化合物Na-FA-Lyso甲醛荧光探针的外源性甲醛细胞成像测试 将密度为3 X 105个/mL的癌细胞接种到灭菌的铺有盖玻片（22 mm X 22 mm)的 35 mm培养皿中，在C02培养箱(温度为37 °C，5 % C02)中培养，待细胞贴壁后，分成几组实验 组进行培养：（1)空白细胞组；（2)细胞外加40 μΜ甲醛孵育30 min; (3)细胞外加5 μΜ探 针孵育30 min后再外加40 μΜ甲醛孵育30 min;待培养结束后，用PBS缓冲液冲洗细胞3次， 将培养皿中长有细胞的盖玻片取出，制样，用荧光显微镜分别拍摄这三组条件下培养的细 胞的荧光照片，发现第(3)组的癌细胞发出强烈荧光。（结果见图6)。
[0026] 实施例6 化合物Na-FA-Ly so甲醛荧光探针的内源性甲醛细胞成像测试 将密度为3 X 105个/mL的癌细胞接种到灭菌的铺有盖玻片（22 mm X 22 mm)的 35 mm培养皿中，在C02培养箱(温度为37 °C，5 % C02)中培养，待细胞贴壁后，分成几组实验 组进行培养：（1)细胞外加100 μΜ亚硫酸氢钠孵育30 min; (2)细胞外加100 μΜ亚硫酸氢 钠孵育30 min后再外加5 μΜ探针孵育30 min; (3)细胞外加5 μΜ探针孵育30 min;待培 养结束后，用缓冲液冲洗细胞3次，将培养皿中长有细胞的盖玻片取出，制样，用荧光显 微镜分别拍摄这三组条件下培养的细胞的荧光照片，发现第(3)组的癌细胞能够发出明显 荧光信号。（结果见图7)。
[0027] 实施例7 化合物Na-FA-Ly so甲醛荧光探针的内源性甲醛细胞成像测试 将密度为3 X 105个/mL的癌细胞接种到灭菌的铺有盖玻片（22 mm X 22 mm)的 35 mm培养皿中，在C02培养箱(温度为37 °C，5 % C02)中培养，待细胞贴壁后，进行实验组培 养:将溶酶体红色定位染料加入到细胞培养皿中孵育20 min，然后用roS缓冲液冲洗细胞3 次，将探针Na-FA-Lyso 5μΜ加入到细胞培养皿中，于细胞培养箱内孵育30 min，用roS缓冲 液冲洗细胞3次，用荧光显微镜分别拍摄这三组条件下培养的细胞的荧光照片，发现所报道 的溶酶体靶向甲醛荧光探针Na-FA-Ly so能够高度靶向细胞的溶酶体，经过测试，细胞定位 系数Pearson' s Coefficient高达82%D (结果见图8)。
【主权项】
1. 一种检测细胞溶酶体内甲醛的荧光探针，其特征在于，该荧光探针命名为4-肼基-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺，简称Na-FA-Lyso,其化学结构式如式（f:)所示：(!：)〇2. -种权利要求1所述的检测细胞溶酶体中甲醛的荧光探针的制备方法，其特征在于， 具体制备方法如下： 在100 mL圆底烧瓶中，加入4-溴-1，8-萘二甲酸酐，氨乙基吗啉，再加入乙醇，加热回流 生成化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺;将化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺 与80%水合肼混合，在乙醇中加热回流搅拌，生成化合物4-肼基-N-( 2-吗啉基乙基）萘酰亚 胺。
【文档编号】C09K11/06GK106008342SQ201610338187
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】林伟英, 刘展榕, 徐安, 唐永和
【申请人】济南大学