吡嗪类化合物及其在医药上的用图
【专利摘要】本发明提供一类荧光标记β?淀粉样斑块和神经纤维缠结的吡嗪类化合物，所述化合物的结构通式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：其中，n为1、2或3。本发明还提供所述化合物的制备方法及应用。该类化合物可直接做为检测或显像动物或人体组织内β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的显像剂。该类化合物特别适合于制备直接检测并诊断包括阿尔茨海默病在内的β-淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的显像剂或诊断药物。
【专利说明】
[0001] 吡嗪类化合物及其在医药上的用途
技术领域
[0002] 本发明涉及特异性分子识别诊断试剂领域，更具体地说，涉及一类与β-淀粉样斑 块和神经纤维缠结具有高亲和力的新型小分子荧光化合物，以及该类化合物在制备用于检 测或显像淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的显像剂中的应用。
[0003]
【背景技术】
[0004] 阿尔茨海默病(Alzheimer ' s Disease，AD)是一种进行性发展的致死性神经退行 性疾病。目前我国已提前进入老龄化社会，大约有600万人患AD，数量居世界各国之首，且患 病人数以每年30万以上的速度递增。我国65岁以上人群患病率达7.2%，且AD患者正在向年 轻化趋势发展。AD已成为仅次于心脏病、癌症、中风的导致老人死亡的第四大杀手。AD不但 严重影响中老年人的生活质量，而且给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。由于AD病因 复杂，确切的发病机理目前仍不清楚，临床上主要通过评价患者的认知功能损伤来诊断，确 诊患者多已进入病程的中晚期而延误治疗。缺乏有效的检测手段，已成为AD早期诊断与治 疗的重大障碍。
[0005] 在AD患者脑内，以β-淀粉样蛋白（Αβ)为主要成分的β-淀粉样斑块(Αβ斑块)和以过 度磷酸化Tau蛋白为主要成分的神经纤维缠结是AD最为显著的两大神经病理学特征。研究 表明，脑内Αβ斑块或神经纤维缠结的沉积均不同程度地早于AD的临床发病期，故开发以Αβ 斑块或神经纤维缠结为靶标的检测试剂，将对AD的早期诊断、病程监测以及治疗药物的研 究等提供重要的分析手段。
[0006] 过去数年间，多个用于正电子发射断层扫描成像技术(PET)的Αβ斑块示踪剂进入 临床试验阶段，其中C-11 标记的[nC]PIB(KlunkWE,et al. Ann. Neurol. 2004，55(3)， 306-319)是目前全球应用最为广泛的Αβ斑块PET显像剂；[1乍从￥-45(10即0?，6七&1· J. Nucl. Med.2010, 51(6), 913-920)^ [18F]GE-〇67(Koole M, et al. J. Nucl. Med. 2009,50 (5), 818-822)以及[18F]BAY-94-9172(Rowe CC, et al .Lancet. Neurol. 2008， 7 (2)，129-135 )等三个F-l 8标记的Αβ显像剂已被美国FDA和欧洲EMA批准用于人体脑内Αβ 斑块的PET显像（Villemagne VL. Ageing. Res. Rev. 2016，pii: S1568-1637(16) 30005-8)。用于脑内神经纤维缠结PET显像的小分子探针也有数个进入人体临床试验，具体 包括：[ 18卩从￥-1451、[1乍]1'服-5117、[1乍]1'冊-5351、[ 11(：]?883以及[1乍]1?06958948等 (Okamura N, et al. Ageing. Res. Rev. 2016，pii: S1568-1637(15)30045-3)。但是放 射性显像剂的应用也受一些因素限制，比如放射性显像剂所发出的射线对人体具有一定的 辐射损伤、需要医疗机构配套有生产放射性核素的回旋加速器、放射性显像剂须专业技术 人员标记配制、显像时间长且图像处理费时等。
[0007] 相较之下，光学成像具有安全无放射性、数据采集时间短以及成本低廉等诸多优 势，近年在医学诊断等中的应用受到广泛重视;尤其是新兴的近红外荧光成像技术，在其光 谱范围内，生物组织的自发荧光干扰较小，组织背景荧光信号很低，且穿透组织距离可高达 数厘米。此外，光声成像技术(photoacoustic imaging，PAI)通过光声信号的转换，可实现 三维扫描成像。因此，研发与Αβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的靶向光学探针，并直接 应用于制备检测或显像β-淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的显像剂，将具有非常 重要的科学意义和实际价值。然而，目前国内外有关靶向Αβ斑块或神经纤维缠结的荧光化 合物的研究报道较少，还处于起步阶段。基于上述技术背景，研发性能优异的新型小分子荧 光化合物，符合我国社会民生的迫切需求和老龄化社会国情，具有重大的应用前景和科学 意义。
[0008]
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题在于，现有显像探针常需外接荧光团，且荧光团具有较 大的分子结构并带有电荷，因而不适合应用于制备须通过血脑屏障的脑内Αβ斑块或神经纤 维缠结的显像剂，且非特异结合的荧光团发光对成像易产生干扰信号。本发明提供一类不 带电荷的小分子荧光化合物，其结构中的推电子基团和拉电子基团，形成推-拉电子作用的 共辄结构，并通过碳碳双键增加跃迀的共辄体系，使化合物分子产生的荧光向长波方 向移动(减少生物自发荧光干扰），同时其结构整体又满足了与Αβ斑块或神经纤维缠结的亲 和力。化合物与Αβ斑块或神经纤维缠结结合后发射波长蓝移或红移，且荧光强度显著提高， 从而有效排除非特异结合的化合物发光对成像可能产生的干扰，因此该类化合物可直接做 为检测或显像淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的药物或药物有效成分。
[0010] 本发明的目的在于提供与Αβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的小分子荧光化 合物。
[0011] 本发明的另一目的是提供所述化合物的制备方法及应用。
[0012] 为了实现本发明目的，本发明的一类与Αβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力的化 合物，其特征在于，所述化合物结构如式(I)或式（Π )所示：
其中，η为1、2或3。 1 本发明还提供前述式（I)所示化合物的制备方法。具体如下：通过Knoevenagel缩 合反应合成目标化合物:取2-甲基P比嗪3 mmol及对应醛1 mmol溶于20-40 mL干燥四氢咲喃 后，加入叔丁醇钾4 mmol，80°C加热回流2小时，旋蒸除去溶剂;加入20 mL水析出固体，抽 滤后将所得固体进行柱层析分离得到如式(I)所示的化合物。
[0014]本发明也提供前述式（Π )所示化合物的制备方法。具体如下:通过Knoevenagel缩 合反应合成目标化合物:取2-甲基喹喔啉2 mmol及对应醛1 mmol溶于10-30 mL氢氧化钠 溶液(5mol/L)，加入Aliquat 336(0.1 mmol)，100°C加热回流8-15小时，冷却，过滤，将所得 固体进行柱层析分离得到如式（Π )所示的化合物。
[0015] 本发明进一步提供一种药物组合物，所述组合物包括式（I)或式（Π )所示的化合 物与药学上可接受的盐、前药或载体组成的制剂。"药学上可接受的载体"包括各种赋形剂 和稀释剂。本发明所述的在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、生理盐水、甘 油和乙醇等。
[0016] 本发明式（I)或式（Π )所示的化合物可有效荧光标记转基因小鼠和人脑中的Αβ斑 块和神经纤维缠结，且该类化合物与Αβ斑块结合后发射波长蓝移、与神经纤维缠结结合后 发射波长红移，因此通过单个化合物的多光谱成像即可实现β-淀粉样斑块和神经纤维缠结 的同步实时检测。
[0017] 本发明进一步提供式（I)或式（Π )所示的化合物在制备检测或显像动物或人体组 织内的淀粉样斑块或神经纤维缠结的药物或其药物有效成分中的应用。在应用过程中， 将可检测量的式（I)或式（Π )所示的化合物通过本领域技术人员公知的方法给药至动物或 人体组织内。在本发明的优选实施方案中，以可检测量的式（I)或式（Π )所示的化合物引入 动物或人体内并且在足以使化合物与淀粉样斑块或神经纤维缠结结合的时间之后，非创 伤性地检测化合物。在本发明的另一实施方案中，将式(I)或式（Π )所示的化合物引入动物 或人体内，经足量的时间以使化合物与淀粉样斑块或神经纤维缠结结合，取组织样品，并 脱离动物或人体检测组织中的化合物。在本发明的第三个实施方案中，自动物或人体取组 织样品并且将式（I)或式（Π )所示的化合物引入该组织样品。在足以使该化合物结合至β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的时间之后，检测化合物。
[0018] 本发明所述的显像手段为光学显像或光声显像，包括但不限于荧光显微技术、激 光共聚焦显微技术、多光子显微技术、光学投影断层扫描技术(OPT)、光片照明显微技术 (SPIM)、荧光成像系统、介观荧光断层扫描技术、荧光分子断层扫描成像技术(FMT)、多模态 成像系统(荧光成像结合X射线/CT/MRI)、光声成像系统、多光谱光声断层成像(MS0T)等。
[0019] 本发明所述淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病包括但不限于阿尔茨海默 病、淀粉样脑血管病、淀粉样蛋白多发性神经病、全身性老年淀粉样蛋白病、淀粉样蛋白心 肌病、具有淀粉样变的遗传性脑出血、克雅氏病、Π 型糖尿病胰岛瘤、额颞叶痴呆、匹克氏 病、缠结为主型痴呆、进行性核上麻痹(PSP)、皮质综合征(CBS)、慢性创伤性脑病变(CTE)、 神经节神经胶质瘤等。
[0020] 本发明提供了一类基于推拉电子结构的与Αβ斑块和神经纤维缠结具有高亲和力 的荧光化合物。体外荧光染色实验表明，该类化合物能够清楚地与转基因小鼠脑切片和患 病人脑组织切片的Αβ斑块和神经纤维缠结结合，发射波长移动且荧光强度显著增强；正常 小鼠体内分布实验结果显示该类化合物具有良好的入脑能力并能从脑内快速清除。因此， 该类化合物具有成为阿尔茨海默病等淀粉样蛋白沉积疾病或神经纤维缠结疾病的新型 显像剂和诊断药物的巨大潜力。
[0021]
【附图说明】
[0022]图1为本发明式(I)及式（Π )化合物合成过程示意图 图2为PB-1和QB-1分别对APP/PS1转基因小鼠脑切片荧光染色标记结果。其中右图为硫 磺素 S(ThS)对相邻鼠脑切片的染色结果。
[0023]图3为PB-1对AD患者脑切片荧光染色标记结果。其中图A、B、C分别为PB-1染色后同 一位置在紫光、绿光、红光波段下的染色结果:Arrow head所指处为PB-1荧光标记的神经纤 维缠结，arrow所指处为PB-1荧光标记的Αβ斑块;图D为同一位置的免疫染色结果。
[0024]图4为ΡΒ-1与她-42聚集体混合前后的荧光发射光谱。
[0025]
【具体实施方式】
[0026] 以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于所述实施例。常见的且对 本领域技术人员而言显而易见的各种条件和参数的其他适当的修饰和改变处于本发明的 精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟识的常 规手段，所用原料均为市售商品。
[0027] 实施例一:式(I)所示的化合物的合成 本发明式(I)所示的化合物的合成路径如图1所示。
[0028] 合成 ΡΒ-1
将2-甲基吡嗪（282.3 mg，3 mmol)与4-Ν，Ν二甲氨基肉桂醛（175.4 mg，l mmol)溶于 20 mL干燥四氢呋喃，加入叔丁醇钾（448.8 mg，4 mmol)，80°C加热回流2小时，旋蒸除去溶 剂;加入20 mL水析出固体，抽滤后将所得固体进行柱层析分离，得到105.8 mg PB-1，产率 42.1%。结构如下：h-NMR (400 MHz, CDCl3)j 8.50 (s，1H), 8.47 (s，1H)，8.30 (s， 1Η), 7.51 (dt, J = 36.4, 18.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 7.0 Hz, 1H),6.81 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.58 (s, 1H), 3.00 (s, 6H)〇
[0029] 实施例二:式（Π )所示的化合物的合成 本发明式（Π )所示的化合物的合成路径如图1所示。
[0030] 合成 QB-1
取2-甲基喹喔啉（288 mg，2 mmol)及4_N，N二甲氨基肉桂醛（175.4 mg，l mmol)溶于 15 mL 氢氧化钠溶液(5mol/L)，加入Aliquat 336(43 mg，0.1 mmol)，100°C加热回流 10小 时，冷却，过滤，将所得固体进行柱层析分离得到91.0 mg QB-1，产率30.2%。结构如下：咕-匪R (400 MHz, CDC13):S 8.90 (s， 1H)， 8.03-7.99 (m， 1H)， 7.73-7.63 (m， 4H)， 7.40 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.89 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 15.6 Hz), 6.70 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 3.02 (s, 6H)。
[0031] 实施例三:光学参数的测定 1.最大吸收波长与摩尔吸收系数的测定 以二氯甲烷为溶剂，分别配制一定浓度梯度的化合物，如1、5、10、20、25 μΜ的溶液，用 紫外-可见分光光度计扫描紫外吸收光谱，记录最大吸收波长(Aabs)和吸光度，并计算摩尔 吸收系数ε(Μ< cnf1)。本发明实施例中的部分化合物的最大吸收波长与摩尔吸收系数见表 1〇
[0032] 2.荧光激发波长与荧光发射波长的测定 本发明中的化合物具有良好的荧光性质。为了考察本发明中的化合物的荧光性质，具 体实施步骤为:精密称取本发明中的化合物适量，溶于二氯甲烷，并用二氯甲烷稀释至1 μ mol ?I/1。应用荧光分光光度计进行荧光检测。固定激发/发射波长并400-750 nm连续扫描 发射/激发波长，绘制波行图像。本发明实施例中的部分化合物的最大激发波长(λΜ)与最大 发射波长(U见表1。
[0033] 表1实施例中的部分化合物的光学性质
实施例四：体外荧光染色实验 1.小鼠脑切片的荧光染色 本发明中的化合物能够清晰染色转基因小鼠脑切片上的Αβ斑块，并有效地荧光标记Αβ 斑块。为了考察对Αβ斑块的标记能力，具体实施步骤为:配制浓度为Ιμπιο? · Γ1的本发明中 的化合物，分别滴加覆盖APP/PS1转基因小鼠（26月龄)脑切片（1 Ομπι)，室温培育10分钟；切 片按40 %乙醇(2分钟）、40 %乙醇(2分钟）、纯水(30秒）的顺序进行漂洗，风干后应用荧光显 微镜观察。邻接切片用硫磺素染色以确认Αβ斑块位置。本发明中的化合物染色荧光斑点与 邻接切片的荧光斑点位置一致，能够选择性结合Αβ斑块，并有效地荧光标记Αβ斑块。其中， 本发明实施例中的部分化合物的染色结果如图2。
[0034] 2. AD患者脑切片的荧光染色 本发明中的化合物能够清晰有效地荧光标记AD患者脑切片上的神经纤维缠结。具体实 施步骤为:配制浓度为1 μπιο? ?I/1的本发明中的化合物，分别滴加覆盖AD患者脑切片(5 μ m)，室温培育15分钟；切片按40%乙醇（1分钟）、40%乙醇（1分钟）、纯水(30秒)的顺序进行漂 洗，风干后应用荧光显微镜观察。同一切片用磷酸化Tau蛋白特异抗体(AT-8)和DAB染色剂 通过免疫染色确认神经纤维缠结。本发明实施例中的部分化合物的染色结果如图3。本发明 中的化合物PB-1在红光波段能够清晰有效地荧光标记神经纤维缠结(arrow head)而不显 示Αβ斑块荧光，在紫光波段能够清晰有效地荧光标记Αβ斑块(arrow)而不显示神经纤维缠 结荧光；因此通过PB-1在不同波段的多光谱显像，可实现同时特异性区分检测神经纤维缠 结和Αβ斑块。
[0035]实施例五:Α&-42聚集体混合后的化合物荧光光谱 本发明中的化合物与Αβ聚集体结合后具有荧光增强的性质。为了考察本发明中的化合 物与Αβ混合后的荧光光谱行为的变化，具体实施步骤为:精密称取本发明中的化合物适量， 溶于乙醇，并用PBS稀释至1 μπιο? ?I/1。应用荧光分光光度计进行荧光检测。固定激发/发射 波长并400-750 nm连续扫描发射/激发波长，绘制波行图像。选用ΑβΗ〗蛋白在37°C水浴中 培育如聚集体，用于模拟人脑内的如聚集体。将化合物（1以111 〇1*1/1)与仙1-42聚集体(2.75 μπιο? ·Ι^)混合，应用荧光分光光度计进行荧光检测。固定激发/发射波长并400-750 nm连 续扫描发射/激发波长，绘制波行图像。本发明中的化合物与Αβ聚集体结合后具有荧光增强 的性质。其中，本发明实施例中的化合物与Afo- 42聚集体混合前后的荧光光谱行为见图4。化 合物PB-1与Afo-42聚集体混合后的荧光强度显著增强，为化合物自身荧光强度的76倍。
[0036]实施例六:正常小鼠脑内摄取与清除实验 本发明中的化合物能够快速有效地穿过血脑屏障入脑，并具有良好的初始摄取量和清 除速率。具体实施步骤为:取本发明中的化合物(2.0 mg/kg，含20%二甲亚砜和80%丙二醇）， 经尾静脉注射入正常小鼠 （η = 5)体内，分别于注射后2、10、30以及60 min时断头取脑。脑 组织称重、匀浆，并用乙腈1 mLX3次提取，低温高速离心（10000 r，4°C)5 min，取上层清 液，经0.22 μπι微孔滤膜过滤，注入HPLC仪分析并计算％ injected dose per gram (%ID/ g)。本发明实施例中的部分化合物的HPLC分析条件见表2。本发明实施例中的部分化合物的 分析结果见表3。本发明中的化合物能够快速穿过血脑屏障进入脑内（注射后2 min即已入 脑），且具有良好的脑初始摄取量和清除速率。
[0037] 表2 HPLC分析条件
表3 HPLC分析结果
【主权项】
1. 一种荧光标记β-淀粉样斑块和神经纤维缠结的化合物，其特征在于，所述化合物结 构如式(I)所示：其中，η为1、2或3。2. 权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，通过Knoevenagel缩合反应合成 目标化合物:取2-甲基吡嗪3 mmol及对应醛I mmol溶于20-40 mL干燥四氢呋喃后，加入叔 丁醇钾4 mm〇l，80°C加热回流2小时，旋蒸除去溶剂;加入20 mL水析出固体，抽滤后将所得 固体进行柱层析分离得到如式(I)所示的化合物。3. -种药物组合物，其特征在于由权利要求1中所述的化合物与药学上可接受的盐、前 药或载体组成的制剂。4. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物在制备检测或显像动物或 人体组织内的β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的药物或其药物有效成分中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的药物为光学显像技术或光声显像技 术药物。6. -种荧光标记β_淀粉样斑块和神经纤维缠结的化合物，其结构如式（Π )所示：其中，η为1、2或3。7. 权利要求6所述化合物的制备方法，其特征在于，通过Knoevenagel缩合反应合成目 标化合物:取2-甲基喹喔啉2 mmol及对应醛I mmol溶于10-30 mL氢氧化钠溶液(5mol/L)， 加入AI i qua t 3 3 6 (0 · I mmo 1 )，10 0 °C加热回流8 -15小时，冷却，过滤，将所得固体进行柱层 析分离得到如式（Π )所示的化合物。8. -种药物组合物，其特征在于由权利要求6中所述的化合物与药学上可接受的盐、前 药或载体组成的制剂。9. 根据权利要求6所述的化合物，其特征在于所述的化合物在制备检测或显像动物或 人体组织内的β-淀粉样斑块或神经纤维缠结的药物或其药物有效成分中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的药物为光学显像技术或光声显像技 术药物。
【文档编号】A61K49/22GK106008374SQ201610396936
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】程妍
【申请人】四川大学