一种巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法
【专利摘要】本发明公开了一种巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法。其主要步骤为：先在水中加入玉米淀粉、豆粕粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和氯化钙，调整pH值后灭菌处理，在121～123℃温度条件下灭菌处理，冷却到35℃左右接入巨大芽孢杆菌种，发酵20小时，制得对数期巨大芽孢杆菌发酵液，然后将发酵液接入固体培养载体中，固体培养载体为玉米粉、豆粕粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌，混合均匀，调整含水量，置于固体发酵罐罐内，通入无菌空气，无菌保湿培养48～60小时，待显微镜观察发现有80％以上的芽孢脱落，终止发酵，然后向发酵罐通入60℃的蒸汽进行低温干燥，直至固体载体的含水量在5％以下，粉碎固体载体，粉碎粒度200目，制成芽孢杆菌产品，调配，达到每克产品含孢子≥100亿。CGMCC No 125920041206
【专利说明】
一种巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法，属于微生物添加剂发酵生产领域。
【背景技术】
[0002]近年来，微生物发酵制剂已广泛应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域中。美国食品药品管理局公布的饲用微生物菌种包括芽孢杆菌属的有凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等五种。由于芽孢杆菌属于细菌类，具有丰富、多功能酶活性，抗病、促长、抗逆性强，适宜加工与储藏等优点，是目前国内外研究开发的重点，具有十分重要的生产应用价值和广阔的市场前景。
[0003]目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术。(郝林华等，2016，上海交通大学学报24
[4]:380-394)，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂，能耗较大，产生污染物。而固体发酵采用的原料一般是廉价的草粉、麸皮等农副产品，采用的设备也较液体发酵简单，生产成本低于液体发酵。单纯固体发酵存在发酵效率比较低。所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，并有少数生产厂家开始试探性生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的:提供一种巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法，具体为一种固液两相深层发酵新工艺生产巨大芽孢杆菌制剂的方法。
[0005]本发明的技术方案:
[0006]采用液固结合的工艺发酵生产巨大芽孢杆菌，本发明所培养菌种已在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(保藏登记号= CGMCC No 1259)，保藏日期:2004年12月6日，地址:北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，分类命名:巨大芽抱杆菌BaciIIus megaterium。
[0007]该技术方案主要包括以下步骤:
[0008](I)制备对数期巨大芽孢杆菌发酵液
[0009]先在水中加入玉米淀粉、豆柏粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和氯化钙，水与玉米淀粉、豆柏粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和氯化钙质量比为100:4?6: 2?3:0.1?0.3:
0.2:0.3?0.5:0.2。调整pH值后灭菌处理，使用食碱调整pH为7.3?7.5灭菌处理在121?123°C温度条件下灭菌处理30分钟，冷却到35°C左右接入巨大芽孢杆菌种，发酵20小时，制得对数期巨大芽孢杆菌发酵液。
[0010](2)制备固体固体培养基
[0011]称取玉米粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌，玉米粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌的质量比为100:2?3:50、0.1?0.3:0.2:0.2，混合均匀，调整含水量为80?85%，置于固体发酵罐罐内，装约40?80厘米高度。其中疏松剂由稻壳粉和玉米秸杆粉组成，稻壳粉:玉米秸杆粉质量比1:1。
[0012](3)固体发酵及产品生产
[0013]将步骤(I)制备的对数期发酵液转入步骤(2)制备的固体培养载体中，对数期发酵液加入量为10%，通入无菌空气，无菌保湿培养48-60小时，待显微镜观察发现有80%以上的芽孢脱落，终止发酵。后发酵罐通入60 V的蒸汽进行低温干燥，直至固体载体的含水量在5%以下，粉碎固体载体，粉碎粒度200目，制成芽孢杆菌产品，调配，达到每克产品含孢子多100 亿。
[0014]本发明的优点:
[0015]本发明所述巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法，不仅结合液体发酵和固体发酵的优点，采用液、固两相工艺，克服两者主要缺点，而且并通过固体发酵配方优化，提高芽孢杆菌生产效率，降低生产成本，实现清洁生产，本发明利于巨大芽孢杆菌实现优质高产，满足市场需求。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
[0017]实施例1
[0018](I)制备对数期巨大芽孢杆菌发酵液，在10kg纯净水中加入4?6kg玉米淀粉、2?3kg豆柏粉、0.1?0.3kg磷酸二氢钾、0.2kg硫酸镁、0.3?0.5kg氯化钠和0.2kg氯化钙，以食碱调整混合体的PH值为7.3?7.5，在121°C?123°C温度环境下灭菌处理30分钟，冷却至35±1°C，接入中国微生物菌种保藏登记号为GMCC No 1259的巨大芽孢杆菌菌种，在32°C?34°(:温度条件下发酵20小时，制得对数期的巨大芽孢杆菌发酵液。
[0019](2)制备固体培养基，称取玉米粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌，玉米粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌的质量比为100: 2?3: 50:0.1-0.3:
0.2:0.2，混合均勾，将10kg玉米粉与2?3kg豆柏粉、5?6kg稻壳粉、0.1?0.3kg磷酸氢二钾、0.2kg硫酸镁和0.2kg硫酸锌，混合均匀，加入纯净水，调整含水量为80 %，置于固体发酵罐罐内，装约40?80厘米高度。其中疏松剂由稻壳粉和玉米秸杆粉组成，稻壳粉:玉米秸杆粉质量比1:1。
[0020](3)将步骤(I)制备的对数期发酵液转入步骤(2)制备的固体培养基中，每10kg固体培养基加入1kg对数期发酵液，通入无菌空气，无菌保湿培养48-60小时，待显微镜观察发现有80%以上的芽孢脱落，终止发酵。后发酵罐通入60°C的蒸汽进行低温干燥，直至固体载体的含水量在5%以下，粉碎固体载体，粉碎粒度200目，制成芽孢杆菌产品，调配，达到每克产品含孢子多100亿。
【主权项】
1.一种巨大芽孢杆菌制剂发酵的方法，其特征在于，采用液固结合工艺发酵生产巨大芽孢杆菌，该方法包括以下步骤: (1)制备对数期巨大芽孢杆菌发酵液:先在水中加入玉米淀粉、豆柏粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和氯化钙，调整PH值为7.3?7.5后灭菌处理，冷却到35°C左右接入巨大芽孢杆菌种，发酵，制得对数期巨大芽孢杆菌发酵液； (2)制备固体固体培养基:称取玉米粉、豆柏粉、疏松剂(稻壳粉与玉米秸杆分按照质量I: I混合)、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌，混合均匀，调整含水量为80?85 %，置于固体发酵罐罐内，装约40?80厘米高度； (3)固体发酵及产品生产:将步骤(I)制备的对数期发酵液转入步骤(2)制备的固体培养载体中，对数期发酵液加入量10 %，通入无菌空气，无菌保湿培养48-60小时，待显微镜观察发现有80%以上的芽孢脱落时，终止发酵，通入60°C蒸汽低温干燥，直至固体载体含水量5%以下，粉碎固体载体，制成芽孢杆菌产品，调配，达到每克产品含孢子多100亿。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中水与玉米淀粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠和氯化钙质量比为100:4?6:50:2?3:0.1?0.3:0.2:0.3?0.5:0.2o3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中用食碱调整pH，灭菌处理在121?123°C温度条件下灭菌处理30分钟，发酵20小时。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中玉米粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌，玉米粉、豆柏粉、疏松剂、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌的质量比为100: 2?3:50、0.1?0.3:0.2:0.2。且疏松剂由稻壳粉与玉米秸杆分按照质量1:1混合而成。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中粉碎固体载体，粉碎粒度200目。
【文档编号】C12R1/11GK106010995SQ201610013009
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年1月7日
【发明人】赵国琦, 戴怡, 张艳云, 霍永久, 余同水, 贡笑笑, 詹康
【申请人】扬州大学, 扬州市瑞怡生物科技有限公司