一种可降解农产品废弃物的复合微生物菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合微生物菌剂，它的活性成分是从昆虫肠道中分离出的以下菌株的一种或多种：鞘脂杆菌(Sphingobacterium sp.)HP455，芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)HP181、产碱假单胞菌(Pseudomonas sp.)HP207、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)BD177、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)BD195。该复合菌剂可显著促进农作物生长，提高作物苗期抗病，抗盐，抗冻等抵抗环境胁迫能力，增加作物生长发育早期的存活率。CCTCC NO:M201561920151020 CCTCC NO:M201561820151020 CCTCC NO:M201562020151020 CCTCC NO:M201562120151020 CCTCC NO:M201562220151020
【专利说明】
-种可降解农产品废弃物的复合微生物菌剂
技术领域
[0001] 本发明属于微生物菌剂领域，具体设及一种可降解农业废弃物的复合微生物菌 剂。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的高速发展和农村生产生活方式的不断转变，农业和农村中的农作 物废弃物越来越多，废弃物的处理压力日益增大。一方面，不合理的缺乏科学性的处理农作 物废弃物会造成严重的环境污染，比如焚烧作物賴杆，废弃蔬果的随意丢弃，禽畜废弃物的 不当处理等等。特别是賴杆焚烧对空气造成的污染，已经成为城市空气污染的重要原因之 一，雾靈、PM2.5已经成为社会关注的焦点。另一方面，我国农田有机质缺乏，制约着耕地生 产力，对化肥的高度依赖性，急需有机物质循环投入，因此农作物废弃物降解处理显得尤为 重要。
[0003] 昆虫肠道中栖息着大量的微生物，运些微生物对寄主的生长、发育、致病和环境适 应方面有着重要的影响，它们既参与物质代谢，为寄主提供营养物质，同时还帮助寄主抵御 外来微生物的入侵。植食性昆虫肠道微生物的功能至少有W下两方面:一是营养物质的生 物合成，一是生物质的解聚。白蚁之所W能W木材为食，就是因为它的肠道微生物可W降解 大分子纤维素，并转化成营养。因此昆虫肠道中存在大量可W利用富含纤维素、木聚糖等的 植物作为能量来源的微生物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于利用来源于昆虫肠道的微生物，提供一种可降解农业废弃物的 复合微生物菌剂，从而减少环境污染。
[0005] 本发明通过W下技术方案实现：
[0006]
【申请人】首先从植食性昆虫的肠道中分离出五种微生物，经鉴定分别命名为銷脂杆 菌（5地;[叫06日。161'；[1111139.)册455、芬氏纤维微菌（〔61111103；[111；[。1'013；[1111139.)册181、产碱 假单胞菌(Pseudomonas sp. )HP207、产酸克雷伯氏菌化lebsiella 0巧toca)抓177、柯氏巧 樣酸杆菌(Citrobacter koseri)抓195,运五种微生物对农业废弃物均有一定的降解能力。
[0007] 然后，利用运五种微生物制备得到可降解农产品废弃物的复合微生物菌剂，其活 性成分为上述菌株的一种或多种。该复合微生物菌剂还包括载体，所述载体为麦教、稻壳、 麦壳、酒糟、壳聚糖、银末、菌渣、草木灰、甘薦渣、果皮渣、賴杆、禽畜粪便中的一种或多种。 [000引紧接着，
【申请人】还提供了一种賴杆降解复合微生物菌剂，其活性成分为上述菌种 中的芬氏纤维微菌HP181和产碱假单胞菌HP207。
【申请人】对该复合菌剂进行了賴杆降解试 验，结果表明：复合菌剂对賴杆的降解能力远高于单一菌种。
[0009]最后，
【申请人】还利用W上五种微生物制备了可促进作物生长的复合菌剂，该复合 菌剂是按W下方法制备的：将100ml含銷脂杆菌HP455、芬氏纤维微菌HP181、产碱假单胞菌 HP207、产酸克雷伯氏菌抓177和柯氏巧樣酸杆菌抓195均为107~109CFU/ml的菌液与lOOg麦 教混合均匀，然后均匀的撒在lOOOg废弃相橘果上进行堆捂，发酵30天制得。试验结果表明： 该复合菌剂可显著促进农作物生长，提高作物苗期抗病，抗盐，抗冻等抵抗环境胁迫能力， 增加作物生长发育早期的存活率。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明进行详细地说明。
[0011] 实施例1菌株分离与鉴定
[0012] (1)昆虫肠道微生物的分离:挑取相橘大实蛹、相橘小实蛹、金龟甲、天牛、白蚁、黄 粉虫、水化等植食性昆虫的成虫或者幼虫，对虫体进行表面消毒处理，W排除外来微生物的 影响，解剖出完整肠道后放入装有300ul~500ul无菌水的无菌匀浆器，研磨充分后小屯、稀 释，涂NA平板进行可培养菌筛选。
[0013] (2)昆虫肠道微生物的鉴定:NA平板培养挑单菌落，接种于LB液体培养基中，28-37 °C恒溫培养12-4化。利用微生物学和分子生物学技术鉴定菌株的种类，并保藏备用。通过鉴 定从植食性昆虫的肠道内共获得五种菌株，分别为銷脂杆菌、芬氏纤维微菌、产碱假单胞 菌、产酸克雷伯氏菌和柯氏巧樣酸杆菌，该五种菌株均于2015年10月20日送交位于武汉市 武汉大学内的中国典型培养物保藏中屯、(CCTCC)进行保藏，各菌种的命名与保藏编号如下：
[0014] 銷脂杆菌（S地ingobacterium sp.)HP455,保藏编号为CCTCC N0:M2015618。
[001 引芬氏纤维微菌（Cellulosimicrobium sp. )HP181，保藏编号为 CCTCC NO: 12015619ο
[0016] 产碱假单胞菌（Pseudomonas sp.)HP207，CCTCC Ν0:Μ2015620。
[0017] 产酸克雷伯氏菌化166316113〇巧扣。曰)80177,0：了0：備:]\12015621。
[001 引 柯氏巧樣酸杆菌（Citrobacter koseri)BD195，CCTCC Ν0:Μ2015622。
[0019] 实施例2:降解賴杆的复合菌剂
[0020] 将已分离鉴定出的植食性昆虫肠道微生物芬氏纤维微菌ΗΡ181、产碱假单胞菌 ΗΡ207两者一同接种于富集培养基构建混合菌系，32°C、ll(K)r/min摇床培养2地。
[0021] 富集培养基的组分为:0.1 %酵母浸粉，0.5 %膜蛋白腺，0.5 % CaC〇3，0.5 %化C1， K出P〇4〇. 094g，拉册〇4〇. 19g，蒸馈水200ml，pH自然（约为7)。
[0022] 经检测，培养后的混合菌液在600nm处的0D值为0.6，其中含芬氏纤维微菌0.8~ 1.5 X l〇8c即/ml，含产碱假单胞菌0.9~1.7 X l〇8c即/ml，将该混合菌液按5% (v/v)的比例 接入賴杆降解培养基，35°C静置培养15d和30d，检测剩余賴杆的质量。
[002；3] 賴杆降解培养基的组分为：0 . 1 %酵母浸粉，0 . 5 % CaC〇3，0 . 5 % NaCl， Κ出P〇4〇. 094g，K2HPO40.19g，1 % 稻賴杆（长 1 cm)，蒸馈水200ml，pH 自然。
[0024] 賴杆降解率的测定方法:小屯、弃去培养液的上清，将剩余賴杆用稀盐酸反复冲洗 数次，再用无菌水反复冲洗，纱布过滤直至中性，6(TC烘干至恒重并称其质量，计算失重率。 另取单一的芬氏纤维微菌、产碱假单胞菌，按与混合菌液相同的方法进行操作，作为对照， 结果见表1。
[0025] 表1.賴杆降解情况
[0026]
[0027]实验结果表明：芬氏纤维微菌、产碱假单胞菌及其混合菌液均能明显降解賴杆，而 单一菌液的早期降解能力高于混合菌，混合菌液的后期降解能力更强，賴杆的降解失重率 可达到58 %。
[002引实施例3促进作物生长的复合菌剂
[0029] 1)复合菌剂的制备
[0030] 将芬氏纤维微菌HP181、产碱假单胞菌HP207、銷脂杆菌HP455、产酸克雷伯氏菌 抓177、柯氏巧樣酸杆菌抓195 W总共5% (v/v)的接入量接种于100ml LB液体培养基，30°C、 l(K)r/min摇床培养，使用分光光度计测量菌液在600nm处的0D值为0.5，经检测，菌液中含芬 氏纤维微菌0.2 X 10化即/ml、产碱假单胞菌0.7 X 108C即/ml、銷脂杆菌1.5 X 10化即/ml、产 酸克雷伯氏菌5.6 X 108CFU/ml、柯氏巧樣酸杆菌8.9 X 107CFU/ml。
[0031] 将上述100ml菌液与lOOg麦教充分混合均匀，然后将含有菌液的麦教均匀撒在 lOOOg废弃相橘果上进行堆捂，发酵30天后制得复合菌剂，该菌剂的有效活菌数>0.5亿个。
[0032] 2)复合菌剂的质量检测
[0033] 根据有机肥料的农业行业检测标准NY525-2012对复合菌剂进行检测，结果见表2。
[0034] 表2.复合菌剂的质量指标
[0035]
[0036] 3)复合菌剂对作物的促生长作用：
[0037] 称取复合菌剂200g和烘干的沙±2kg，加水揽拌充分混合，调节±壤湿度为65%， 溫度18-25Γ，并用未使用复合菌剂处理的废弃橘果30天自然降解产物作为对照进行盆栽 试验，品种为中双11的油菜苗作为试验材料，每个处理3盆，分别测量早起存活率和30天株 高，并进行统计分析，结果见表3。
[0038] 表3复合菌剂对油菜的促生生长作用
[0039]
[0040] 实验结果表明：复合菌剂可显著促进农作物生长，提高作物苗期抗病，抗盐，抗冻 等抵抗环境胁迫能力，增加作物生长发育早期的存活率。
【主权项】
1. 一种复合微生物菌剂，其特征在于:活性成分是从昆虫肠道中分离出的以下菌株的 一种或多种： 鞘脂杆菌（Sphingobacterium sp. )HP455,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号 为CCTCCN0:M2015618; 芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)HP181，保藏在中国典型培养物保藏中心，保 藏编号为CCTCC N0:M2015619; 产碱假单胞菌(Pseudomonas sp.)HP207,保藏在中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO: M2015620； 产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)BD177,保藏在中国典型培养物保藏中心， CCTCC NO:M2015621; 柯氏梓檬酸杆菌（Citrobacter koseri )BD195，保藏在中国典型培养物保藏中心， CCTCC NO:M2015622。2. 如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于:活性成分是芬氏纤维微菌HP181 和产碱假单胞菌HP207,所述复合微生物菌剂用于降解秸杆。3. 如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于:活性成分是鞘脂杆菌HP455、芬氏 纤维微菌HP181、产碱假单胞菌HP207、产酸克雷伯氏菌BD177和柯氏柠檬酸杆菌BD195,所述 复合微生物菌剂用于促进作物生长。4. 一种制备权利要求3所述复合微生物菌剂的方法，其特征在于:将100ml含鞘脂杆菌 HP455、芬氏纤维微菌HP181、产碱假单胞菌HP207、产酸克雷伯氏菌BD177和柯氏柠檬酸杆菌 BD195均为107~109CFU/ml的菌液与100g麦麸混合均匀，然后均匀的撒在1000g废弃柑橘果 上进行堆捂，发酵30天制得。
【文档编号】C12N1/20GK106011018SQ201610498520
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】张宏宇, 蔡朝辉, 圣平, 许婧
【申请人】华中农业大学