去甲斑蝥素复合盐衍生物及其抗肿瘤应用
【专利摘要】本发明提供了一种去甲斑蝥素复合盐衍生物，其结构式如式11所示，其中，M及M1各自独立的选自正一价或正二价阳离子，且M及M1不同时为正二价阳离子。活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素复合盐衍生物11对于肝癌及结肠癌两种具有良好的抑制活性，可望应用于制备上述两种抗肿瘤药物。
【专利说明】
去甲斑蝥素复合盐衍生物及其抗肿瘤应用
技术领域
[0001] 本发明属于新药设计与合成领域，具体涉及一类新型去甲斑蝥素复合盐衍生物及 其抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 斑蝥，也写作斑蟊，俗称班苗、西班牙苍蝇等，在我国现存最早的中药学专著《本草 纲目》、《神农本草经》等中都曾有记载。斑蝥是芫菁科昆虫南方大斑蟊或黄黑小斑蟊的干燥 体，属鞘翅目芫菁科昆虫，是我国最早发现的具有抗癌作用的药材之一。斑蝥性辛，热，具有 很强的肾毒性，同时具有破血逐瘀、去除淤积，消肿以及攻毒蚀疮的功效，临床常用于恶疮， 顽癣，狂犬病及癌症肿痛等的治疗。
[0003] 而后的研究表明，斑蝥的体内含有一种倍半萜类衍生物，称之为斑蝥素 (cantharidin，Ci〇Hi2〇4)，具有较高的抗癌活性，具有非常高的药用价值。斑蜜素为无色结 晶，不溶于冷水，微溶于热水，溶于丙酮和氯仿。斑蝥素主要存在于多种昆虫中，能使人体皮 肤起疱，斑蝥素及其衍生物抗肿瘤的机制主要是抑制蛋白质与酸的合成，增强机体对肿瘤 细胞的杀伤力而达到治疗目的。斑蝥素及其类似物对肝癌，卵巢癌，食道癌等有良好的疗 效，它是通过改变蛋白质的活性，抗肿瘤侵袭转移，引起细胞周期阻滞，抑制肿瘤生长，从而 使得其死亡。其抗肿瘤的机制为通过减少癌细胞对氨基酸的摄取，抑制蛋白质的合成，刺激 淋巴细胞、巨噬细胞、多形核细胞产生白细胞介素，从而提高机体免疫力，同时杀伤肿瘤细 胞而达到治疗目的，与其他的抗肿瘤药物相比，斑蝥素及其衍生物有许多优点:其在抑制肿 瘤的同时，不仅没有免疫抑制的副作用，还能提升机体白细胞等。
[0004] 但斑蝥素对泌尿系统和肠胃系统有较大的毒副作用，斑蝥素既是抗肿瘤的活性成 分，同时也是毒性的主要成分。对其进行恰当的结构修饰，会在保留其抗肿瘤活性的基础 上，大大减低对机体的毒副作用，以去甲斑蝥素衍生物的合成为例。去甲斑蝥素不但保留了 其较强的抗肿瘤活性和升高白细胞的作用，还消除了其对泌尿系统的副作用，后来，以去甲 斑蝥素为先导化合物进行结构改造成为了研究的热点。这种优势在抗肿瘤药物中还是少见 的，所以引起了广泛的关注，陆续合成了许多减少其毒副作用但同时又保留其活性的同类 药物，开发更新高效低毒的衍生物是一个很好的研究方向。
[0005] 对斑蝥素进行结构修饰后用于治疗癌症的衍生物近年来陆续的出现，并开始运用 于临床治疗。如去甲斑蝥素，它比斑蝥素少了两个甲基，其毒性明显减低，而治疗作用却优 于斑蟊素。
[0006] 目前，斑蝥素和去甲斑蝥素都已经应用在临床中，这两个药物都各具有临床特点， 但不足之处是:这两个药物的水溶性都较差，生物利用度不高。从化学结构中看出，斑蝥素 和去甲斑蝥素的结构中均包含了分子内酸酐结构。而斑蝥酸即斑蝥素化合物的酸酐水解后 得到的二元羧酸化合物;斑蝥酸还未被开发成为药物，仅仅是报道了其结构式。
[0007]
[0008] 此外，临床上还研究了斑蝥素钠，去甲斑蝥素钠，甲基斑蝥胺等，这些结构改造均 将斑蝥素及去甲斑蝥素的内酸酐环打开，以开环方式存在，从化学结构上看;对应的开环化 合物其相应的溶解度较大，其体内生物利用度也高。对斑蝥素的结构进行修饰，寻找高效低 毒的斑蝥素抗肿瘤药物，具有重要的工业应用价值和广泛的市场前景。申请号为 21^201410163619.4、21^201410163711.0、21^01410163705.5的中国专利公开了制备去甲基 斑蝥素酸盐的方法，迄今，尚未有报道设计并合成开环的去甲斑蝥素复合盐衍生物结构及 合成方法。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型去甲斑蝥素复合盐衍生 物、其合成方法及其抗肿瘤应用。
[0010] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0011] -方面，本发明提供了一种新型的去甲斑蝥素复合盐衍生物，其结构式如式11所 示，
[0012] ?
[0013] 其中，Μ及Ml各自独立的选自正一价或正二价阳离子，且Μ及Ml不同时为正二价阳 离子。本发明的常规技术人员清楚，在羧酸与金属氢氧化物Μ0Η(此处Μ0Η的Μ泛指金属氢氧 化物中的金属阳离子）的酸碱成盐反应，得到相应羧酸盐，在该羧酸盐的结构中，羧酸酸根 离子与金属阳离子的正负电荷需要配平。因此，非常清楚，当Μ为正一价阳离子及正二价阳 离子时，金属氢氧化物的结构分别为Μ0Η或Μ(0Η)2,而当Μ为正一价阳离子及正二价阳离子 时，在本发明的式11所示的去甲斑蝥素复合盐衍生物结构中，所述去甲斑蝥素复合盐衍生 物具有以下的相应的结构：
[0014]
[0015] 优选的，结构式如式11所示的去甲斑蝥素复合盐衍生物，阳离子Μ及Ml各自独立的 选自钠 Na、钾K、镁Mg或钡Ba离子，且Μ及Ml不同时为正二价阳离子。
[0016]为了使得表述简洁，在本文中，包括结构式、合成路线或合成方法等描述中，本发 明制备得到的复合盐的结构通式简洁地表述为上述结构式11，并不从表达形式上去考虑配 平正负离子电荷。而本领域的常规技术人员也能够理解酸碱反应得到相应盐，其酸根阴离 子和阳离子的正负电荷是配平的。
[0017]更优选的，结构式如式11所示的去甲斑蝥素复合盐衍生物，包括但不限于，以下结 构式：
[0018]
[0019] 另一方面，本发明提供了如上所述的去甲斑蝥素复合盐衍生物11的合成方法，包 括以下步骤：1)、5_烯去甲斑蝥素1(化合物1)与甲醇在三乙胺存在下反应得到5-烯去甲斑 蝥素单酸甲酯8(化合物8)，2)、化合物8与第一金属氢氧化物Μ0Η在甲醇成盐得到5-烯去甲 斑蝥素甲酯盐9(化合物9)，3)、化合物9与第二金属氢氧化物M10H水溶液反应得到5-烯去甲 斑蝥素复合盐1〇(化合物10)化合物10在有机溶剂中在催化剂存在下加氢还原得到去甲斑 蝥素复合盐11;合成路线1为：
[0020]
[0021 ] 上述合成方法中，所述步骤4)的催化剂选自？(1/(：，？(1(0!〇2/(3，？1:/(：或1^1167附等 氢化催化剂;所述步骤1)的催化剂优选Pd/c或Pd(0H)2/C。
[0022] 在上述合成方法中，各步骤采用的有机溶剂可根据化学反应类型进行适当选取， 而反应温度可根据化学反应类型、以及采用的有机溶剂进行适当选取。反应时间可通过层 析法例如薄层色谱或高效液相色谱法监控反应得到。
[0023] 活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素复合盐衍生物11对肝癌及结 肠癌两种肿瘤细胞具有良好的抑制活性。因此，本发明的第三方面提供了去甲斑蝥素复合 盐衍生物11用于制备抗肝癌及结肠癌两种肿瘤的药物中的用途。
[0024] 术语
[0025] 本文中的缩写具有以下含义:小时缩写为h，分钟缩写为min;四氢呋喃缩写为THF， 求，N，N-二甲基甲酰胺缩写为DMF、二甲基亚砜缩写为DMS0。
【具体实施方式】
[0026] 以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。 在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪 器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
[0027] 本发明中使用的呋喃，顺丁烯二酸酐，呋喃，四氢呋喃，二氯甲烷等反应试剂及有 机溶剂均来自上海国药集团。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。
[0028] 实施本发明上述合成路线中的各步骤反应，可以用色谱法、液质连用谱来监控反 应进程。色谱法中，可适用薄层色谱TLC还可用气相色谱法或液相色谱法如HPLC代替等。 [0029]实施例1.5-烯去甲斑蝥素1的制备
[0030]
[0031]从试剂瓶中取出一定量的顺丁烯二酸酐，置于干燥的研体中研细，再用电子天平 称取研细的顺丁烯二酸酐12.021g，置于干燥的三口烧瓶中，塞上塞子，再加乙醚搅拌，在乙 醚量为90mL时顺丁烯二酸酐完全溶解。待顺丁烯二酸酐完全溶解后，用滴液漏斗缓慢加入 13mL呋喃，用时13min。控制温度在38 °C开始反应。反应lh后溶液出现白色固体，且时间越长 白色固体越多。反应至24h后抽滤，得白色固体的化合物1，即5-烯去甲斑蝥素。干燥称重为 17.46g，收率85.8%。熔点：122~123°C，比移值Rf :0.52(展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3:
[0032] 实施例2.5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯的合成：
[0033]
[0034]称取5-烯去甲斑蝥素4.15g于烧瓶中，加25ml甲醇使其溶解，形成悬浮液，向悬浮 液中逐滴加入0.73ml三乙胺，25°C下搅拌24h，反应结束后，旋蒸除去甲醇，将得到的剩余物 质溶解于25ml二氯甲烷中，用1当量7ml盐酸萃取一次，留下有机相，用10ml饱和食盐水萃取 一次，留下有机相，加入适量无水硫酸镁干燥15-30min，抽滤，滤饼用二氯甲烷冲洗2-3次， 留下滤液，将滤液悬蒸，干燥，即得5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯（54.5%)，白色固体2.70g。 ^NMRCDMSO-de) ：5：6.44(q,J = 8Hz,2H) ,5.06(s,2H) ,3.67(d,J = 24Hz,2H) ,3.46(d,J = 48Hz,2H),2.71(s,2H)〇13CNMR(DMS0-d6)：5：173.03a72.48a37.10a36.98,80.39,80.06, 51.87,46.33,39.48。
[0035]实施例3.5-烯去甲斑蝥素甲酯钠盐的合成：
[0036]
[0037] 称取5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯500mg于烧瓶中，加25ml甲醇使其溶解，加入氢氧化 钠105mg，25°C下搅拌反应，反应结束后，旋蒸，以甲醇为洗脱液过硅胶柱，点板，收集显色样 品旋蒸，干燥，即得5-烯去甲斑蝥素甲酯钠盐(89.6 % )，白色固体512.5mg。): δ : 6.12(s，2H),5.00(s，2H),4.65(s，3H),2.65(s，2H)</3C 匪 R(D20):δ:177.84,170.95， 136·10，134·05,80·41，47·64。
[0038] 同理，合成了以下产物：
[0039] 5-烯去甲斑蝥素甲酯镁盐（94.4%)，白色固体。咕匪1?(〇)(：13)3 :6.40((1(1，了 = 5.2Hz,5.2Hz,2H) ,5.03(d,J=12Hz,2H) ,3.51(s,3H) ,2.63(d,J=13Hz,2H) ,13CNMR (ΟΧη3):δ:173·12，172·58，137·13，136·96,80·46,80·07,51·87,47·14,46·36·
[0040] 5-烯去甲斑蝥素甲酯钡盐(83.9%)，白色固体。1HNMR(CDCl 3)J:6.35(d，J = 48Hz， 2H)，5.29(s，2H)，3.67(s，3H)，2.65(d，J = 8Hz，2H) .13C匪R(CDC13) :δ:179，12，179·02， 177·28，177·21，137·40，134·59,82·21，81·08,52·91，49·93,46·21·
[0041 ]实施例4.5-烯去甲斑蝥素钾镁盐的合成：
[0042]
[0043]取5-烯去甲斑蝥素甲酯镁盐500mg于烧瓶中，加 5ml水使其溶解，按比例加入氢氧 化钾136.22mg，25°C下搅拌，反应结束后旋蒸除去溶剂，剩余物先以甲醇为洗脱液过硅胶柱 除去原料，再用甲醇:水= 1:1洗脱产品，即得5-烯去甲斑蝥素钾镁盐白色固体213mg，收率 38% </HNMR(D2〇): δ :6.29-6 ·35(ι?，2H)，5.01 (d，16Hz，2H)，2.66(dd，J = 12Hz，8Hz，2H) ? 13C 匪 R(D20):δ:178.26,175.66,136.84,135.98,135.57,134.48,80.75,79.77,52.26， 48.95,47.88,46.19.
[0044] 同理，合成了以下产物：
[0045] 以5-烯去甲斑蝥素甲酯钠盐为原料，合成5-烯去甲斑蝥素钠钾盐（34.3%)，白色 固体。
[0046] 1HNMR(D2〇)：5：6.32(s,2H),4.97(s,2H),2.61(s,2H).
[0047] 以5-烯去甲斑蝥素甲酯镁盐为原料，合成5-烯去甲斑蝥素钠镁盐（37.7%)，白色 固体。
[0048] 1HNMR(D2〇)：5：6.29(ddJ=12Hz,8Hz,2H),4.98(ddJ=12Hz,8Hz,2H),2.63(ddJ = 8Hz，4Hz，2H).13CNMR(D2〇)J:180.81，178.86，175.96，136.94，135.42，135.21，133.28， 81 · 43，80·86，79·72，52·21，49·42，48·41，46·10·
[0049] 以5-烯去甲斑蝥素甲酯钡盐为原料，合成5-烯去甲斑蝥素钾钡盐（26.8%)，白色 固体。
[0050] 以5-烯去甲斑蝥素甲酯钡盐为原料，合成5-烯去甲斑蝥素钠钡盐(47%)，白色固 体。
[0051] 实施例5.去甲斑蝥素钾镁盐的合成：
[0052]
[0053]取5-烯去甲斑蝥素钾镁盐213mg于施兰克瓶中，加5ml水使其溶解，按比例加入钯 碳21.3mg，真空除去烧瓶中空气后通入氢气，25°C下搅拌使其反应，用磷钼酸监测，产物不 显色，反应结束后抽滤除去钯碳，所得滤液旋蒸，干燥，即得去甲斑蝥素钾镁盐(97.4%)，白 色固体210mg，R f = 0.45(甲醇：冰乙酸= 1:5)，Mp:250°C .^^^(020)3:4.75(8,2?，2· 91 (s，2H)，1.69(d，J = 8Hz，2H)，1.53(d，J = 8Hz，2H)</3C匪R(D2〇):S: 180.57,80.56,55.04， 2754<JR(KBr):v(cm-l) :3406，1596，1413，1318，1145,989,920,811，722。
[0054] 同理，合成了以下产物：
[0055] 以5-烯去甲斑蝥素钠钾盐为原料，合成去甲斑蝥素钠钾盐(98.4%)，白色固体，Rf = 0.63(甲醇：冰乙酸= 1:5) ,1^:2501^4^^(020)3:4.70(8,210,2.85(8,210,1.63(8, 2H)a.51(d,J = 4Hz,2H)〇13CNMR(D2〇)：5：180.18,79.44,55.12,8.22〇IR(KBr)：v(cm-l)： 3431，1596，1411，1315，1145，990,932,806,569。
[0056] 以5-烯去甲斑蝥素钠镁盐为原料，合成去甲斑蝥素钠镁盐(79.3%)，白色固体，Rf = 0.74(甲醇：冰乙酸= 1:5) ,1^:2501:.4^^(020)3:4.72(8,210,2.87(8,210,1.65(8, 2H)a.51(dJ = 8Hz,2H)〇13CNMR(D2〇)：5：180.78,79.91,55.30,27.88〇IR(KBr)：v(cm-l)： 3432，1597，1407，1334,1135，1004,927,793,571。
[0057] 以5-烯去甲斑蝥素钾钡盐为原料，合成去甲斑蝥素钾钡盐(99%)，白色固体，Rf = 0.65(甲醇：冰乙酸= 1:5) ,1^:2501^4^^(020):3:4.69(8,210,2.83(8,210,1.63(8,210, 1.50(8,2!1)。 13〇匪1?(〇2〇)3:180.67,79.58,55.36,28.16。11?(1(8『），（〇11-1) :3421，1591， 1410，1128，1053，991，927,808,706。
[0058] 以5-烯去甲斑蝥素钠钡盐为原料，合成去甲斑蝥素钠钡盐(47.2%)，白色固体，Rf =0.54(甲醇：冰乙酸=1:5)，]\^:250。(：。1!1匪1?(〇2〇)3:4.69(8,2!〇,2.84(8,2!〇，1.64((1，了 =8他，2!〇，1.49((1，了 = 8!^，2!1)。13〇匪1?(〇2〇)3:180.77,79.68,55.36,27.99。11?(1(8『）， (cm-1):3426，1603，1403，1267，1138，994，865，793，571〇
[0059] 实验例6.去甲斑蝥素复合盐11的抗肿瘤活性测试
[0060] 细胞株和溶剂 [0061 ] 人肝癌细胞HEPG2，
[0062] 人胃癌细胞BGC803，
[0063] 人结肠癌细胞SW480，
[0064] 人胰腺癌细胞PANK-1，
[0065] 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640中培养基，
[0066] 溶剂:二甲亚砜(简称为DMS0)。
[0067] CCK-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案
[0068] 本试验按照SRB方法，以斑蟊素为阳性对照，DMS0溶剂为空白对照，进行了浓度为 50nnmol/mL的去甲斑蝥素复合盐衍生物11对肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803、结肠癌细 胞SW480及人胰腺癌细胞PANK-1的两种肿瘤细胞的抑制活性测试。
[0069] 具体测试方案为：选用待测肿瘤活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增 殖抑制试验采用EnoGeneCell? Counting Kit-8(简称为CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞 消化、计数、制成浓度为1 X 105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入1 OOyL细胞悬液(每孔1 X104个细胞）；96孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；每孔加入100yL相应的含药 物的培养基，作用浓度为50yMol/L(g卩：微摩尔/升），同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳 性对照组（阳性对照分别选用斑蝥素和喜树碱），每组5复孔;96孔板置于37°C，5%⑶2培养 箱中培养72小时后;每孔加入10yL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪 测定在450nm处的吸光值(简称0D值），计算各个化合物对人肝癌细胞HEPG2及人结肠癌细胞 SW480的抑制率。
[0070] 肿瘤细胞生长抑制率=Π -·^21^^·]χ100% OD(C)-OD(T(.)
[0071] 实验结果详见表1。
[0072] 表1、去甲斑蝥素复合盐衍生物11对于两种肿瘤细胞的抑制活性
[0073]
[0074] 由表1可知，在50nmol/L的相当低的作用浓度下，本发明合成得到的去甲斑蝥素复 合盐衍生物11对人肝癌细胞HEPG2及人结肠癌细胞SW480两种肿瘤细胞具有一定的抑制效 果，可将其用于制备抗肝癌及结肠癌的候选药物。
【主权项】
1. 一种新塑的去甲斑螯素复合盐衍生物，其结构式如式11所示，其中，M及Ml各自独立的选自正一价或正二价阳离子，且M及Ml不同时为正二价阳离子。2. 根据权利要求1所述去甲斑蝥素复合盐衍生物，其特征在于，为以下结构：3. 根据权利要求1或2所述去甲斑蝥素复合盐衍生物，其特征在于，阳离子M及Ml各自独 立的选自钠 Na、钾K、镁Mg或钡Ba离子，且M及Ml不同时为正二价阳离子。4. 根据权利要求1或2所述去甲斑蝥素复合盐衍生物，其特征在于，包括以下结构： 5. 根据权利要求3所述去甲斑蝥素复合盐衍生物的合成方法，其特征在于，包括步骤： 1)、5_烯去甲斑蝥素1与甲醇在三乙胺存在下反应得到5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯8,2)、化合 物8与第一金属氢氧化物MOH在甲醇成盐得到5-烯去甲斑蝥素甲酯盐9,3)、化合物9与第二 金属氢氧化物MlOH水溶液反应得到5-烯去甲斑蝥素复合盐10,4)、化合物10在有机溶剂中 在催化剂存在下加氢还原得到去甲斑蝥素复合盐11;合成路线为：其中，M及Ml各自独立的选自正一价或正二价阳离子，且M及Ml不同时为正二价阳离子。6. 根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述步骤4)的催化剂选自Pd/C，Pd (0H)2/C，Pt/C或Raney Ni。7. 根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述步骤4)的催化剂选自Pd/C或Pd (OH)2/C〇8. 权利要求1-4任意一项所述的去甲斑蝥素复合盐衍生物11用于制备肝癌及结肠癌两 种抗肿瘤药物中的用途。
【文档编号】C07D493/08GK106008545SQ201610452205
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】赵长阔, 王先恒, 贾佳, 罗灿敏
【申请人】遵义医学院