一种使用专属性肽段组鉴别刺参的方法
【专利摘要】本发明涉及一种使用专属性肽段组鉴别刺参(Apostichopus japonicus)的方法，以及一组单独或组合使用时，可用来鉴别刺参的特征多肽，所述特征多肽为刺参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为刺参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的蛋白虽然发现有植物或细菌等物种和其一致，但对比梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参时，所述特征多肽是刺参独有的。
【专利说明】
一种使用专属性肽段组鉴别刺参的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种使用专属性肽段组鉴别刺参 (Apostichopus japonicus)的方法。
【背景技术】
[0002] 海参富含酸性黏多糖，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。 故此，海参享有"营养宝库"之美誉，现代人把海参誉为"海味八珍之首"。市场上海参种类繁 多，不同海参因其营养价值、口感等不同而价格相差巨大，刺参是海参的一种。是中国20多 种食用海参中质量最好的一种。在海参家族中，品质比较好的是山东半岛和辽东半岛的刺 参。据《本草纲目拾遗》中记载，"辽东产之海参，体色黑褐，肉嫩多刺，称之辽参或海参，品质 极佳，且药性甘温无毒，具有补肾阴，生脉血，治下痢及溃疡等功效"。因其药性温补，足敌人 参，故名海参。刺参营养十分丰富，不仅含有较高的蛋白质，多种人体所必需的氨基酸、微量 元素和多种维生素，而且还含有能治病、防癌的药用皂甙和海参多糖。
[0003] 不同品种的海参相比较，有的粘多糖含量高，对心脑血管有好处;有的皂甙含量 高，对抗癌有益。海参同人参一样，如果皂甙含量高，则药用价值高，但可能味道不好;而有 的海参蛋白质含量尚，如前参和刺参，可以大量用在宾馆和家庭餐桌上，对蛋白质缺之、营 养不良的人群提供身体所需的营养物质。
[0004] 由于目前缺乏特别有效的识别海参品种的方法，鉴别海参种类的方法还只是靠传 统的外观观察，缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者， 因此需要一种高效准确的鉴定海参的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明对刺参(Apostichopus japonicus)中的肽段进行了研究，建立了从多肽水 平对刺参进行鉴别的技术，填补了国内外海参鉴别的空白。
[0006] 本发明首先涉及一组单独或组合使用时，可用来鉴别刺参的特征多肽，所述特征 多肽为刺参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为刺参独有的， 且长度在5~30个氨基酸的多肽片段，所述的蛋白为刺参中的如下蛋白：
[0007] (1 )Arginine Kinase蛋白；
[0008] (2)major yolk proteinl蛋白或major yolk protein2蛋白；
[0009] (3)Tropomyosin蛋白；
[0010] (4)其他刺参特异性较高的蛋白，包括但不限于：profilin蛋白、heat shock cognate 70蛋白、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase蛋白、melanotransferrin 蛋白或Cu_Zn superoxide dismutase蛋白。
[0011]优选的，来源于Arginine Kinase蛋白的多肽片段，其序列为：
[0012] SEQ ID N0.1：GTSGEFTESVGGVYDISNLDR；
[0013] SEQ ID N0.2：GESIDDLVPK；
[0014] SEQ ID N0.3：DDFPNFEGHK；
[0015] SEQ ID N0.4：MVSEALNSLAADLK；
[0016] SEQ ID N0.5：IISMQMGGNMK；
[0017] SEQ ID N0.6：ILDDVLDPAYVISSR；
[0018] SEQ ID N0.7：HFTSGGMAR；
[0019] SEQ ID N0.8：TQQQLIDDHFLFDRPVSR〇
[0020] 上述肽段1-8的m/z分别为：
[0021] 1102.0;536.8;603.3;731.4;605.3;559.3;482.2;739.0。
[0022]优选的，来源于major yolk proteinl蛋白的多肽片段，其序列为：
[0023] SEQ ID N0.9：AATTADDNTVIGNLLK；
[0024] SEQ ID N0.10:DFLLQPIMMQDPVMR;
[0025] SEQ ID NO.11：DYDSEYTVPVISR；
[0026] SEQ ID NO.12：EEITEMLTTILSER；
[0027] SEQ ID NO.13：IGSVFESVSR；
[0028] SEQ ID NO.14：QEITELLTTILEER；
[0029] SEQ ID NO.15：SFEAIIKPSTFDffffK；
[0030] SEQ ID N0.16：SVPNFHLPIGHLLSNGVIPR；
[0031] SEQ ID N0.17：TGDAFVSLR；
[0032] SEQ ID NO.18：VDEFTGIVGSLR；
[0033] SEQ ID N0.19:YLNPIWLSPTFK。
[0034] 上述肽段9-19的m/z分别为：
[0035] 837·4;917·5;772·4;832·9 ;540·8;844·5;619·0;723·1 ;483·3;646·8;739·9。
[0036]优选的，来源于major yolk protein2蛋白的多肽片段，其序列为：
[0037] SEQ ID NO 20：ETDPNTIIGNLLMDYDSEYTVPLITK；
[0038] SEQ ID NO.21：IFSDAQNNEDQYHIFGSASIFAPETVK；
[0039] SEQ ID N0.22：MYPVPLNMQTHPTYLGSR；
[0040] SEQ ID N0.23：QGVGNSHEPFYGNEGALR；
[0041] SEQ ID N0.24：VDEFTGIVGSLR；
[0042] SEQ ID N0.25：VESFHLPVGR；
[0043] SEQ ID N0.26：VISVGTTENK；
[0044] SEQ ID N0.27:WLTPTYPEFLDTMK。
[0045] 上述肽段20-27的m/z分别为：
[0046] 985.8；1010.1；1053.0；644.6；646.8；380.9；524.3；789.4〇
[0047]优选的，来源于Tropomyosin蛋白的多肽片段，其序列为：
[0048] SEQ ID N0.28：ADIAEESLK；
[0049] SEQ ID NO.29：EELHQLHNNVK；
[0050] SEQ ID N0.30：MSELETQVMSSK；
[0051] SEQ ID N0.31：QLETELDDTSEK；
[0052] SEQ ID N0.32：SAAFESSLSQMK；
[0053] SEQ ID N0.33:TSLDQLEDELMIEK。
[0054] 上述肽段28-33的m/z分别为：
[0055] 488·3;454·2;685·3;469·9 ;429·2;555·3。
[0056] 优选的，来源于 profi 1 in、heat shock cognate 70、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、melanotransferrin和Cu_Zn superoxide dismutase的蛋白多 肽片段，其序列为：
[0057] SEQ ID NO.34：ANDNEVLAK；
[0058] SEQ ID NO.35：IQPAEITALIAGFK；
[0059] SEQ ID N0.36：AASSTSLQSILGYTEDQVVSQDFR；
[0060] SEQ ID N0.37：VIDLILYMAK；
[0061] SEQ ID N0.38：EGGADLITLDGGDVFR；
[0062] SEQ ID N0.39：DAGVISGLQVLR；
[0063] SEQ ID NO. 40 ：NWDDPAVQK；
[0064] SEQ ID N0.41：SLVVHEGVDDLGR〇
[0065] 上述肽段34-41的m/z分别为：
[0066] 487·3;491·3;868·1;589·8 ;817·9;614·4;536·8;698·4。
[0067] 本发明还涉及一种检测刺参的方法，所述方法包括如下步骤：
[0068] (1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
[0069] (2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的刺参成分。
[0070] 所述的质谱前处理步骤如下：
[0071] (1)称取1 g海参样品均质成粉末状态，加入1 OmL蛋白提取液(8Μ尿素，50mMNH4HC03) 震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200ul转移到lml EP管中；
[0072] (2)取2yL lmol/L DTT加入到100yL上述蛋白溶液中37°C反应1小时；
[0073] (3)取10yL现配的lmol/L的IAA(配置过程需避光，现用现配)加入到已经冷却至室 温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
[0074] (4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上 层，转移至新的EP管中；
[0075] (5)再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；
[0076] (6)取5ul Trypsin酶溶液（1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37°C 酶解16-18小时；
[0077] (7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。
[0078] 所述的质谱法检测为，采用AB SCIEXTripleTOF?5600检测，
[0079] 流动相A: 0 · 1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0 · 1 %甲酸-水，
[0080]流速：0.25mL/min，
[0081 ] T0F扫描范围：350-1500Da，
[0082] 正离子反应模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0083] 采用AB SCIEX三重四级杆检测，
[0084] 流动相A: 0 · 1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0 · 1 %甲酸-水，
[0085] 流速：0.3mL/min，
[0086] 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温 度:475°C;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
[0087] 所述的分析样本中的刺参成分为，将待测样品的质谱结果对比所述刺参蛋白的低 同源性多肽片段(特征多肽)的标准质谱谱图，出现所述刺参蛋白的低同源性多肽片段的质 谱检测谱图时，即可判断该组织样本为刺参样本。
[0088]优选的，所述的刺参蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽)为SEQ ID NO. 1~41所 示的各条特异性多肽。
[0089] 本发明还涉及使用上述刺参蛋白的独有特征多肽鉴别刺参的方法以及使用所述 特征多肽制备获得的用于鉴别刺参的试剂/试剂盒等检测产品。
[0090] 本发明还涉及所述的特征多肽在制备用于鉴别刺参的试剂/试剂盒等检测产品中 的应用。
[0091 ]最后，虽然所述的蛋白或特征多肽的部分有植物或细菌等物种和其一致，但仅对 比梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参等海参属种时，所述特征多肽是刺参独有的。
【附图说明】
[0092] 图 1，GTSGEFTESVGGVYDISNLDR 色谱图
[0093] 图 2，GESIDDLVPK 色谱图
[0094] 图 3，DDFPNFEGHK 色谱图
[0095] 图 4，MVSEALNSLAADLK 色谱图
[0096] 图5，IISMQMGGNMK 色谱图
[0097] 图6，ILDDVLDPAYVISSR 色谱图
[0098] 图7，HFTSGGMAR 色谱图
[0099] 图8，TQQQLIDDHFLFDRPVSR 色谱图
[0100] 图9，AATTADDNTVIGNLLK 色谱图
[0101] 图 10，DFLLQPIMMQDPVMR 色谱图
[0102] 图 11，DYDSEYTVPVISR 色谱图
[0103] 图 12，EEITEMLTTILSER 色谱图
[0104] 图 13，IGSVFESVSR 色谱图
[0105] 图 14，QEITELLTTILEER 色谱图
[0106] 图 15，SFEAIIKPSTn)WWK 色谱图
[0107] 图 16，SVPNFHLPIGHLLSNGVIPR 色谱图
[0108] 图 17，TGDAFVSLR 色谱图
[0109] 图 18，VDEFTGIVGSLR 色谱图
[0110] 图 19，YLNPIWLSPTFK 色谱图
[0111] 图 20，ETDPNTIIGNLLMDYDSEYTVPLITK 色谱图
[0112] 图 21，IFSDAQNNEDQYHIFGSASIFAPETVK 色谱图
[0113] 图 22，MYPVPLNMQTHPTYLGSR 色谱图
[0114] 图 23，QGVGNSHEPFYGNEGALR 色谱图
[0115] 图 24，VDEFTGIVGSLR 色谱图
[0116] 图 25，VESFHLPVGR 色谱图
[0117] 图 26，VISVGTTENK 色谱图
[0118] 图 27，WLTPTYPEFLDTMK 色谱图
[0119] 图 28，ADIAEESLK 色谱图
[0120] 图 29，EELHQLHNNVK 色谱图
[0121] 图 30，MSELETQVMSSK 色谱图
[0122] 图 31，QLETELDDTSEK 色谱图
[0123] 图 32，SAAFESSLSQMK 色谱图
[0124] 图 33，TSLDQLEDELMIEK 色谱图
[0125] 图 34，ANDNEVLAK 色谱图
[0126] 图 35，IQPAEITALIAGFK 色谱图
[0127] 图 36，AASSTSLQSILGYTEDQWSQDFR色谱图
[0128] 图 37，VIDLILYMAK 色谱图
[0129] 图 38，EGGADLITLDGGDVFR 色谱图
[0130] 图 39，DAGVISGLQVLR 色谱图
[0131] 图 40，NWDDPAVQK 色谱图
[0132] 图 41，SLVVHEGVDDLGR 色谱图
【具体实施方式】
[0133] 实施例1，特异性多肽的序列来源和比对信息
[0134] 1 ·所述刺参独有的多肽均来自于蛋白Arginine Kinase [Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi |4586462。经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.1：GTSGEFTESVGGVYDISNLDR；SEQ ID N0.2：GESIDDLVPK；SEQ ID NO.3：DDFPNFEGHK；SEQ ID N0.4：MVSEALNSLAADLK；SEQ ID N0.5：IISMQMGGNMK；SEQ ID N0.6：ILDDVLDPAYVISSR； SEQ ID N0.7:HFTSGGMAR;SEQ ID N0.8:TQQQLIDDHFLFDRPVSR在刺参中确实存在，且峰形 好，强度高。
[0135] 图1是多肽GTSGEFTESVGGVYDISNLDR在刺参中的色谱图，其m/z为1102.0。
[0136]
[0137] 图2是多肽GESIDDLVPK在刺参中的色谱图，其m/z为536.8。
[0138] 图3是多肽DDFPNFEGHK在刺参中的色谱图，其m/z为603.3。
[0139] 图4是多肽MVSEALNSLAADLK在刺参中的色谱图，其m/z为731.4。
[0140] 图5是多肽113]\^?^應1(在刺参中的色谱图，其111/2为605.3。
[0141] 图6是多肽ILDDVLDPAYVISSR在刺参中的色谱图，其m/z为559.3。
[0142] 图7是多肽班^5661^1?在刺参中的色谱图，其111/2为482.2。
[0143] 图8是多肽TQQQLIDDHFLFDRPVSR在刺参中的色谱图，其m/z为739.0。
[0144] 2.经过质谱分析，多肽SEQ ID NO. 1~8在梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参中 不存在。
[0145] 实施例2,特异性多肽的序列来源和比对信息
[0146] 1 ·所述刺参独有的多肽均来自于蛋白major yolk proteinl [Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi I 240846031。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO .9：AATTADDNTVIGNLLK；SEQ ID NO.10：DFLLQPIMMQDPVMR；SEQ ID NO .11： DYDSEYTVPVISR；SEQ ID NO.12：EEITEMLTTILSER；SEQ ID NO.13：IGSVFESVSR；SEQ ID NO. 14：QEITELLTTILEER；SEQ ID NO.15：SFEAIIKPSTFDffffK；SEQ ID NO .16： SVPNFHLPIGHLLSNGVIPR；SEQ ID NO.17：TGDAFVSLR；SEQ ID NO.18：VDEFTGIVGSLR；SEQ ID NO. 19: YLNPIWLSPTFK在刺参中确实存在，且峰形好，强度高。
[0147] 图9是多肽AATTADDNTVIGNLLK在刺参中的色谱图，其m/z为837.4。
[0148] 图10是多肽0?11^?1丽〇0?￥11?在刺参中的色谱图，其111/2为917.5。
[0149] 图11是多肽DYDSEYTVPVISR在刺参中的色谱图，其m/z为772.4。
[0150] 图12是多肽EE ITEMLTTILSER在刺参中的色谱图，其m/z为8 3 2.9。
[0151] 图13是多肽IGSVFESVSR在刺参中的色谱图，其m/z为540.8。
[0152] 图14是多肽QEITELLTTILEER在刺参中的色谱图，其m/z为844.5。
[0153] 图15是多肽SFEAIIKPSTFDWWK在刺参中的色谱图，其m/z为619.0。
[0154] 图16是多肽SVPNFHLPIGHLLSNGVIPR在刺参中的色谱图，其m/z为723.1。
[0155] 图17是多肽了60六?￥31^在刺参中的色谱图，其111/2为483.3。
[0156] 图18是多肽VDEFTGIVGSLR在刺参中的色谱图，其m/z为646.8。
[0157] 图19是多肽YLNPIWLSPTFK在刺参中的色谱图，其m/z为739.9。
[0158] 2.经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.9~19在梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参中 不存在。
[0159] 实施例3,特异性多肽的序列来源和比对信息
[0160] 1 ·上述刺参独有的多肽均来自于蛋白major yolk protein2[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi I 240846033。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO.20：ETDPNTIIGNLLMDYDSEYTVPLITK；SEQ ID NO.21：IFSDAQNNEDQYHIFGSASIFAPETVK；SEQ ID N0.22:MYPVPL匪QTHPTYLGSR;SEQID N0.23:QGVGNSHEPFYGNEGALR;SEQ ID N0.24: VDEFTGIVGSLR；SEQ ID NO.25：VESFHLPVGR；SEQ ID NO.26：VISVGTTENK；SEQ ID NO.27： WLTPTYPEFLDTMK在刺参中确实存在，且峰形好，强度高。
[0161] 图20是多肽ETDPNTIIGNLLMDYDSEYTVPLITK在刺参中的色谱图，其m/z为985.8。
[0162] 图21 是多肽IFSDAQNNEDQYHIFGSASIFAPETVK在刺参中的色谱图，其m/z为 1010.1。
[0163] 图22是多肽MYPVPLNMQTHPTYLGSR在刺参中的色谱图，其m/z为1053.0。
[0164] 图23是多肽〇6￥6吧冊??￥6呢6六1^在刺参中的色谱图，其111/2为644.6。
[0165] 图24是多肽VDEFTGIVGSLR在刺参中的色谱图，其m/z为646.8。
[0166] 图25是多肽VESFHLPVGR在刺参中的色谱图，其m/z为380.9。
[0167] 图26是多肽VISVGTTENK在刺参中的色谱图，其m/z为524.3。
[0168] 图27是多肽WLTPTYPEFLDTMK在刺参中的色谱图，其m/z为789.4。
[0169] 2.经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.20~27在梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参 中不存在。
[0170] 实施例4,特异性多肽的序列来源和比对信息
[0171 ] 1 ·上述刺参独有的多肽均来自于蛋白Tropomyosin [Apostichopus japonicus]， 其在NCBI上的Accesion number是gi I 302340969。经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.28: ADIAEESLK；SEQ ID NO.29：EELHQLHNNVK；SEQ ID NO.30：MSELETQVMSSK；SEQ ID NO.31： QLETELDDTSEK;SEQ ID N0.32:SAAFESSLSQMK;SEQ ID N0.33:TSLDQLEDELMIEK在刺参中确 实存在，且峰形好，强度高。
[0172] 图28是多肽ADIAEESLK在刺参中的色谱图，其m/z为488.3。
[0173] 图29是多肽EELHQLHNNVK在刺参中的色谱图，其m/z为454.2。
[0174] 图30是多肽MSELETQVMSSK在刺参中的色谱图，其m/z为685.3。
[0175] 图31是多肽QLETELDDTSEK在刺参中的色谱图，其m/z为469.9。
[0176] 图32是多肽SAAFESSLSQMK在刺参中的色谱图，其m/z为429.2。
[0177] 图33是多肽TSLDQLEDELMIEK在刺参中的色谱图，其m/z为555.3。
[0178] 2.经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.28~33在梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参 中不存在。
[0179] 实施例5,特异性多肽的序列来源和比对信息
[0180] 1.上述刺参多肽SEQ ID N0.34:ANDNEVLAK和SEQ ID N0.35:IQPAEITALIAGFK来自 于蛋白 profi 1 in[Apostichopus japonicus]，其在 NCBI 上的 Accesion number 是 gi 407894519。经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.34:ANDNEVLAK和SEQ ID N0.35: IQPAEITALIAGFK在刺参中确实存在，且峰形好，强度高。
[0181] 图34是多肽六勵呢￥1^1(在刺参中的色谱图，其111/2为487.3。
[0182] 图35是多肽IQPAEITALIAGFK在刺参中的色谱图，其m/z为491.3。
[0183] 2·上述刺参多肽SEQIDN0·36:AASSTSLQSILGYTEDQVVSQDFR和SEQIDN0·37 : VIDLILYMAK来自于蛋白 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi I 334821165。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO · 36: AASSTSLQSILGYTEDQVVSQDFR和SEQ ID NO · 37: VIDLILYMAK在刺参中确实存在，且峰 形好，强度高。
[0184] 图36是多肽AASSTSLQSILGYTEDQVVSQDFR在刺参中的色谱图，其m/z为868.1。
[0185] 图37是多肽VIDLILYMAK在刺参中的色谱图，其m/z为589.8。
[0186] 3.上述刺参多肽 SEQ ID N0.38:EGGADLITLDGGDVFR 来自于蛋白 me lano transferrin [Apostichopus japonicus]，其在 NCBI 上的 Accesion number 是 gi 309385780。经过质谱分析，多肽SEQ ID NO. 38:EGGADLITLDGGDVFR在刺参中确实存在，且峰 形好，强度高。
[0187] 图38是多肽EGGADLITLDGGDVFR在刺参中的色谱图，其m/z为817.9。
[0188] 4.上述刺参多肽SEQ ID N0.39:DAGVISGLQVLR和SEQ ID N0.40:NWDDPAVQK来自于 蛋白heat shock cognate 70[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number 是gi|338201102。经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.39:DAGVISGLQVLR和SEQ ID N0.40: NWDDPAVQK在刺参中确实存在，且峰形好，强度高。
[0189] 图39是多肽046￥1361^￥1^在刺参中的色谱图，其111/2为614.4。
[0190] 图40是多肽NWDDPAVQK在刺参中的色谱图，其m/z为536.8。
[0191] 5.上述刺参多肽SEQ ID N0.41: SLVVHEGVDDLGR来自于蛋白 Cu-Zn superoxide dismutase[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi | 451844586。 经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.41 :SLVVHEGVDDLGR在刺参中确实存在，且峰形好，强度高。
[0192] 图41是多肽3^册6￥001^1?在刺参中的色谱图，其111/2为698.4。
[0193] 6.经过质谱分析，多肽SEQ ID N0.34~41在梅花参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参 中不存在。
[0194] 实施例6，海参样本处理及检测步骤
[0195] 对待测海参样本进行分析的步骤包括
[0196] ( - )样本前处理步骤：
[0197] (1)称取lg海参样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HC0 3) 震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200ul转移到lml EP管中；
[0198] (2)取2yL lmol/L DTT加入到100yL上述蛋白溶液中37°C反应1小时；
[0199] (3)取10yL现配的lmol/L的IAA(配置过程需避光）加入到已经冷却至室温的上述 反应液中，室温避光反应1小时；
[0200] (4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用200yL 50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗 滤膜上层，转移至新的EP管中；
[0201] (5)再加入200yL碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；
[0202] (6)取5ul Trypsin酶溶液（1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37°C 酶解16-18小时；
[0203] (7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。
[0204] (二）上机检测，
[0205] 采用AB SCIEX TripleTOF?5600检测，
[0206] 流动相A: 0 · 1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0 · 1 %甲酸-水，
[0207] 流速:0.25mL/min，
[0208] T0F扫描范围：350-1500Da，
[0209] 正离子反应模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0210] 采用AB SCIEX三重四级杆检测，
[0211] 流动相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0.1 %甲酸-水，
[0212] 流速:0.3mL/min，
[0213] 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温 度:475°C;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
[0214] 检测结果对比实施例1-5中的各条特异性多肽的质谱谱图，出现实施例1-5所述质 谱检测谱图时，即可判断该组织样本为刺参样本。
[0215] 经进一步鉴定，所述肽段为刺参专有肽段，在其他海地瓜、墨西哥参、美国肉参、梅 花参等不同海参品种中未见表达。
[0216]最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质， 并不用作对本发明保护范围的限定。
【主权项】
1. 一组通过单独使用或任意组合使用对刺参(Apostichopus japonicus)进行鉴别的 特征多肽，所述特征多肽为刺参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该 肽段为刺参独有的，且长度在5~30个氨基酸的多肽片段，所述的刺参蛋白选自刺参中的如 下蛋白： (1) Arginine Kinase蛋白； (2) major yolk proteinl蛋白或major yolk protein2蛋白； (3) Tropomyosin 蛋白； (4) 其他刺参特异性较高的蛋白，包括但不限于:profilin蛋白、heat shock cognate 70蛋白、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase蛋白、melanotransferrin蛋白或 Cu-Znsuperoxide dismutase蛋白。2. 根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述的特征多肽的序列为： 来源于Arginine Kinase蛋白的多肽片段，其序列为： SEQ ID N0.1：GTSGEFTESVGGVYDISNLDR； SEQ ID N0.2：GESIDDLVPK； SEQ ID N0.3：DDFPNFEGHK； SEQ ID N0.4：MVSEALNSLAADLK； SEQ ID N0.5：IISMQMGGNMK； SEQ ID N0.6：ILDDVLDPAYVISSR； SEQ ID N0.7：HFTSGGMAR； SEQ ID N0.8：TQQQLIDDHFLFDRPVSR； 来源于major yolk proteinl蛋白的多肽片段，其序列为： SEQ ID N0.9：AATTADDNTVIGNLLK； SEQ ID N0.10:DFLLQPIMMQDPVMR; SEQ ID N0.11：DYDSEYTVPVISR； SEQ ID N0.12：EEITEMLTTILSER； SEQ ID N0.13：IGSVFESVSR； SEQ ID N0.14：QEITELLTTILEER； SEQ ID N0.15：SFEAIIKPSTFDffffK； SEQ ID N0.16：SVPNFHLPIGHLLSNGVIPR； SEQ ID N0.17：TGDAFVSLR； SEQ ID N0.18：VDEFTGIVGSLR； SEQ ID NO.19：YLNPIffLSPTFK； 来源于major yolk protein2蛋白的多肽片段，其序列为： SEQ ID NO 20：ETDPNTIIGNLLMDYDSEYTVPLITK； SEQ ID N0.21：IFSDAQNNEDQYHIFGSASIFAPETVK； SEQ ID N0.22：MYPVPLNMQTHPTYLGSR； SEQ ID N0.23：QGVGNSHEPFYGNEGALR； SEQ ID NO.24：VDEFTGIVGSLR； SEQ ID N0.25：VESFHLPVGR； SEQ ID N0.26：VISVGTTENK； SEQ ID N0.27：ffLTPTYPEFLDTMK； 来源于Tropomyosin蛋白的多肽片段，其序列为： SEQ ID N0.28：ADIAEESLK； SEQ ID N0.29：EELHQLHNNVK； SEQ ID N0.30：MSELETQVMSSK； SEQ ID N0.31：QLETELDDTSEK； SEQ ID N0.32：SAAFESSLSQMK； SEQ ID N0.33：TSLDQLEDELMIEK； 来源于prof i I in、heat shock cognate 70、glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase、meIanotransferrin和Cu-Zn superoxide dismutase的蛋白多肽片段，其 序列为： SEQ ID N0.34：ANDNEVLAK； SEQ ID N0.35：IQPAEITALIAGFK； SEQ ID N0.36：AASSTSLQSILGYTEDQVVSQDFR； SEQ ID N0.37：VIDLILYMAK； SEQ ID N0.38：EGGADLITLDGGDVFR； SEQ ID NO.39：DAGVISGLQVLR； SEQ ID N0.40：NWDDPAVQK； SEQ ID N0.41：SLVVHEGVDDLGR〇3. 根据权利要求2所述特征多肽，其特征在于，所述的SEQ ID NO. I~41的多肽片段的 m/z依次分别为： 肽段1-8的m/z分别为： 1102.0；536.8；603.3；731.4；605.3；559.3；482.2；739.0； 肽段9-19的m/z分别为： 837.4；917.5；772.4；832.9；540.8；844.5；619.0；723.1；483.3；646.8；739.9； 肽段20-27的m/z分别为： 985.8；1010.1；1053.0；644.6；646.8；380.9；524.3；789.4； 肽段28-33的m/z分别为： 488.3；454.2；685.3；469.9；429.2；555.3； 肽段34-41的m/z分别为： 487·3;491·3;868·1;589·8;817·9 ;614·4;536·8;698·4。4. 一种检测刺参的方法，所述方法包括如下步骤： (1) 对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液： (2) 通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的刺参成分。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理步骤如下： (1) 称取海参样品均质成粉末状态，加入蛋白提取液(8Μ尿素，50mM NH4HCO3)震荡提取 蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中； (2) 取DTT加入到上述蛋白溶液中，37 °C反应1小时； (3) 取现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时； (4) 采用IOK滤膜超滤30分钟，使用碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层，转移至新的EP管 中； (5) 再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取； (6) 取Tryps in酶溶液加入到上述蛋白溶液，中37 °C酶解16-18小时； (7) 采用IOK滤膜超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为： 采用AB SCIEXTri_T〇F?5600检测， 流动相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0.1 %甲酸-水， 流速:〇 · 25mL/min， TOF扫描范围：350-1500Da， 正离子反应模式，GSl: 35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100，CE: 10。7. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述质谱法检测为： 采用AB SCIEX三重四级杆检测， 流动相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0.1 %甲酸-水， 流速:〇.3mL/min， 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度： 475°C;鞘气压力:40;辅助气压力:6。8. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的分析样本中的刺参成分为，将待 测样品的质谱结果对比SEQ ID NO. 1~41的各条特异性多肽的质谱谱图，出现与SEQ ID NO. 1~41的各条特异性多肽的质谱检测谱图相同的谱图时，即可判断该组织样本为刺参样 本。9. 权利要求1-3任一所述的特征多肽在制备用于鉴别刺参的试剂/试剂盒等检测产品 中的应用。10. 包含权利要求1-3任一所述的特征多肽的用于鉴别刺参的试剂/试剂盒等检测产 品。
【文档编号】G01N27/62GK106008688SQ201610305474
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】张鸿伟, 张晓梅, 鲍蕾, 梁成珠, 徐彪
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心