一株枯草芽孢杆菌菌株及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，属于环境微生物应用领域，该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CM?A12，现保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2015688，保藏日期为2015年11月23日。本发明提供的芽孢杆菌菌株培养条件简单，耐高温、耐酸碱、耐高盐，能够分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，并能有效改善水质，降低水体中的COD、氨氮。CCTCC NO:M 201568820151123
【专利说明】
-株枯草芽抱杆菌菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及环境微生物应用领域，尤其设及一株枯草芽抱杆菌菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着社会经济的发展，人口的增加，人们生活水平的不断提高，水资源的需求和消 耗不断增多，相应的城市污水和工业废水的排放量也在不断增多。但是污水处理设施的滞 后和污染控制不够得力，使得全球水资源正面临两大问题:水环境污染和水资源短缺。运在 一些国家和地区，尤其是包括中国在内的发展中国家，愈益严重并有加剧的趋势。为保障人 类社会经济的可持续发展，水环境保护和治理已成为当今社会的重大问题。
[0003] 在水环境保护和治理中，微生物起着举足轻重的作用，担任着"天然环境卫±"的 角色。其代谢类型具有多样性，在污染物的降解转化、资源的循环利用W及生态环境保护等 方面都具有巨大潜力。
[0004] 在应用于环境保护方面的微生物菌剂中，微生物的种类主要有酵母菌、乳酸菌、芽 抱杆菌和光合细菌等。其中芽抱杆菌在细胞内能形成对热、干燥、福射、化学药物等理化因 素具有很强抗逆性的芽抱，具有抵御不良环境条件的功能。除了生命力强，芽抱杆菌可产生 多种高活性的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等胞外水解酶类，分解 有机质的能力强，能将废水中一些难分解的大分子物质转化成可被自身利用的小分子物 质，分解产生恶臭气体的有机物，具有除臭的功能，同时还能有效分解水产养殖系统中沉积 的饲料、排泄物、动物残体等，促进养殖环境的物质循环和水质净化。
[0005] 例如：申请公布号为CN103011424A的中国发明专利申请文献公开了一种枯草芽抱 杆菌DS3在降解皂素废水有机污染物中的应用。该枯草芽抱杆菌DS3保藏于中国典型培养物 保藏中屯、，保藏号为CCTCC N0:M 2010146。该枯草芽抱杆菌DS3在高浓度硫酸根离子环境中 具有较强的生长能力和良好的去除皂素废水中有机污染物的能力，该菌株能在72小时之内 去除皂素废水中的(》0 215〇111旨/1，去除效率达到50.71%。
[0006] 但上述菌株仅针对于皂素废水有机污染物，其应用面相对较窄。因此，有必要筛选 出应用面更广，废水处理效果更佳的菌株，W提高菌株的推广价值。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种枯草芽抱杆菌菌株及其应用，该芽抱杆菌菌株培养条件简单， 耐高溫、耐酸碱、耐高盐，能够分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，有效改善水质，降低水体中的 COD、氨氮，是一种多功能菌株。
[000引一种枯草芽抱杆菌菌株，其特征在于，命名为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) CM-A12,保藏编号为CCTCC N0:M 2015688,保藏日期为2015年11月23日。
[0009]所述枯草芽抱杆菌菌株于2015年11月23日保藏在中国武汉市武汉大学的中国典 型培养物保藏中屯、（简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC N0:M 2015688,命名为枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)CM-A12。
[0010] 所述枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12的生物学特征为:菌落呈米黄色， 表面突起權皱，干燥无光泽;显微镜下菌株细胞为短杆菌。
[0011] 所述枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)CM-A12的 16S rDNA序列如沈Q ID N0.1 所示。
[0012] 本发明提供了一种枯草芽抱杆菌菌株的培养方法，该方法将所述的枯草芽抱杆菌 菌株活化后，接种到初始pH值为4~9、溫度为25~40°C、盐的质量浓度为0~14%的培养基 中培养。
[0013 ]本发明提供了 一种所述枯草芽抱杆菌菌株在水体修复或废水处理中的应用。
[0014] 具体地，所述水体为河道或湖泊;所述废水为生活污水、养殖废水、印染废水、食品 行业废水或造纸废水。
[0015] 所述枯草芽抱杆菌菌株在处理废水中的应用，包括:将所述的枯草芽抱杆菌菌直 接投加至水体或废水中进行生化处理;或者固定化后，再对水体或废水进行生化处理。
[0016] 所述枯草芽抱杆菌菌株可作为液体菌液或干粉菌剂，直接投加至水体或废水中； 所述固定化包括:将菌株固定化于微球中，或进行生物挂膜将菌株固定于填料上;废水经过 直接投加的菌剂或者固定化的微球或填料时，菌株对废水中的污染物进行降解。
[0017] 本发明提供了一种包含所述的枯草芽抱杆菌菌株的菌剂。所述菌剂可W为液体的 菌液或者固体的菌粉。
[0018] 本发明提供了一种包含所述的枯草芽抱杆菌菌株的微生物微球。
[0019] 本发明提供的芽抱杆菌菌株培养条件简单，耐高溫、耐酸碱、耐高盐，能够分泌蛋 白酶、淀粉酶、纤维素酶，并有效改善水质，降低水体中的COD、氨氮。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12菌落形态图片和显微镜 下细胞图片。
[0021] 图2为本发明枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12基于16S rDNA序列同源 性构建的系统发育树。
[0022] 图3为抑值对本发明枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12生长的影响。
[0023] 图4为溫度对本发明枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12生长的影响。
[0024] 图5为盐浓度对本发明枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12生长的影响。
[00巧]图6为实施例4中枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12对氨氮、COD的去除效 果。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1芽抱菌的分离筛选
[0027] 1、污泥的采集
[00%]采集养殖塘的污泥、水样7份，分别称取lOg污泥（水样移取lOmL)加入装有90mL灭 菌生理盐水的锥形瓶中，在15化/min摇床里震荡0.化，取出放入80°C水浴锅中水浴30min， 采用十倍稀释法将样品液稀释一定的倍数，备用。
[0029]取0.1血稀释样品液W固体LB培养基上涂布，于30°C培养4她，挑选长势良好、菌落 形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌，获得12株芽抱菌。
[0030] 2、产酶芽抱杆菌筛选
[0031] (1)纤维素酶检测：
[0032] 簇甲基纤维素钢平板培养基（g/L):CMC-化15.0,化C1 5.0，Κ出P〇4 1.0，MgS〇4 0.2,蛋白腺 10.0,酵母粉 5.0,琼脂 18.0，pH 7.2-7.5。
[0033] 将分离到的菌株点种到纤维素培养基上，37°C培养48-72h，用Ig/L刚果红染液 染色20min，弃去染液，加入Imol/L化C1溶液，洗涂20min后，如果菌落周围出现透明水解 圈，说明CMC已经被水解，测量透明圈直径与菌落直径的比值。
[0034] (2)蛋白酶检测：
[0035] 牛奶培养基:脱脂牛奶50ml、蒸馈水50ml、琼脂粉1.5邑。
[0036] 将分离到的菌株点种到牛奶培养基上，37°C培养24-4她，如果菌落周围有透明圈 产生说明酪蛋白已经被水解，测量透明圈直径与菌落直径的比值。
[0037] (3)淀粉酶检测：
[003引淀粉培养基（g/L):蛋白腺lO.Og、牛肉膏5.0g、NaCl 5.0g、可溶性淀粉2.0g、pH 7.2-7.5、琼脂粉20邑。
[0039] 将分离到的菌株点种到培养基上，37Γ培养24-4化，在培养基表面滴加适量舰液 使均匀布满整个平板，如果菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，测量透明圈直径 与菌落直径的比值。
[0040] 经过产酶实验，筛选得到一株能淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、且产酶量较高的菌株 [0041 ] CM-A12。该菌株CM-A12的产酶能力如下表1所示。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] ~由表1可W看出，枯草芽抱杆菌CM-A12具有很强的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶能 力，Ξ种酶的透明圈直径与菌落直径比均在4.0W上。
[0045] 实施例2芽抱菌CM-A12的鉴定
[0046] (1)形态特征
[0047] 菌株CM-A12在固体LB生长养基上培养24小时后，菌落呈透明水珠状，表面突起，湿 润有光泽;培养4她后，菌落表面干燥，呈米白色。显微镜下观察到菌株细胞为短杆菌，如图1 所示。
[004引 （2)生理生化鉴定(如表2所示）
[0049]表 2
[(K)加]
[0化1 ]
[0052]说明：V' ：反应呈阳性；反应呈阴性。
[0化3] (3)168 rDNA测定
[0054]通过菌株形态特征观察不能确定细菌的种属，对菌株的16S rDNA基因序列进行测 序，进行分子水平的鉴定。
[0055] a菌株 16S rDNA的PCR扩增 [0化6] ① PCR扩增体系：
[0化7] 表3PCR扩增体系 [0化引
[0059] ②PCR引物采用16S rRNA细菌通用引物:
[0060] 27F:5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'(沈Q ID N0.2)
[0061 ] 1492R:5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACTT-3'(沈Q ID N0.3)
[0062] ③PCR扩增条件：
[0063]
[0064] 经测序获得到长度为1379bp的16S rDNA片段，在GenBank中的注册登记号为 KT891015,碱基序列如例表3所示。
[0(?日]菌株CM-A12的16S rDNA序列与GenBank相关数据进行BLAST同源性比对分析，发现 菌株CM-A12的16S rDNA序列与GenBank数据库中已知序列中的Bacillus subtilis化-16 (KF683170)序列相似性高达99 %，选取10株序列相似率高的标准菌株，用Neighbor 化ining(NJ)建树方法构建的系统发育树如图2所示，在所构建的发育树中，菌株CM-A12与 Bacillus subtilis α-16化F683170)也处于同一分支上。
[0066] 结合形态特征、生理生化鉴定和分子16S rDNA鉴定，确定该菌为枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtil is)，将其命名为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is )CM-A12,并将该菌 株送至位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC)进行保藏，保藏编 号为CCTCC N0:M2015688,保藏日期为2015年11月23日。
[0067] 实施例3枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12生长条件优化
[0068] 菌株培养液:蛋白腺10g/L，牛肉膏5g/L，NaC15g/L，pH7~7.2。
[0069] (1)发明菌株最适生长pH
[0070] 用1. Omo 1 /L的HC巧日化0聞尋培养液的初始抑分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0、11.0,按l%(v/v)接种量接入〔1-412,30°(：、15化/111111培养，分别在培养2〇}1、4〇}1后，用 紫外可见分光光度计在600nm处测其吸光度，W不接种的培养液作为空白对照。
[0071] 由图3所知，起始抑在4~9之间，CM-A12生长良好，抑生长范围广;在初始抑值为大 于9.0时菌株CM-A12几乎不能生长。
[0072] 从经济角度考虑，CM-A12在大量生产发酵时，培养基为自然抑即可;在投加到废水 生物处理工程中应用时，水体抑在4~9范围内即可，减少抑调节步骤，降低废水处理成本。 (2)发明菌株最适生长溫度
[0073] 在培养液中按1 % (v/v)接种量接入CM-A12，分别放置在20°C、25°C、30°C、35°C、 37、40°C摇床培养箱中，150r/min培养，分别在培养20h、40h后，用紫外可见分光光度计在 600nm处测其吸光度。
[0074] 由图4可W看出，溫度是影响CM-A12生长的一个重要因素。CM-A12在20~40°C内均 能生长，在20~37°C溫度范围内，溫度越高越有利于菌株的生长。菌株CM-A12的最适生长溫 度为37~40°C。
[0075] (3)盐浓度对菌株生长的影响
[0076] 分别配制盐度为 0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、 9.0%、10.0%、11.0%、12.0%、13.0%、14.0%、15.0%、的培养液，接入 1 % (v/v)的菌株 CM-A12，于30°C、150r/min恒溫培养，2化、4化后，用紫外可见分光光度计在60化m处测其吸 光度。
[0077] 由图5可知，发明中菌株CM-A12在0.0~14.0%盐浓度范围内都能生长，属于中度 耐盐菌，但在1.0%盐浓度范围内菌株CM-A12的生长最快。
[0078] 实施例4枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12应用于工业园区混合废水
[0079] (1)采用聚氨醋海绵填料作为生物载体进行生物挂膜，填料规格为2cmX2cmX 2cm;在1L锥形瓶内装入海绵填料、生长培养基，料液比为3:10,将枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12接种于生长培养基，37°C摇床培养箱中，150r/min培养3天对填料进行挂 膜，然后用等体积的混合废水置换出培养液，如此驯化5天后，加入混合废水，每天取样测定 氨氮、COD。
[0080] (2)实验结果见图6所示，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is )CM-A12对氨氮、COD 有很好的降解能力，经菌株A12处理后废水的COD由1206mg/L降至345mg/L，去除率71 % ;处 理后氨氮由25.5mg/L降至3.01mg/L，去除率88%。可见枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) CM-Al 2对废水的净化作用有很好的净水作用。
[0081 ] 实施例5枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12应用于印染废水
[0082] (1)采用包埋技术固定枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12,制成生物固定 化微球。包埋材料为聚乙締醇、海藻酸钢、二氧化娃粉末和碳酸巧，并添加铁粉，具体包埋方 法参照文献：巧航，郑耀通，钱泽辕，陈美慈，聚乙締醇包埋厌氧活性污泥处理废水的最优化 条件研究，环境科学，1994，15 (5);
[0083] (2) W印染废水为处理对象，在1L锥形瓶内装入固定化微球、印染废水，料液比为 3:10,放置于15化/min、37°C摇床培养箱中，一定时间取样测定氨氮、COD。
[0084] (3)印染废水处理前废水颜色暗深，呈紫红色；经微球处理后治理后水质明显清 澈，略带黄色，C0化r去除率60 % W上，氨氮去除达95 % W上。
[0085] 实施例6枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12应用于小区河道污染水
[0086] (1)采用聚氨醋海绵填料作为生物载体进行生物挂膜，填料规格为5cmX5cmX 5cm;在5L反应容器内装入海绵填料、生长培养基，料液比为3: 10,将枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)CM-A12接种于生长培养基，常溫25~35°C，D0在2.0~3.0mg/L之间培 养5天对填料进行挂膜。然后W湖州某小区河道污染水为处理对象，流量为0.化A，水力停 留时间均为12h，^天后，每天取样测定氨氮、COD。
[0087] (2)结果显示，小区河道污染水经枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12处理 后，河水的COD由80~90mg/L降至30~45mg/L，去除率达50% W上;处理后氨氮由15~30mg/ L降至1~4.5mg/L，去除率达85% W上。可见枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)CM-A12对 河道水体有很好的修复作用。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CM-A12,保藏编号为CCTCC NO:M 2015688,保藏日期为2015年11月23日。2. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)CM-A12的 16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -种枯草芽孢杆菌菌株的培养方法，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌 菌株活化后，接种到初始pH值为4~9、温度为25~40 °C、盐的质量浓度为0~14%的培养基 中培养。4. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在水体修复或废水处理中的应用。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水体为河道或湖泊;所述废水为生活污 水、养殖废水、印染废水、食品行业废水或造纸废水。6. 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，包括:将所述的枯草芽孢杆菌直接投加至 水体或废水中进行生化处理;或者固定化后，再对水体或废水进行生化处理。7. -种包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株的菌剂。8. -种包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株的微生物微球。9. 如权利要求7所述的菌剂在水体修复或废水处理中的应用。10. 如权利要求8所述的微生物微球在水体修复或废水处理中的应用。
【文档编号】C12R1/125GK106011034SQ201610625978
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月2日
【发明人】赵鸭美, 朱强, 李美娣, 王晛, 唐青青
【申请人】浙江至美环境科技有限公司