具有抗氧化功能的五肽及其制备方法
【专利摘要】一种具有抗氧化功能的五肽(AWDPE和DWDPK)及其制备方法，属于抗氧化肽技术领域。本发明以长白山榛仁为原料，采用酶控制水解技术制备抗氧化肽并通过凝胶过滤层析Sephadex G?25，Sephadex G?15和反相高效液相层析等技术分离纯化，经此方法得到的多肽活性及纯度较高，杂质较少。对DPPH、羟基自由基、ABTS的清除率及Fe2+螯合率均有较好的效果，存在显著的清除作用，具备较强的抗氧化活性，是一种良好的天然抗氧化剂，拥有极大的研究价值和广阔的市场前景。
【专利说明】
具有抗氧化功能的五肽及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于抗氧化肽技术领域，具体涉及一种具有抗氧化功能的五肽及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 众多研究表明，机体氧化应激损伤能够引起代谢失调，从而加速衰老，引发老年痴 呆、肿瘤及动脉粥样硬化等疾病。而通过外界抗氧化物质的摄入能够在一定程度上清除体 内自由基，起到延缓衰老，预防各种疾病的作用。如今大多数抗氧化剂都是人工合成的，与 其相比，从天然植物中制备抗氧化剂有着易于吸收，安全无副作用的优点。同时，我国拥有 极丰富的动植物蛋白资源，利用这一优势，开发天然抗氧化肽具有重要的意义。
[0003] 吉林省长白山地区盛产榛子，虽然历史悠久，但开发利用方面仍处于比较初级的 阶段，加工仅限于制作糕点、饲料以及榨油等。以长白山榛仁为原料制备抗氧化肽，将对长 白山榛子资源的充分利用和榛仁多肽功能性产品的开发提供参考。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是提供一种具有抗氧化功能的五肽及其制备方法，以长白山榛 仁为原料，采用酶控制水解技术制备抗氧化肽并通过凝胶过滤层析Sephadex G-25， Sephadex G-15和反相高效液相层析等技术分离纯化，经此方法得到的多肽活性及纯度较 高，杂质较少。
[0005] 本发明的目的之二是对榛仁抗氧化肽进行结构鉴定，采用高效液相色谱-电喷雾 飞行时间串联质谱(HPLC-ESI-TOF MS/MS)技术并经从头测序(de novo)方法进行质谱解 析，鉴定出两种新的抗氧化肽AWDPE和DWDPK。
[0006] 具有抗氧化功能的五肽及其制备方法，所述抗氧化肽包括两条肽，分别为AWDPE (八1&-1'印-48口-?1'〇-6111)和0￥0?1((48。-1'印-48。-?1'〇-1^8)，其制备步骤如下：（1)棒仁抗氧 化肽的制备
[0007] 将2~5g榛仁分离蛋白粉（碱溶酸沉法制备，Functional Properties of the Protein Isolate and Major Fractions of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China，Dan Wu，Wei_hong Min)溶于lOOmL蒸馈水配制成质量分数 2 %~5 %的溶液，90~100 °C水浴10~20min使蛋白变性，冷却后调节pH至7~10，加入 A1 calase 2.4L，通过电位滴定仪维持恒定的pH值;酶解结束后，溶液在90~100 °C下灭酶10 ~20min，冷却至室温，用HC1调节pH至7 · 0，5000~8000rpm离心10~20min，取上清液，将其 冷冻干燥后得到粗榛仁抗氧化肽，测定抗氧化活性。
[0008] (2)榛仁抗氧化肽的分离纯化
[0009] 将粗榛仁抗氧化肽加入蒸馏水配成溶液，并过0.22μηι的滤膜;然后通过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱（1.6cm X 80cm)层析分离，用紫外检测仪在280nm波长下检测，并用自动 部分收集器进行收集组分（1.5mL/管），将分离得到的3种组分收集，冷冻干燥，测定抗氧化 活性;将活性最强组分进行Sephadex G-15层析分离，紫外检测仪在280nm波长下检测，并用 自动部分收集器收集(1.5mL/管），将分离得到的2种组分收集，冷冻干燥，测定抗氧化活性； 将活性最高组分进行反相高效液相层析分离，将得到的5种组分收集，冷冻干燥，测定抗氧 化活性，活性最高的组分即为本发明所述的具有抗氧化肽功能的五肽AWDPE和DWDPK。
[0010] (3)榛仁抗氧化肽的结构鉴定
[0011]采用ESI-TOF MS/MS鉴定ACE抑制肽的氨基酸序列，运用de novo方法进行质谱数 据解析。结构鉴定结果即为本发明所述的具有抗氧化功能的五肽AWDPE和DWDPK。
[0012] 步骤（1)中，利用〇 · 6mol/L NaOH调pH值7~10和维持恒定的pH值，酶解温度为40~ 70 °C、酶解时间为3~7h，加酶量5000~10000U/g榛仁分离蛋白。
[0013] 步骤(2)中所述的Sephadex G-25凝胶层析和Sephadex G-15凝胶层析，上样浓度 10~50mg/mL，上样体积1~5mL，洗脱流速0.1~3mL/min，洗脱液为纯水。
[0014] 步骤（2)中所述的反相高效液相层析采用C18色谱柱，流动相A为含有质量分数 0.1 % TFA的双蒸水，B为含有质量分数0.1 % TFA的乙腈，上样浓度0.1~5mg/mL，上样体积10 ~80yL，100 ~60%B 线性洗脱 30 ~60min;流速0.1 ~lmL/min。
[0015] 本发明相比现有技术的有益效果为：
[0016] 本发明首次公开了具有抗氧化功能的五肽及其制备方法，采用碱性蛋白酶 Alcalase 2.4L酶解榛仁分离蛋白进行制备并纯化鉴定出两种未报道的抗氧化肽，对DPPH、 羟基自由基、ABTS存在显著的清除作用，对Fe 2+具有较好的螯合效果，具备较强的抗氧化活 性，是一种良好的天然抗氧化剂，拥有极大的研究价值和广阔的市场前景。
【附图说明】
[0017] 图1为榛仁抗氧化肽对ABTS自由基的清除作用曲线图；由图1可知，榛仁抗氧化肽 浓度达到3mg/mL时，对ABTS自由基的清除率就已经达到96.43%，而Vc在0.5mg/mL时就已经 达到100 %。在试验浓度范围内，抗氧化肽对ABTS自由基清除率在3mg/mL以后保持在98 %~ 100%，此时抗氧化肽和Vc对ABTS自由基的清除率基本相同，即抗氧化肽对ABTS自由基的清 除率为Vc的100%。说明抗氧化肽对ABTS自由基有较强的清除作用，具有较强的抗氧化活 性。
[0018] 图2为榛仁抗氧化肽对DPPH自由基的清除作用曲线图；如图2所示，当Vc浓度为 0. lmg/mL时，清除率就达到91.22%。榛仁抗氧化肽对DPPH自由基的清除率随浓度的增大而 升高，并在2mg/mL后逐渐稳定，8mg/mL时达到100%。
[0019] 图3为榛仁抗氧化肽对羟基自由基自由基的清除作用曲线图；Vc作为一种良好的 抗氧化剂，在〇. 5mg/mL时清除率就能达到100%。榛仁抗氧化肽对羟基自由基的清除作用随 浓度的增加而显著提高，当浓度为8mg/mL时，清除率达到85%以上，并在2411^/11^时达到 100%〇
[0020]图4为榛仁抗氧化肽的还原能力作用曲线图；有还原能力的样品能使铁氰化钾中 的Fe3+还原成Fe2+(亚铁氰化钾），产物与FeCl3进一步反应生成在700nm处有最大吸光峰的普 鲁士蓝(Fe 4[Fe(CN)6]3)，因此测定700nm处吸光值的高低可以反映样品还原能力的大小，吸 光值越大，则还原能力越强。试验结果如3.15图所示，随着浓度的升高，榛子抗氧化肽的还 原能力逐渐增强，10mg/mL时，A700值为1.055，能够达到同浓度下EDTA的38.55%。
[0021]图5为榛仁抗氧化肽对亚铁离子的螯合作用曲线图；0.5mg/mL EDTA能使Fe2+螯合 率达到100 %，而浓度为10mg/mL时抗氧化肽的螯合率为90.25 %，12mg/mL时达到99.30 %。 可见榛子抗氧化肽对Fe2+有较好的螯合能力。
[0022]图6为实施例Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析图谱;通过Sephadex G-25凝胶色谱 将榛子抗氧化肽分离成A1，A2，A3三个组分。根据凝胶层析原理，组分A1应该为水解未彻底 的蛋白，分子量大于5000Da，而A2、A3为水解得到的多肽，分子量在5000Da以下。
[0023]图7为实施例Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析图谱；Sephadex G-15葡聚糖凝胶适 用的分子量范围是1〇〇~1500,可以用于缓冲液的交换、脱盐和分离分子量接近的小分子。 如图7所示，组分A3经过G-15分离纯化得到B1、B2两种组分。
[0024] 图8为实施例反相高效液相色谱分离图谱;0~lOmin出现的峰是溶剂峰，通常情况 下，溶剂会有一定的紫外吸收，形成溶剂峰，一般情况下都会在10分钟之前出现，并不影响 纯化效果。图谱出峰主要集中在18~40min区间内，分离主要得到5种组分:C1、C2、C3、C4、 C5〇
[0025] 图9为两种抗氧化肽质谱图。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。（1)榛 仁抗氧化肽的制备
[0027] 将榛仁分离蛋白粉与蒸馏水配制成质量分数5%的溶液，90°C下水浴15min，从而 破坏其蛋白结构。冷却后利用〇. 6mol/L NaOH调pH值达到9.5，加入Alcalase2.4L(丹麦诺维 信水解酶），添加量8000U/g分离蛋白粉，保持温度50 °C并通过电位滴定仪加入0.6mo 1/L NaOH维持恒定的pH值，酶解5h后溶液在95 °C下灭酶15min，冷却至室温，加入HC1调节pH至 7.0，5000r/min离心1 Omin，取上清液，将其冷冻干燥后得到粗榛子抗氧化肽。
[0028] (2)榛仁抗氧化肽的分离纯化
[0029]制备的粗榛仁抗氧化肽，加入蒸馏水配成30mg/mL的溶液，并过0.22μπι的滤膜。通 过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱（1.6cm X 80cm)进行分离，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，洗 脱流速0.5mL/min，用紫外检测仪在280nm波长下检测，并用自动部分收集器进行收集 (1.5!1117管）。分离得到4142 43三个组分，分别冷冻干燥，测定抗氧化活性(结果见表1)，组 分A3具有最强的ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力以及还原能力；而组分A2的还 原力和ABTS自由基以及DPPH自由基的清除能力均不强;A1组分总还原能力及DPPH自由基清 除能力最弱均低于未经纯化的样品。综上，选择组分A3进行下一步分离纯化。
[0030] 将组分A3，加入蒸馏水配成30mg/mL的溶液，并过0.22μηι的滤膜。用Sephadex G-15 葡聚糖凝胶柱（1.6cm X 80cm)进行分离，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，洗脱流速0.5mL/min， 用紫外检测仪在280nm波长下检测，并用自动部分收集器进行收集组分(1.5mL/管）。分离得 至|JB1、B2两种组分，冷冻干燥，测定抗氧化活性(结果见表2)，组分B2的抗氧化活性强于B1， 所以收集组分B2,利用高效液相色谱进一步分离纯化。
[0031] 采用高效液相色谱法，对组分B2进行分离纯化。配成lmg/mL的溶液，并过0.22μπι的 滤膜。色谱条件:仪器：日本岛津液相色谱仪;色谱柱:Diamonsi 1 C18(250*4.6，5μπι);流动 相(Α:双蒸水+质量分数0.1%三氟乙酸;8:乙腈+质量分数0.1%三氟乙酸），上样量2(^1^，洗 脱流速0.5mL/min，检测波长220nm，柱温30 °C。95~70 %B线性洗脱。分离得到5种组分:Cl、 C2、C3、C4、C5,由于反相高效液相色谱分离得到的样品量较少，所以选用酶标仪测定羟基自 由基、ABTS、还原力三个指标，浓度均为0.5mg/mL。结果如表3所示，与其他4种组分相比，C2 具有最强的还原力和ABTS自由基清除能力，以及较强的DPPH自由基清除能力，所以C2的抗 氧化活性最强，C4次之，其他组分活性较弱。因此我们选择对C2组分进行收集和结构鉴定。 [0032] (3)榛仁抗氧化肽的结构鉴定
[0033] 采用Agilent 1200型快速分离液相色谱系统和Agilent 6520Q-T0F质谱仪。液相 条件:色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18(2. IX 150mm，3.5ym);二元线性梯度洗脱:流动 相：（A)0.1 %甲酸水溶液；（B)乙腈；流动相梯度：0~30min，5 %-30 ;柱温35°C，流速 0 · 4mL/min，进样量 5yL〇
[0034] 质谱条件:采用电喷雾正离子扫描模式(ESI + );质量扫描范围m/z 100~2000;干 燥气流速(N2)为9L/min，干燥器温度300°C，雾化电压35psig，毛细管电压为3.5kV，碎裂电 压175V，锥孔电压65V，八级杆射频电压250V，二级质谱碰撞电压12-15eV。
[0035] 肽段序列解析运用Peaks 7.5软件（Bioinformatics Solutions Inc)。所鉴定出 榛仁抗氧化肽的结构分别是AWDPE和DWDPK，它们的分子量分别是616.25和659.29Da。
[0036] 以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下， 两种抗氧化肽的氨基酸序列其他排列组合方式及对多肽做出的若干改进和修饰，也应视为 本发明的保护范围。
[0037]表1 :G_25分离得到的各组分抗氧化指标比活
[0038]
[0039] 表2 :G_15分离得到的各组分抗氧化指标比活
[0040]
[0041 ]表3:反相高效液相分离得到的各组分抗氧化指标比活
[0042]
【主权项】
1 · 一种具有抗氧化功能的五肽，其特征在于：同时包括AWDPE(Ala-Trp-Asp-Pro-Glu) 和 DWDPK( Asp-Trp-Asp-Pro-Lys)两种五肽。2. 权利要求1所述的一种具有抗氧化功能的五肽的制备方法，其步骤如下： (1) 榛仁抗氧化肽的制备 将2~5g榛仁分离蛋白粉溶于100mL蒸馏水配制成质量分数2%~5%的溶液，90~100 °C水浴10~20min使蛋白变性，冷却后调节pH至7~10,加入Alcalase2.4L，维持恒定的pH 值；酶解结束后，溶液在90~100°C下灭酶10~20min，冷却至室温，调节pH至7.0,5000~ 8000rpm离心10~20min，上清液冷冻干燥后得到粗榛仁抗氧化肽； (2) 榛仁抗氧化肽的分离纯化 将粗榛仁抗氧化肽加入蒸馏水配成溶液，并过〇. 22μηι的滤膜;然后通过Sephadex G-25 葡聚糖凝胶柱层析分离，将分离得到的组分收集，冷冻干燥;将活性最强组分进行Sephadex G-15层析分离，将分离得到的组分收集，冷冻干燥;将活性最高组分进行反相高效液相层析 分离，将分离得到的组分收集，冷冻干燥，活性最高的组分即为具有抗氧化肽功能的五肽 AWDPE和DWDPK。3. 如权利要求2所述的一种具有抗氧化功能的五肽的制备方法，其特征在于:步骤（1) 中，是利用〇.6mol/L NaOH调节pH值至7~10和维持恒定的pH值。4. 如权利要求2所述的一种具有抗氧化功能的五肽的制备方法，其特征在于:酶解温度 为40~70°C、酶解时间为3~7h，加酶量5000~10000U/g榛仁分离蛋白粉。5. 如权利要求2所述的一种具有抗氧化功能的五肽的制备方法，其特征在于:步骤(2) 中所述的Sephadex G-25凝胶层析和Sephadex G-15凝胶层析，上样浓度10~50mg/mL，上样 体积1~5mL，洗脱流速0.1~3mL/min，洗脱液为纯水。6. 如权利要求2所述的一种具有抗氧化功能的五肽的制备方法，其特征在于:步骤(2) 中所述的反相高效液相层析采用C18色谱柱，流动相A为含有质量分数0.1%TFA的双蒸水，B 为含有质量分数〇.l%TFA的乙腈，上样浓度0.1~5mg/mL，上样体积10~80yL，100~60%B 线性洗脱30~60min;流速0.1~lmL/min。
【文档编号】C07K7/06GK106008670SQ201610517727
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】闵伟红, 刘春雷, 李鸿梅, 方丽, 王辑
【申请人】吉林农业大学