一种苯丙素类化合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种苯丙素类化合物及其制备方法和应用，所述苯丙素类化合物是从黑紫獐牙菜（Swertia atroviolacea）中分离得到，化合物命名为3?羟基?1?(6?羟甲基?1,3?二氢异苯并呋喃?5?基)丙烷?1?酮，其分子式为C12H14O4，具有下述结构式：（1）所述苯丙素类化合物的制备方法，是以黑紫獐牙菜为原料，经浸膏提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到。所述苯丙素类化合物经5α-还原酶活性测试，对5α-还原酶具有较好的抑制作用。本发明还公开了上述化合物的制备方法和用途。本发明化合物结构简单，且具有较好的5α-还原酶抑制作用，可作为制备5α-还原酶抑制剂的先导化合物。
【专利说明】
一种苯丙素类化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从黑紫獐牙菜中首次提取得到的苯 丙素类化合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猜牙菜属（5Veriia)是龙胆科下的一个属，全球约170种，我国有80余种，主要分布 于云南、四川等地。在我国该属植物入药历史悠久，药用有35种，具有清热利胆、除湿解毒等 功效，常用于治疗急性黄疽型肝炎、骨髓炎等疾病。该属植物的化学成分丰富，主要有口山 酮、黄酮、环稀醚砲、三砲和生物碱等化合物。黑紫猜牙菜（5Veriia a irorioiacea)为猜牙 菜属多年生草本植物，生于海拔3400~4575 m的山坡草地、多石山顶或岩石缝中，是云南省 迪庆藏族地区特有品种。
[0003] 苯丙素（phenylpropanoid)是天然存在的一类苯环与三个直链碳连接(C6-C3基 团）构成的化合物。苯丙素类化合物如香豆素、木脂素等，广泛存在于植物中，已在很多领域 如医药、食品、化妆品等成为重要的原料，其中许多化合物具有各种生物活性，在医药、生物 等领域有广阔的应用前景。本发明从黑紫獐牙菜中分离得到了一种具有5 σ-还原酶抑制活 性的苯丙素类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。
[0004] 类固醇5 〇 -还原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白，依赖还原辅酶Π (NADPH) 作为供氢体，催化还原一系列类固醇底物如睾酮、17 σ-羟基黄体酮、雄烯二酮等。在催化还 原雄激素睾酮(Τ)转变为活性更强的雄激素双氢睾丸激素(DHT)的过程中，5 σ-还原酶起着 关键作用。Τ及其还原代谢物DHT是维持男性显性特征和性成熟的本质男性激素，占男性体 内激素80%左右，其中DHT被认为是体内作用最强的雄激素。如果体内DHT含量过高，将会导 致引发性激素效应的相关内分泌失调，引发多种疾病，如良性前列腺增生、痤疮、男性秃发 和女性多毛症等。Τ与5 还原酶和它的辅酶NADPH形成的复合物结合，如果有某种抑制剂 存在，由于抑制剂的结构和Τ类似，抑制剂同样也可以与复合物结合，这样抑制剂就与Τ相互 竞争与复合物结合，从而减少了 Τ向DHT的转化，因而降低了体内DHT的含量，缓解了体内由 于DHT含量过高引起的各种疾病。通过分离得到了一种具有5 σ-还原酶抑制活性的苯丙素 类化合物，该化合物相关的5 σ -还原酶抑制活性也未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种新的苯丙素类化合物;第二目的在于提供所述苯丙素 类化合物的制备方法;第三目的在于提供所述苯丙素类化合物在制备5 &还原酶抑制剂中 的应用。
[0006] 本发明的第一目的是这样实现的，所述的苯丙素类化合物是从干燥的黑紫獐牙菜 (5^61^3 3(1'0^'〇23。63)全草中分离得到，命名为3-羟基-1-(6-轻甲基-1，3-二氢异苯并 口夫喃 _5_基）丙烷_1_酉同，英文名为：3_hydroxy_l_(6_hyd;roxymethyl_l，3_ dihydroisobenzofuran-5-y 1 )propan-l_one，其分子式为 C12H14O4，具有下述结构式：
该化合物为浅黄色胶状物。
[0007] 本发明的第二目的是这样实现的，所述的苯丙素类化合物的制备方法，是以干燥 的黑紫獐牙菜全草为原料，经浸膏提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为： A、 浸膏提取：将黑紫獐牙菜的全草粉碎，用95%乙醇室温下提取3~5次，每次3天，合并 提取液、过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a; B、 MCI脱色:浸膏a用MCI柱脱色，用80%-95%甲醇/水洗脱，合并有机相，减压浓缩成浸膏 b； C、 硅胶柱层析:浸膏b用重量比8~10倍量的100~200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析； 以体积配比为1:0、9 :1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度 洗脱液、浓缩，合并相同的部分； D、 高压液相色谱分离:C步骤洗脱液的8:2部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得 14~18 min色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化，即得所述的苯丙素类化 合物。
[0008] 以上述方法制备的苯丙素类化合物的结构通过以下方法鉴定出来的： 本发明化合物为浅黄色胶状物;紫外光谱（溶剂为甲醇），Amax (log ε) 275 (3.74)、 232 (3·86)、210 (4.05) nm;红外光谱（溴化钾压片）vmax 3387、3086、2946、1658、1610、 1574、1456、1348、1267、1164、1038、876 cm-S高分辨质谱（HRES頂S)给出准分子离子峰m/ 2 245.0783 []\?^]+(计算值245.0790)。结合1!1和13〇匪1?谱给出一个分子式(： 12!114〇4，不 饱和度为6。红外光谱数据证实化合物中存在羟基(3387 cnf1)和芳环（1610、1574、1456 cm +1)功能团。从1Η和13C NMR谱(数据归属见表-1)信号可以看出化合物的12个碳包括五个亚甲 基(C-8、C-9、C-1、C-2、C-3 )、两个烯碳次甲基(C-3、C-6)以及五个季碳(包括一个羰基C-7和四个烯碳C-l、C-2、C-4、C-5 )，这些信号表明化合物为苯丙素类化合物。根据H-1和C-1、 C-2、C-3的HMBC相关（图3)可证实羟甲基取代在苯环的C-2位;H-8和C-l、C-7、C-9的HMBC相 关显示丙基取代在苯环的C-1位;根据不饱和度计算发现，化合物中还有另外一个环存在， HMBC谱中，H-3 和C-2、04、05、06的相关以及!1-2和(：-3、(：-3、(：-4、(：-5的相关证实(：-2 、C-3、C-4、C-5形成一个呋喃环;根据H-6、H-8、H-9与羰基有HMBC相关，可证实羰基位于C-7位，至此本化合物的结构得以确定。
[0009] 表-1.化合物的1H NMR和13C NMR数据（溶剂为CDC13)
本发明的第三目的是这样实现的，所述的苯丙素类化合物在制备5 σ-还原酶抑制剂中 的应用。
[0010] 本发明化合物是首次从黑紫獐牙菜中分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法 确定为苯丙素类化合物，并表征了其具体结构。该化合物经活性测试，结果表明，其对5 σ -还原酶抑制率为45.6±2.85%，显示该化合物具有一定的5 σ-还原酶抑制活性。本发明化合 物结构简单活性较好，可作为5 σ-还原酶抑制剂的先导性化合物，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明苯丙素类化合物的核磁共振氢谱； 图2为本发明苯丙素类化合物的核磁共振碳谱； 图3为本发明苯丙素类化合物的主要HMBC相关图示。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明 加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0013] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
[0014] 本发明所述的苯丙素类化合物，是从干燥的黑紫猜牙菜（5Veriia aircmWacea) 全草中分离得到，其分子式为C12H14O4，具有下述结构式：
该化合物为浅黄色胶状物，命名为3-羟基-1-(6-羟甲基-1，3-二氢异苯并呋喃-5-基） 丙烷_1_酮，英文名为：3-hydroxy-1-(6-hydroxymethyl-l，3-dihydroisobenzofuran-5-y1) propan-1-one 〇
[0015] 本发明所述的苯丙素类化合物的制备方法，是以干燥的黑紫獐牙菜全草为原料， 经浸膏提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为： A、 浸膏提取：将黑紫獐牙菜的全草粉碎，用95%乙醇室温下提取3~5次，每次3天，合并 提取液、过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a; B、 MCI脱色:浸膏a用MCI柱脱色，用80%-95%甲醇/水洗脱，合并有机相，减压浓缩成浸膏 b； C、 硅胶柱层析:浸膏b用重量比8~10倍量的100~200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析； 以体积配比为1:0、9 :1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度 洗脱液、浓缩，合并相同的部分； D、 高压液相色谱分离:C步骤洗脱液的8:2部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得 14~18 min色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化，即得所述的苯丙素类化 合物。
[0016]所述C步骤的浸膏b在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的氯仿/甲醇混合溶 剂溶解，然后用浸膏重1~1.5倍的80~100目硅胶拌样。
[0017]所述〇步骤的反相(318中压液相色谱分离纯化是以21.2 111111\25〇1]1111、5以1]1的〇18 色谱柱为固定相，以45%的乙腈为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为210~ 230 nm，每次进样2 mL，收集14~18 min的色谱峰。
[0018] 所述D步骤的14~18 min色谱峰对应的洗脱液在经高压液相色谱分离纯化前，脱除 溶剂后用甲醇溶解。
[0019] 所述D步骤的高压液相色谱分离纯化是以40%的乙腈为流动相，流速3 mL/min，9.4 mm X 250 mm、5 μπι的Ci8色谱柱为固定相，紫外检测器检测波长为210~280 nm，每次进样50 yL，收集15.2 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
[0020] 本发明的应用为所述的苯丙素类化合物在制备5 σ-还原酶抑制剂中的应用。
[0021] 本发明所述的黑紫獐牙菜不受地区限制，均可以实现本发明，下面以采自云南省 迪庆地区的黑紫獐牙菜为原料，对本发明做进一步说明： 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按 照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产 品。本发明中的溶液如果只给出了溶质，没有公开溶剂，则本领域技术人员应该知晓溶剂为 水。本发明中纯氯仿指100%氯仿，纯丙酮是指100%丙酮，纯甲醇指100%甲醇。
[0022] 实施例1 以采自云南省迪庆地区的黑紫獐牙菜为原料。将黑紫獐牙菜全草取样2.5 kg粉碎，以 95%的乙醇室温下提取4次，每次提取3天，提取液每次3.5 L，提取液合并，过滤，减压浓缩成 浸膏，得浸膏86 g。浸膏用MCI柱脱色，用90%甲醇/水洗脱，脱色后的浸膏用55 g氯仿/甲醇 混合溶剂溶解，然后加入80目硅胶52 g拌样。拌样后，用100~200目硅胶1 kg干法装柱；用体 积比依次为1:0、9:1、8: 2、7: 3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗 脱液、浓缩，合并相同的部分，其中体积为8:2部分1 g;8:2部分洗脱液通入反相C18中压液相 色谱，该中压液相色谱采用21.2 mm X 250 mm、5 μπι的C18色谱柱，流动相流速为20 mL/ min，流动相为45%的乙腈。紫外检测器为双波长检测器，检测波长为210、230 nm，每次进样2 mL，收集14~18 min色谱峰所对应的洗脱液，洗脱液脱除溶剂后用甲醇溶解，溶解液再通入 高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用9.4 _ X 250 _、5 μπι的Cis色谱柱，流 动相流速为3 mL/min，流动相为40%的乙腈，紫外检测器检测波长为210、254、280 nm，每次 进样50 yL，收集色谱峰保留时间为15.2 min时所对应的洗脱液，多次累加后蒸干，即得所 述苯丙素类化合物。
[0023] 实施例2 以采自云南省迪庆地区的黑紫獐牙菜为原料。将黑紫獐牙菜全草取样2.5 kg粉碎，以 95%的乙醇室温下提取4次，每次提取3天，提取液每次3.5 L，提取液合并，过滤，减压浓缩成 浸膏，得浸膏86 g。浸膏用MCI柱脱色，用90%甲醇/水洗脱，脱色后的浸膏用55 g氯仿/甲醇 混合溶剂溶解，然后加入80目硅胶52 g拌样。拌样后，用100~200目硅胶1 kg干法装柱；用体 积比依次为1:0、9:1、8: 2、7: 3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗 脱液、浓缩，合并相同的部分，其中体积为8:2部分1 g;8:2部分洗脱液通入反相C18中压液相 色谱，该中压液相色谱采用21.2 mm X 250 mm、5 μπι的C18色谱柱，流动相流速为20 mL/ min，流动相为45%的乙腈。紫外检测器为双波长检测器，检测波长为210、230 nm，每次进样2 mL，收集14~18 min色谱峰所对应的洗脱液，洗脱液脱除溶剂后用甲醇溶解，溶解液再通入 高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用9.4 _ X 250 _、5 μπι的Cis色谱柱，流 动相流速为3 mL/min，流动相为40%的乙腈，紫外检测器检测波长为210、254、280 nm，每次 进样50 yL，收集色谱峰保留时间为15.2 min时所对应的洗脱液，多次累加后蒸干，即得所 述苯丙素类化合物。
[0024] 实施例3 取实施例1制备的化合物，为浅黄色胶状物； 测定方法为:用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
[0025] (1)紫外光谱（溶剂为甲醇），Amax (log ε) 275 (3.74)、232 (3.86)、210 (4.05) nm； (2) 红外光谱（溴化钾压片）vmax 3387、3086、2946、1658、1610、1574、1456、1348、 1267、1164、1038、876 cm-^ (3) 高分辨质谱（HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 245.0783 [M+Na]+ (计算值 245.0790)。结合1Η和13 C NMR谱给出一个分子式，不饱和度为6。红外光谱数据证实 化合物中存在羟基(3387 cm-4和芳环（1610、1574、1456 cm-4功能团。从1Η和13C NMR谱(数 据归属见表-1)信号可以看出化合物的12个碳包括五个亚甲基（C-8、C-9、C-1、C-2、C-3 )、两个烯碳次甲基(C-3、C-6 )以及五个季碳(包括一个羰基C-7和四个烯碳C-l、C-2、C-4、 C-5)，这些信号表明化合物为苯丙素类化合物。根据H-1和C-l、C-2、C-3的HMBC相关（图3) 可证实羟甲基取代在苯环的C-2位;H-8和C-l、C-7、C-9的HMBC相关显示丙基取代在苯环的 C-1位;根据不饱和度计算发现，化合物中还有另外一个环存在，HMBC谱中，H-3和(：-2工- 4、C-5、C-6的相关以及H-2 和C-3、03、(：-4、(：-5的相关证实(：-2、(：-3、(：-4、(：-5形成一个 呋喃环;根据H-6、H-8、H-9与羰基有HMBC相关，可证实羰基位于C-7位，至此本化合物的结构 得以确定。
[0026] 表-1.化合物的1H NMR和13C NMR数据（溶剂为CDC13)_ 买施例4
取实施例1中制备的苯丙素类化合物进行5 σ-还原酶抑制活性测试，测试情况如下： 活性测试采用分散液液微萃取-气质连用的方法进行测试，具体操作为:将50 前列 腺微粒体蛋白，500 /3M睾酮(T)，l 二硫苏糖醇(DTT)，25 DMS0溶于40 磷酸钠缓 冲溶液（pH 6.5)配置成反应液，并定溶至0.5 ml，反应液中加入250 还原辅酶Π (NADPH)开始酶促反应，并在37°C振动水浴中培养60分钟。之后在冰浴中向反应液加入500 M MeCN停止酶促反应。制备的苯丙素类化合物、睾酮和二氢睾酮用分散液液微萃取的方式 进行萃取。反应液继续加入50 Μ内标物T-d3(175 nM)和DHT-13C3(175 nM)以及50辺三氯 乙烯，并转移至装有3 ml水的锥形管中。封闭锥形管，手动震荡后，以5000 X g离心3分钟， 离心完成后，将包含制备的苯丙素类化合物在内的30 Μ下层物质转移到新的小瓶中，使用 温和的氮流在室温下干燥。干燥完成后加入30 /d MSTFA+NH4l+DTE(500:4:2 vol/wt/wt) 在家用微波(600 w)下反应5分钟使化合物进行甲硅烷基化反应。反应完成后，抽取1 #1反 应物进行GC/MS分析。T/ T-d3与DHT/ DHT-13C3之间的比值可以对睾酮和经过5 σ-还原酶反 应生成的二氢睾酮进行量化，通过对比酶促反应后生成的二氢睾酮的量来确定被测化合物 的5 σ-还原酶抑制活性。
[0027]使用finasteride为测试制备的苯丙素类化合物5 σ-还原酶抑制活性的阳性对 照，将finasteride溶于DMS0,并用40 ?Μ磷酸钠缓冲溶液(pH 6.5)进行稀释，抽取1 的 稀释液进行酶促反应。为确定finasteride对5α-还原酶抑制活性的IC5Q值，采用不同浓度的 finasteride (0.01~1 /Μ)进行测试，每个浓度均平行测定3次。
[0028]通过以上测试方法，确定制备的苯丙素类化合物的5 σ-还原酶抑制率为45.6土 2.85%，显示化合物具有一定的5 σ -还原酶抑制活性。
【主权项】
1. 一种苯丙素类化合物，其特征在于所述苯丙素类化合物是从干燥的黑紫獐牙菜 (5Veriia a ircmWacea)全草中分离得到，命名为3-羟基-1-(6-轻甲基-1，3-二氢异苯并 口夫喃 _5_基）丙烷_1_酉同，英文名为：3_hydroxy_l_(6_hyd;roxymethyl_l，3_ dihydroisobenzofuran-5-y I )propan-l_one，其分子式为 C12H14O4，具有下述结构式：2. -种权利要求1所述苯丙素类化合物的制备方法，其特征在于以干燥的黑紫獐牙菜 全草为原料，经浸膏提取、MCI脱色、硅胶柱层析、高压液相色谱步骤，具体为： A、 浸膏提取：将黑紫獐牙菜的全草粉碎，用95%乙醇室温下提取3~5次，每次3天，合并 提取液、过滤，减压浓缩提取液，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a; B、 MCI脱色:浸膏a用MCI柱脱色，用80%-95%甲醇/水洗脱，合并有机相，减压浓缩成浸膏 b； C、 硅胶柱层析:浸膏b用重量比8~10倍量的100~200目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析； 以体积配比为1:0、9 :1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液进行梯度洗脱，收集梯度 洗脱液、浓缩，合并相同的部分； D、 高压液相色谱分离:C步骤洗脱液的8:2部分经反相C18中压液相色谱分离纯化，所得 14~18 min色谱峰对应的洗脱液，进一步经高压液相色谱分离纯化，即得所述的苯丙素类化 合物。3. 根据权利要求2所述的苯丙素类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤的浸膏b 在经硅胶柱层析前，用重量比1.5~3倍量的氯仿/甲醇混合溶剂溶解，然后用浸膏重1~1.5 倍的80~100目硅胶拌样。4. 根据权利要求2所述的苯丙素类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤的反相C18 中压液相色谱分离纯化是以21.2 mm X 250 mm、5 μπι的C18色谱柱为固定相，以45%的乙腈 为流动相，流速为20 mL/min，紫外检测器检测波长为210~230 nm，每次进样2 mL，收集14~ 18 min的色谱峰。5. 根据权利要求2所述的苯丙素类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤的14~18 min色谱峰对应的洗脱液在经高压液相色谱分离纯化前，脱除溶剂后用甲醇溶解。6. 根据权利要求2所述的苯丙素类化合物的制备方法，其特征在于所述D步骤的高压液 相色谱分离纯化是以40%的乙腈为流动相，流速3 mL/min，9.4 mm X 250 mm、5 μπι的Cis色 谱柱为固定相，紫外检测器检测波长为210~280 nm，每次进样50 yL，收集15.2 min的色谱 峰，多次累加后蒸干。7. -种权利要求1所述的苯丙素类化合物在制备5 σ -还原酶抑制剂中的应用。
【文档编号】A61P17/10GK106008423SQ201610467667
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】吴海燕, 李干鹏, 周敏, 蒋薇, 左马怡, 杨青松, 胡秋芬
【申请人】云南民族大学