头花蓼黄酮苷类化合物的制备及抗衰老用图
【专利摘要】本发明提供一种头花蓼黄酮苷类化合物的制备方法，通过头花蓼粉碎，甲醇浸提，抽滤浓缩，水和乙酸乙酯溶剂分配后，乙酸乙酯浓缩，先通过硅胶柱分离，再经过ODS(十八烷基硅烷键合硅胶填料)开口柱及HPLC(高效液相色谱)纯化获得。本发明通过酿酒酵母K6001生物活性系统，显示这四个黄酮苷化合物均能显著延长酵母的复制性寿命。本发明提供的头花蓼黄酮苷类化合物可在制备抗衰老药物或保健品中应用。本发明制备方法简单，提取的产物纯度高，且头花蓼为易得便宜的中药，增加了头花蓼的药物用途，发现了其组分所具有的抗衰老潜力。
【专利说明】
头花蓼黄酮苷类化合物的制备及抗衰老用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及头花寥黄酮苷类活性化合物的制备方法及其 在制备抗衰老药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 根据最新统计数据，全世界60岁及以上老龄人口在2015年已经达到了 9.01亿，占 世界总人口的12%。世界已进入老龄化社会，随之而来的与衰老相关的疾病成为日益凸显 的问题。包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病是世界性的公共卫生难题之一。仅在中 国，老龄人口已经超过两亿，阿尔茨海默病的患者数量在2014年已超过600万。在医药学领 域，寻找防治老年性疾病的药物已经成为当务之急。
[0003] 经过对衰老机制的长期研究，本领域内已形成多种衰老学说，包括程序衰老说、体 细胞突变说、错误成灾说，自由基说、神经内分泌说、免疫衰老说，等等。衰老是一个十分复 杂的过程，同一类抗衰老药物发挥药效的方式也不尽相同。
[0004] 寥科植物头花寥(Polygonum capitatum)为多年生匍草本，是苗药中的一种常 用药材，具有很高的药用价值。作为贵州民族的常用草药，头花寥的药用价值也已有研究： 头花寥提取物及其在降血糖药物中的应用；头花寥提取物在美白用品中的应用及美白用 品；具有抗炎作用的热淋清颗粒原料头花寥提取物;具有抗淋球菌作用的热淋清颗粒原料 头花寥提取物；用于预防或治疗青春痘的头花寥组合物；用于治疗或预防口腔疾病的头花 寥组合物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种头花寥黄酮苷类活性化合物的制备方法，通过以下步骤 制备获得：
[0006] (1)头花寥粉碎后用甲醇浸提，抽滤浓缩后再用乙酸乙酯和水溶剂分配、乙酸乙酯 层浓缩，得到乙酸乙酯层粗样；
[0007] (2)将所得乙酸乙酯层粗样依次经硅胶开口柱分离和两次0DS开口柱分离，得到两 个抗衰老活性组分；
[0008] (3)所得的两个抗衰老活性组分经HPLC纯化后得到四个黄酮苷类活性化合物，分 别为myricetin 7_0_ -L-rhamnopyranoside,quercetin 4'-O-a-L-rhamnopyranoside, quercetin 3-〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside,和kaempferol 3-〇- -L-rhamnopyranoside〇
[0009] 步骤(2)中硅胶开口柱分离的溶剂系统为正己烷:二氯=100:0，90:10，70:30，50: 50，30:70,10:90，0:100;随后二氯甲烷：乙酸乙酯= 90:10，70:30,50:50,30:70，0:100;最 后为甲醇洗脱。第一次0DS开口柱分离的溶剂系统为甲醇:水=30:70，35:65，40:60，50:50， 60:40，70:30，90:10，100:0。第二次0DS开口柱分离的溶剂系统分别为为甲醇：水=30:70， 50:50和30:70,35:65,60:40。
[0010] 步骤(3)中HPLC纯化的色谱条件分别为：色谱柱CAPCELL PAKC18(10/250mm)，流速 311117111丨11，检测波长21011111，流动相甲醇：水=38:62和色谱柱06￥61〇8丨1〇30-1^-5(10/ 250mm)，Nomura Chemical，流速3mL/min,检测波长210nm,流动相甲醇：水= 48:52〇
[0011] 本发明的另一个目的是提供所述的黄酮苷类化合物在制备抗衰老药物或保健品 中的应用。本发明研究发现，通过本发明方法获得的头花寥来源的黄酮苷类化合物在抗衰 老模型中，可以显著延长酵母复制性寿命(见图1)，尤其是四个黄酮苷类化合物。说明其具 有抗衰老活性。
[0012] 本发明提供的头花寥来源的黄酮苷类化合物可根据任何常规过程制备药学上可 接受的载体或稀释剂。这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例 如稀释剂、赋形剂如是等，填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等;粘合剂如淀粉浆、羟丙纤维 素、明胶、聚乙二醇等;湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等;吸收促进剂聚山梨脂、 卵磷脂等，表面活性剂伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等等，另外还可以在化合物中加 入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
[0013] 给药的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液 剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂。可制成常规，速释，缓释或延 迟释放。
[0014] 本发明的黄酮苷类化合物可通过各种途径给予，包括口服，鼻腔，肌肉，皮下，静注 等。
[0015] 本发明提供的头花寥来源的黄酮苷类化合物在酿酒酵母Κ6001系统中表现出显著 的抗衰老活性。本发明制备方法简单，提取的产物纯度高，且头花寥为易得便宜的中药，为 抗衰老药物或保健品的研发进行基础性研究，将具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0016] 图1是四个黄酮苷类化合物在Κ6001生物活性系统中对酵母复制性寿命的延长作 用；图中 1 : myr i ce t in 7-〇- -L-rhamnopyranoside, 2： quercetin 4 ' -〇-a-L-rhamnopyranoside,3：quercetin 3_〇-a-(2"-galloyl)rhamnoside，4:kaempferol3_〇--L-rhamnopyranoside〇
【具体实施方式】
[0017] 以下通过对该类若干具体化合物制备实例的实施方式和附图再对本发明的上述 内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0018] 实施例1
[0019] 从头花寥中分离提取四个黄酮苷类化合物的制备方法，具体步骤为：
[0020] 1)粉碎和浸提：
[0021] 250g干燥的头花寥粉碎后，用2.5L甲醇(工业级)室温下浸提2次，每次1天，抽滤浓 缩，得甲醇浸提物粗样，用乙酸乙酯和水萃取分离，静置，将乙酸乙酯层减压浓缩旋干后，得 到乙酸乙酯层粗样9g。
[0022] 2)分离和纯化：
[0023]将乙酸乙酯层粗样先经硅胶开口柱分离（200-300目，以下溶剂系统按体积比，正 己烷:二氯甲烷溶剂系统按体积比为：100:〇，90:10，70:30，50:50，30:70，10:90，0:100;随 后二氯甲烷：乙酸乙酯溶剂系统按体积比为:90:10,70:30,50:50,30:70,0:100;最后为甲 醇）；将活性样品再用ODS开口柱分离(溶剂系统按体积比为甲醇：水=0:70，35:65，40:60， 50:50，60:40，70:30，90:10，100:0);得到两个活性组分A1 (975 · 7mg)和B1 (267 · 4mg)，然后 A1和B1分别用ODS开口柱分离(溶剂系统按体积比分别为甲醇:水为:30:70，50:50和30:70， 35:65，60:40)，得到纯度较高两个活性组分A2 (129.4mg)和B2 (139.9mg)。取A2 50mg用HPLC 纯化，色谱条件:色谱柱PAKC18( 10/250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为为甲醇： 水=38 : 62，得到化合物myricetin7-〇- -L-rhamnopyranoside (2 · 7mg，保留时间为 19 · 5min)，quercetin4，-〇-a-L-rhamnopyranoside(35 · 8mg，保留时间为38 · Omin);取B2 20mg用HPLC纯化，色谱条件：色谱柱C30-UG-5(10/250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流 动相为为甲醇：水=48 : 52，得到化合物quercetin 3-〇_α-(2" -gal loyl )rhamnoside (5 · 3mg，保留时间为54·8min)，kaempferol 3-〇- -L-rhamnopyranoside(2 · 5mg，保留时间 为60·6min)。
[0024] 四个黄酮苷类化合物结构式如下：
[0025]
[0026]
[0027] 实施例2
[0028] 对实施例 1 所得化合物myricetin 7-〇- -L_rhamnopyranoside，quercetin4'-〇-α-L-rhamnopyranoside, quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-0--L-rhamnopyranos ide的理化特征及化学结构的定性鉴定：
[0029] 化合物myricetin 7-〇- -L-rhamnopyranoside，quercetin4，-〇-a-L-rhamnopyranoside,quercetin 3-〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside,和kaempferol 3-〇-_L-rhamnopyranos ide的结构经1H NMR、MS和文献比对确定。
[0030] 化合物myricetin 7-〇- -L-rhamnopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式 为C2iH2〇Oi2; ESI-T0F-MS:m/z 465 · 1027 (M+H).，氢谱数据：咕匪以 500MHz，CD30D): = 6 · 95 (S， 2H) ,6.37(d,lH ,J = 2.0Hz) ,6.20(d, 1H ,J = 2.0Hz), 5.31 (d, 1H ,J= 1.5Hz) ,4.22(dd, 1H ,J =3,1,5Hz) ,3.79 (dd, 1H,J = 9.0,3.0Hz) ,3.52 (m,lH) ,3.32 (m,lH) ,0.96(d,3H,J = 6.5Hz)〇
[0031 ] 化合物quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式 为C2iH2〇Oii; ESI-T0F-MS:m/z 449 · 1114(M+H) +，氢谱数据：咕匪以 500MHz，CD30D): = 7 · 33 (d， 1H，J=1 ·5Ηζ) ,7.30(dd，lH，J = 8.0,1 ·5Ηζ) ,6.90(d，lH，J = 8.0Hz)，6· 18(d，1H，J = 2.0Hz) ,6.35(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.34(s,lH) ,4.21(s,lH) ,3.39(m,lH) ,3.73(dd,lH,J = 9.5,3.0Hz)，3.43(m，lH)，0.93(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0032] 化合物quercetin 3-〇_a-(2"-galloyl)rhamnoside的理化性质：黄色固体，分子 式为C28H24〇i5; ESI-T0F-MS:m/z 601 · 1179 (M+H) +，氢谱数据：iHNMR(500MHz，CD30D): = 7 · 36 (d，lH，J = 2.0Hz)，7.34(dd，lH，J = 8.5，2 ·0Ηζ)，，7.07(s，2H)，6.93((1, lH，J = 85Hz) ,6.18 (d,lH,J = 2.0Hz) ,6.36(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.63(dd,lH,J = 3.5,2.0Hz) ,5.50(d,lH,J = 1.5Hz)，4.01(m，lH)，3.47(m，2H)，1.03(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0033] 化合物kaempferol 3-〇- -L-rhamnopyranoside的理化性质：棕黄色固体，分子式 为C21H20O10; ESI-T0F-MS:m/z 443 · 1125 (M+H).，氢谱数据：咕匪以 500MHz，CD30D): = 7 · 77 (d， 1H,J = 8.5Hz),6.93(d,lH,J = 8.5Hz),6.18(d,lH,J = 2.0Hz),6.35(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.37 (d,lH ,J=1.5Hz),4.21(dd,lH ,J = 3.0,1.5Hz),3.70(dd,lH ,J = 9.0,3.5Hz),3.33-3.16 (m，2H)，0.92(d，3H，J = 5.5Hz)。
[0034] 实施例3
[0035] 四个黄酮苷类化合物在抗衰老模型筛选中，表现出抗衰老活性，可显著延长K6001 酵母的复制性寿命。
[0036] 目前用于抗衰老研究的生物模型主要有老鼠，线虫，果蝇和酵母。本实施例选择酿 酒酵母作为抗衰老研究的活性系统，因为酵母是单细胞的真核生物，生命周期短，已获其完 整的基因组数据，是目前常用的衰老模型生物。同时以白藜芦醇作为阳性对照，白藜芦醇是 目前众所周知的、在多种动物模型上显示抗衰老作用的小分子化合物。
[0037]分析方法包括以下步骤：
[0038] (1)从-30°C冰箱取出K6001酵母菌株，用PBS洗涤三次，每次5ml，除去其中的甘油。 最后加入lml PBS，吹打，使其悬浮后加入到5ml液体培养基（1 %的酵母粉，2%的蛋白胨， 3 %的半乳糖）中。28 °C振摇（160r/min)培养24小时；
[0039] (2)培养结束后用5ml PBS洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数， 计算酵母的浓度；
[0040] (3)采用无水乙醇作溶剂，分别配制1μΜ、3μΜ的，备用；
[0041 ] (4)在灭过菌的培养皿中加入5ml的固体培养基（1 %的酵母粉，2 %的蛋白胨，2 % 的葡萄糖，2%的琼脂粉），待培养基凝固后，向其中分别加入步骤(3)中配制好的样品，溶剂 挥发后加入4000个酵母，用涂布器涂抹均匀，28°C恒温培养48小时；
[0042] (5)显微镜下每皿随机数出40个母细胞分别产生的子细胞个数，并记录、作图分 析，结果见图1。
【主权项】
1. 一种头花寥黄酮苷类化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) 头花寥粉碎后用甲醇浸提，抽滤浓缩后再用乙酸乙酯和水溶剂分配、乙酸乙酯层浓 缩，得到乙酸乙酯层粗样； (2) 将所得乙酸乙酯层粗样依次经硅胶开口柱分离和两次ODS开口柱分离，得到两个抗 衰老活性组分； (3) 所得的两个抗衰老活性组分经HPLC纯化后得到四个黄酮苷类活性化合物，分别为 myricetin 7-〇- -L-rhamnopyranoside,quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside， quercetin 3-〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside,和kaempferol 3-〇- -L-rhamnopyranoside〇2. 根据权利要求1所述的一种头花寥黄酮苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (2) 中硅胶开口柱分离的溶剂系统为正己烷:二氯=100:0,90:10,70:30,50:50,30:70，10: 90,0:100 ;随后二氯甲烷：乙酸乙酯=90:10,70:30,50:50,30:70,0:100;最后为甲醇洗脱； 第一次0DS开口柱分离的溶剂系统为甲醇：水=30:70,35:65,40:60,50:50,60:40,70:30， 90:10,100:0;第二次0DS开口柱分离的溶剂系统分别为为甲醇:水= 30:70,50:50和30:70， 35:65,60:40。3. 根据权利要求1所述的一种头花寥黄酮苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (3) 中HPLC纯化的色谱条件分别为:色谱柱CAPCELL PAKC18，10/250mm，流速3mL/min，检测 波长210nm，流动相甲醇：水=38 : 62和色谱柱Develosi 1 C30-UG-5，10/250mm，Nomura Chemical，流速3mL/min,检测波长210nm,流动相甲醇：水= 48:52〇4. 根据权利要求1所述方法制备的头花寥黄酮苷类化合物在制备抗衰老药物或保健品 中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物由黄酮苷类化合物与药学上可接 受的载体或稀释剂制得。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物剂型选用固体制剂或液体制剂。
【文档编号】A61P39/06GK106008627SQ201610410464
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】戚建华, 张慧, 向兰, 陈海轶
【申请人】浙江大学