一种苯并内酯类化合物、其制备方法和在制备抗癌药物中的应用

文档序号:10642644
一种苯并内酯类化合物、其制备方法和在制备抗癌药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种苯并内酯类化合物,化合物命名为2?甲基?1?(2?氧代丙基)?异苯并呋喃?5(3H)?酮,英文名为:2?methyl?1?(2?oxopropyl)?isobenzofuran?5(3H)?one,其分子式为C12H12O3。本发明还公开了苯并内酯类化合物制备方法,以烟叶为原料,经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤而分离得到。经细胞毒活性实验,该苯并内酯类化合物对部分肿瘤细胞株具有较好的细胞毒活性。
【专利说明】
一种苯并内酯类化合物、其制备方法和在制备抗癌药物中的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于烟草化学技术领域,具体涉及一种从烟草中首次提取得到的苯并内酯 类化合物。同时,本发明还涉及该化合物的制备方法和在制备抗癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 烟草是世界上化学成分最为复杂的植物,次生代谢产物非常丰富,据1982年Dube 和Green等报道,烟草中已鉴定出的化学成分就超过2549种,至丨」2008年,Rodgman和perf ett i 的报道称,烟草、烟草代用品以及卷烟烟气中发现的化合物总数大约为8700种。目前,人们 从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种,而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟 草除主要用于卷烟抽吸用途外,还可从中提取多种有利用价值的化学成分,从中发现有开 发利用价值的先导性化合物。
[0003] 苯丙素是天然存在的一类苯环与三个直链碳连接(C6-C3基团)构成的化合物。一 般具有苯酚结构,是酚性物质。在生物合成上,这类化合物多数由莽草酸通过苯丙氨酸和酪 氨酸等芳香氨基酸,经脱氨、羟基化等一系列反应形成。由于苯丙素类化合物具有如此广谱 的药理活性,国内外研究者对该类化合物进行了深入的研究,除从天然产物中寻找该类化 合物外,还经过结构修饰而得到具有更优活性的化合物。本发明从烟草中分离得到一个苯 并内酯类化合物,且该化合物具有显著的细胞毒活性,可作为抗肿瘤药物开发中的先导性 化合物。

【发明内容】

[0004] 本发明的第一目的在于提供一种苯并内酯类化合物;第二目的在于提供所述苯并 内酯类化合物的制备方法;第三目的在于提供所述苯并内酯类化合物在制备抗癌和抗烟草 花叶病毒药物中的应用。
[0005] 本发明的第一目的是这样实现的,所述的苯并内酯类化合物是从烟叶中分离得 至1J,其分子式为C12H12O3具有下述结构:
[0006]
[0007] 该化合物为白色粉末,2-甲基-1-( 2-氧代丙基)_异苯并呋喃-5 (3H)-酮,英文名 为:2-methyl-1-(2-〇xopropyl)-isobenzofuran-5(3H)-〇ne〇
[0008] 本发明的第二目的是这样实现的,所述苯并内酯类化合物的制备方法,是以烟叶 为原料,经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高效液相色谱制备分离步骤,具 体为:
[0009] A、浸膏提取:将烟叶粉碎到20~40目,用有机溶剂超声提取2~5次,每次30~60分 钟,合并提取液、过滤,减压浓缩提取液,静置,滤除沉淀物,浓缩成浸膏a;
[0010] B、有机溶剂萃取:在浸膏a中加入重量比1~2倍量的水,然后用与水等体积的有机 溶剂萃取3~5次,合并有机溶剂萃取相,减压浓缩成浸膏b;
[0011] C、MCI脱色:在浸膏b加入重量比3~5倍量的甲醇水溶解,上MCI柱,用90%-95 %甲 醇水洗脱,合并有机相,减压浓缩成浸膏c;
[0012] D、硅胶柱层析:浸膏c上硅胶柱层析,装柱硅胶为160~200目,用量为浸膏c重量6 ~10倍量;以体积配比为1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,收集梯度洗脱液、 浓缩,经TLC监测,合并相同的部分;
[0013] E、高效液相色谱分离:将以体积含量将6:4的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液经高效 液相色谱分离纯化,即得所述的苯并内酯类化合物。
[0014]以上述方法制备得到的苯并内酯类化合物的结构通过以下方法进行测定;本发明 化合物为浅黄色胶状物;HRESI-MS显示其准分子离子峰为227.0676[M+Na] + (计算值 227.0684),结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C12H12〇3,不饱和度为7。红外光谱中显示了 羰基(1729、1657cm-4和芳环(1615、1560、1455cm-4的共振吸收峰。而紫外光谱在308、280 和210nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。化合物的 1Η和13C NMR谱(数据归 属见表1)显不其含有12个碳和12个氢的信号,分别为一组1,2,4,5-四取代的苯环信号[5C 130.9(01)、142.8(02)、128.5(03)、145.0(04)、123.1(05)、129·3(06);δΗ 6.95( 1H, s,H-3)、7.76(1H,s,H-6)],一组丙酮基信号[δ。49.3(C-7)、206.8(C-8)、30.1(C-9);S h 4.19(2H,s,H-7)、2.30(3H,s H-9)],一个氧化亚甲基信号[δ。72·0(Ο2');δΗ 5.23(2H,s, H-2')],一个酯羰基信号[δ。168.8(C-3')]和一个甲基[δ。22·2((Μ');δΗ 2.51(3H,s,H-1')]。根据 Η2-2'(δΗ5·23)与 03'(δ。168·8)、03(δ。128·5)、04(δ。145.0)和 C_5(Sc 123.1);以及 Η_6(δΗ 7.76)与 03'(δ。168·8);Η-3(δΗ 6.99)与 02'(δ。72.0)的 HMBC 相关 可证实C-2 '和C-3 '分别连接在苯环的C-4和C-5上,并形成了一个五元内酯环,从而证实该 化合物为苯并已呋喃内酯类化合物。在化合物的母体骨架确定后,其它取代基团也可通过 HMBC相关确认。在HMBC谱中,可以明显观测到H-7 (δΗ 4.19)与C-1 (δ。130.9)以及H-6(δΗ 7.76)与C-7(Sc 49.3)的HMBC相关,证明了丙酮基连接在苯环的C-1位,而甲基氢(δΗ 2.51s) 和〇1(3[130.9)、(:-20。142.8)和(:-3(3。128.5)的相关可证实甲基取代在(:-2位。最终确 定了本发明化合物的结构,并命名为2-甲基-1-(2-氧代丙基)-异苯并呋喃-5(3H)_酮。 [00 15]化合物的红外、紫外和质谱数据:UV(甲醇),Xmax(l〇ge )308(3.81)、280(3.64)、210 (4.12)nm,IR(溴化钾压片)vmax3072、2960、1729、1657、1615、1560、1455、1353、1216、1156、 1045、869cm- 1;咕 NMR和 13C NMR数据(CDC13,500和 125MH),见表-1 ;ESI-MS(正离子模式)m/z 227[M+Na] + ;HR-ESI-MS(正离子模式)m/z[M+Na]+227.0676(计算值227.0684,Ci2Hi2Na03)。
[0016]表-1.化合物的1H NMR和 13C NMR数据(CDCi3)
[0017]
[0018] 本发明的第三目的是这样实现的,所述的苯并内酯类化合物在制备抗癌药物中的 应用。
[0019] 本发明化合物是首次从烟叶中分离出来的,通过核磁共振和质谱测定方法确定为 苯并内酯类化合物,并表征了其具体结构。以本发明化合物为原料,对NB4、A549、SHSY5Y、 PC3和MCF7细胞株进行了细胞毒活性测试;结果表明化合物具有较好的细胞毒活性,其IC50 值分别达 〇·28、0·16、0·34、0·30、0·12μΜ。
[0020] 本发明的有益效果:
[0021]本发明化合物是首次从烟叶中分离出来,化合物结构新颖,具有较好的生物活性, 可作为抗癌药物的先导化合物。
【附图说明】
[0022] 图1本发明苯并内酯类化合物的核磁共振碳谱(13C NMR);
[0023] 图2为本发明苯并内酯类化合物的核磁共振氢谱(? NMR);
[0024] 图3本发明苯并内酯类化合物的关键HMBC相关。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基 于本发明教导所作的任何变换或改进,均落入本发明的保护范围。
[0026]本发明所述的苯并内酯类化合物,是从烟叶中分离得到,其分子式为C12H120 3,具有 下述结构:
[0027]
[0028] 命名为:2_甲基-1-(2-氧代丙基)-异苯并呋喃-5(3H)_酮,英文名为:211的1^1-1-(2-oxopropy1)_i sobenzofuran-5(3H)-one 〇
[0029] 本发明所述苯并内酯类化合物的制备方法,是以烟叶为原料,经浸膏提取、有机溶 剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析、高效液相色谱制备分离步骤,具体为:
[0030] A、浸膏提取:将烟叶粉碎到20~40目,用有机溶剂超声提取2~5次,每次30~60分 钟,合并提取液、过滤,减压浓缩提取液,静置,滤除沉淀物,浓缩成浸膏a;
[0031] B、有机溶剂萃取:在浸膏a中加入重量比1~2倍量的水,然后用与水等体积的有机 溶剂萃取3~5次,合并有机溶剂萃取相,减压浓缩成浸膏b;
[0032] C、MCI脱色:在浸膏b加入重量比3~5倍量的甲醇水溶解,上MCI柱,用80%-90%甲 醇水洗脱,合并有机相,减压浓缩成浸膏c;
[0033] D、硅胶柱层析:浸膏c上硅胶柱层析,装柱硅胶为160~200目,用量为浸膏c重量6 ~10倍量;以体积配比为1:0~〇:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,收集梯度洗脱液、 浓缩,经TLC监测,合并相同的部分;
[0034] E、高效液相色谱分离:将以体积含量为将(6:4)的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液经 高效液相色谱分离纯化,即得所述的苯并内酯类化合物。
[0035] 所述A步骤的有机溶剂为70~100%的丙酮、90~100%的乙醇或90~100%的甲 醇。
[0036]所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚。
[0037]所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前,用重量比1.5~3倍量的丙酮或者甲醇溶 解,然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。
[0038] 所述D步骤的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积配比为20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1: 1〇
[0039]所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以2 5 - 4 0 %的甲醇为流动相,流速15~ 20ml/min,以21.2X250mm,5ym的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相,紫外检测器检测 波长为308nm,每次进样10~100yL,收集20~40min的色谱峰,多次累加后蒸干。
[0040] 本发明苯并内酯类化合物在制备抗癌药物中的应用。
[0041] 本发明所述的决明属植物不受地区和品种限制,均可以实现本发明。
[0042] 实施例1
[0043] 取干燥的烟叶4.4kg,粗粉碎至30目,用70 %的丙酮超声提取4次,每次60分钟,提 取液合并;提取液过滤,减压浓缩至体积的1/4;静置,滤除沉淀物,浓缩成120g的浸膏a;在 浸膏a中加入250g水,用与水等体积的氯仿萃取5次,合并萃取相,减压浓缩成80g浸膏b;浸 膏b用MCI装柱,在浸膏b中加入240g的80 %甲醇水溶解,然后上柱,用90 %甲醇水2至6升洗 脱,收集洗脱液,减压浓缩得到62g浸膏c;浸膏c在浸膏c中加入120g的丙酮溶解,然后加入 100目硅胶62g拌样,拌样后,用200目硅胶400g装柱;用体积比分别为20:1,9:1,8:2,7:3,6: 4和1:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,收集梯度洗脱液、浓缩,经TLC监测,合并相同 的部分,得至1」6个部分A-F,其中,对收集到的样品E(6:4)部分12g,再以36wt%的甲醇水溶液 为流动相,流速181111/111;[11,21.2\2501]1111,5以1]1的2〇1^31?代。!^16?反相制备柱为固定相,紫 外检测器检测波长为308nm,每次进样50yL,收集32.2min的色谱峰,多次累加后蒸干,即得 所述新化合物。
[0044] 实施例2
[0045] 取干燥的烟叶10kg,粗粉碎至40目,用80%的甲醇冷浸提取4次,每次3天,提取液 合并;提取液过滤,减压浓缩至体积的1/4;静置,滤除沉淀物,浓缩成300g浸膏a;在浸膏a中 加入350g水,用与水等体积的乙酸乙酯萃取5次,合并萃取相,减压浓缩成210g浸膏b;浸膏b 用MCI装柱,在浸膏b中加入600g的80%甲醇水溶解,然后上柱,用90%甲醇水5至15升洗脱, 收集洗脱液,减压浓缩得到150g浸膏c;浸膏c中加入300g的丙酮溶解,然后加入100目硅胶 150g拌样,用200目硅胶lKg装柱,拌样后上柱;用体积比分别为20:1,9:1,8: 2,7:3,6:4和1: 1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,收集梯度洗脱液、浓缩,经TLC监测,合并相同的部 分,得到6个部分A-F,其中,对收集到的样品E(6:4)部分32g,再以36%的甲醇为流动相,流 速18ml/min,21.2 X 250mm,5μηι的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相,紫外检测器检测 波长为308nm,每次进样80yL,收集32.2min的色谱峰,多次累加后蒸干,即得所述新化合物。
[0046] 实施例3
[0047] 取实施例1制备的化合物,为浅黄色胶状物;
[0048] 测定方法为:用核磁共振,结合其它波谱技术鉴定结构。本发明化合物为浅黄色胶 状物;HRESI-MS显示其准分子离子峰为227.0676[M+Na] + (计算值227.0684),结合1H NMR和 DEPT谱确定其分子式为C12H12〇3,不饱和度为7。红外光谱中显示了羰基(1729、1657CHT 1)和 芳环(1615、1560、1455cm-4的共振吸收峰。而紫外光谱在308、280和210nm有最大吸收也说 明了化合物中可能存在芳环结构。化合物的 1Η和13C NMR谱(数据归属见表1)显示其含有12 个碳和12个氢的信号,分别为一组1,2,4,5-四取代的苯环信号[6。130.9((:-1)、142.8((:-2)^128.5(C-3)^145.0(C-4)^123.1(C-5)^129.3(C-6);5 h 6.95(1H,s,Η-3).76(1H,s,Η-6)],一组丙酮基信号[Sc 49.3(C-7)、206.8(C-8)、30.1(C-9);Sh 4.19(2H,s,H-7)、2.30 (3H,s H-9)],一个氧化亚甲基信号[δ。72·0(Ο2');δΗ 5.23(2!1,8,!1-2')],一个酯羰基信 号[δ。168.8(C_3')]和一个甲基[δ。22·2(0Γ) ;δΗ 2.51(3H,s,H-l')]。根据Η2_2'(δ η5·23)与03'(δ。168·8)、03(δ。128·5)、04(δ。145.0)和05(δ。123.1);以及Η_6(δ Η 7.76)与〇3'0^168.8);!1-3(5[16.99)与(:-2'0^72.0)的腿8(:相关可证实(:-2'和(:-3'分 别连接在苯环的C-4和C-5上,并形成了一个五元内酯环,从而证实该化合物为苯并已呋喃 内酯类化合物。在化合物的母体骨架确定后,其它取代基团也可通过HMBC相关确认。在HMBC 谱中,可以明显观测到11-70114.19)与(:-10。130.9)以及!1-60117.76)与(:-70。49.3)的 腿8(:相关,证明了丙酮基连接在苯环的(:-1位,而甲基氢%2.518)和(:-1仏130.9)、(:-2 (142.8)和C-3 (δ。128.5)的相关可证实甲基取代在C-2位。最终确定了本发明化合物的 结构,并命名为2-甲基-1-(2-氧代丙基)-异苯并呋喃-5(3Η)_酮。
[0049] 实施例4
[0050] 取实施例2制备的化合物,为白色粉末。测定与实施3相同,确认实施2制备的化合 物为所述苯并内酯类化合物一一5-甲基-6-( 2-氧代丙基)-异苯并呋喃-1 (3Η)-酮。
[0051 ] 实施例5
[0052]取实施例1和2所制备的任一苯并内酯类化合物进行细胞毒活性检测试验,试验情 况如下:
[0053]细胞株:白血病细胞(NB4)、肺癌细胞(A549)、人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)、前列 腺癌细胞(PC3)、乳腺癌细胞(MCF7)均由中国科学院上海药物研究所提供。
[0054]实验设计:以上细胞与不同浓度化合物温育72小时,每株细胞的实验均重复一次, 用两次实验的结果进行数据处理,采用改良MTT法及SRB法评价化合物对细胞增殖的抑制程 度,计算抑制率,根据抑制率采用Log i t方法计算IC5Q,比较化合物的体外抗肿瘤活性。
[0055] 细胞的增殖抑制率=(空白对照0D值-加药孔的0D值)/空白对照0D值X 100%。
[0056] (a)改良 MTT 法
[0057]取处于对数生长期的悬浮细胞,将细胞浓度调整为4 X104/ml,加入96孔培养板, 90μ!7孔。阳性对照为顺铂,用生理盐水溶解。每孔分别加入ΙΟμΙ不同浓度的样品(1号试液-5号试液)。加样组及对照组均设4个复孔,加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加 药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。样品的终浓度分别为1〇-2、1(^、1、 10及 102yg/mL,相应 DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样 品在终浓度102yg/mL时,用0.1 %DMSO作为溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。 阳性对照药顺铂的终浓度为1 0-1、1、1 〇yg/mL。细胞在37 °C,5 % C02培养箱中分别孵育48h后, 加入11'1'(511^/1111,3丨8111&),1(^17孔。继续培养411后,加入三联液[10%303-5%异丁醇- 0.012mol/L HCL(w/V/V)],100yL/孔,放置过夜后用酶标仪在570nm、630nm双波长下测定各 孔的0D值。
[0058] (b)SRB法
[0059] 取处于对数生长期的贴壁细胞株,用25%胰酶常规消化后,再用15%小牛血清完 全RPMI-1640培养基将细胞浓度调整为5X10 4/mL,加入96孔培养板,90yL/孔。细胞在37°C, 5%C02培养箱中分别孵育24h后加入阳性对照、阴性对照以及受试样品(各受试浓度同上 MTT法,10μL7孔),样品的终浓度分别为10-2、10-1、1、10、102yg/mL,相应DMS0的终浓度分别为 0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度10\8/11^时用0.1%0150作为 溶剂对照,其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为ΠΓ1、1、lOyg/ mL,阴性对照为等体积的生理盐水。加样组及对照组均设4复孔,加样组、阳性对照组的高浓 度组还设培养基的加药平行孔,每块板均设有4个空白对照孔(仅加培养基)。将96孔培养板 置于37 °C,5 %⑶2培养箱中孵育(细胞与样品作用)48h后,加入4°C、50 %的TCA(三氯乙酸) 50μ!7孔。加完TCA后,将96孔培养板置于4 °C孵育1小时,取出培养板,轻轻倾去板内液体。用 自来水轻轻冲洗5遍(将自来水由烧杯中轻轻倒入板中,轻晃后再将水倒去),置于空气中风 干至不见水痕。然后加入配制好的0.4%SRB(用1 %乙酸稀释),50μ!7孔,于室温下静置染色 30分钟后倾去SRB溶液,用1%乙酸冲洗4遍,以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风 干至无水痕后,加入10mM未缓冲Tris(缓血氨酸)溶液150μ!7孔(ΡΗ10,用三蒸水配制),将染 料溶解后,于振荡器上振荡5分钟,用酶标仪在570nm波长下读取各孔0D值。
[0060] (C)实验结果
[0061 ] 实验结果(表-2)表明:经对白血病急性早幼粒NB4细胞、肺腺癌A549细胞、人骨髓 神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒活性实验,5-甲基-6-(2-氧代丙基)-异苯并呋喃-1(3H)_酮对呢4^549、3批¥5¥、?03和1〇^7细胞株具有 较好的细胞毒活性,IC5Q值分别达0.28、0.16、0.34、0.30和0.12μΜ。
[0062] 表2 5-甲基-6-(2-氧代丙基)_异苯并呋喃-1(3Η)_酮的细胞毒活性
[0063]
【主权项】
1·-种苯并内酯类化吞物!甘牲紅龙丰目右H姑始命名为:2_甲基-1-(2-氧代丙基)-异苯并呋喃-5(3Η)_酮,其分子式为C12H12〇 3。2. -种根据权利要求1所述苯并内酯类化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步 骤,具体为: A、 浸膏提取:将烟叶粉碎到20~40目,用有机溶剂超声提取2~5次,每次30~60分钟, 合并提取液、过滤,减压浓缩提取液,静置,滤除沉淀物,浓缩成浸膏a; B、 有机溶剂萃取:在浸膏a中加入重量比1~2倍量的水,然后用与水等体积的有机溶剂 萃取3~5次,合并有机溶剂萃取相,减压浓缩成浸膏b; C、 MCI脱色:在浸膏b加入重量比3~5倍量的甲醇水溶解,上MCI柱,用90 % -95 %甲醇水 洗脱,合并有机相,减压浓缩成浸膏c; D、 硅胶柱层析:浸膏c上硅胶柱层析,装柱硅胶为160~200目,用量为浸膏c重量6~10 倍量;以体积配比为1:0~0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱,收集梯度洗脱液、浓 缩,经TLC监测,合并相同的部分; E、 高效液相色谱分离:将6:4的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液,经高效液相色谱分离纯 化,即得所述的苯并内酯类化合物。3. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述A步骤的有机溶剂为70~100%的 丙酮、90~100%的乙醇或90~100%的甲醇水溶液。4. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯 仿、乙酸乙酯乙醚或石油醚一种或几种的混合物。5. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述D步骤中所述浸膏c在经硅胶柱层 析前,用重量比1.5~3倍量的丙酮或者甲醇溶解,然后用浸膏重量0.8~1.2倍的80~100目 硅胶拌样。6. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述D步骤的氯仿和丙酮混合有机溶 剂的体积配比为20:1,9:1,8 :2,7:3,6:4和1:1。7. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述E步骤的高效液相色谱分离纯化 是以25_40wt%的甲醇水溶液为流动相,流速15~20ml/min,以21.2 X 250mm,5ym的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相,紫外检测器检测波长为308nm,每次进样10~100yL,收集 20~40min的色谱峰,多次累加后蒸干。8. 根据权利要求1所述的苯并内酯类化合物在制备抗癌药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106008422SQ201610479107
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】叶灵, 李超, 秦云华, 张承明, 熊文, 范多青, 芮晓东, 申钦鹏, 杨光宇, 缪明明
【申请人】云南中烟工业有限责任公司
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