一株产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种生产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CB?019，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.11950。本发明的菌株发酵及制备生化型驱油剂的方法简单易行，制备的生化型驱油剂的环境适应性好，能保持较高的表界面活力和原油乳化降粘能力；该菌株还能够降解石油、瓜胶等高分子聚合物，可应用于含油污水、压裂返排液和含聚废水处理。本发明的解淀粉芽孢杆菌CB?019在微生物采油和环境修复领域具有重要的推广和应用价值。CGMCC No.1195020160104
【专利说明】
-株产表面活性素的解淀粉芽抱杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，设及一株产表面活性素的解淀粉芽抱杆菌及其在微 生物采油和环境修复领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 生物表面活性剂，是微生物在特定条件下代谢产生的具有表面活性的物质，依据 化学组成和微生物来源可分为糖脂、脂肤和脂蛋白、脂肪酸和憐脂、聚合物和全胞表面本身 等五大类。与化学合成的表面活性剂一样，生物表面活性剂的分子结构也由两部分组成，疏 油亲水的极性基团和疏水亲油的非极性基团。但是与化学表面活性剂相比，生物表面活性 剂有其自身的强大优势，选择性广，对环境友好，分子结构类型多样，具有许多特殊的官能 团，专一性强，原料在自然界广泛存在且价廉，发酵生产是典型的"绿色"工艺等，运是一般 化学合成的表面活性剂难W匹敌的。尤其是脂肤类表面活性剂，常由13~15个碳为主的脂 肪酸链和4~17个氨基酸数不等的肤组成，拥有重要的表面活性，其中主要分为Su计actin (表面活性素）、itu;rin(伊枯草菌素）、fengycin(芬莽素）、lichenysins(地衣素）和 bacillomycin(杆菌霉素)等。生物表面活性剂拥有庞大而复杂的化学结构使得表面活性和 乳化能力更强，因其具有许多独特的优良特性，从而吸引着越来越多的研究者。
[0003] 解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)为革兰氏阳性芽抱杆菌，好氧 菌，与枯草芽抱杆菌具有很高的亲缘性，其生长过程中可W产生一系列低分子量抗生素 W 及抗菌蛋白或多肤等活性代谢产物，具有表面活性，广谱抗菌活性和抗逆能力，生长速度 快，稳定性较好。目前，已报道的解淀粉芽抱杆菌产生脂肤类表面活性物质，主要有表面活 性素(Surfactin)、伊枯草菌素（lUirin)和芬莽素(Fengycin)。芽抱杆菌作为工业生产脂肤 类生物表面活性剂的优良菌种，其中报道最多的是枯草芽抱杆菌和地衣芽抱杆菌，有关解 淀粉芽抱杆菌及其在油井增产和环境修复等领域的应用报道较少。
[0004] 目前我国大多数油田已进入高含水期，总体含水率已高达90%，而全国平均采收 率还不到35%，仍然有50% W上的难动原油有待挖潜。因此Ξ次采油有着特别重要的意义， 目前世界上已形成四大技术系列，即化学驱、气驱、热力驱和微生物驱。微生物驱油中较为 重要的就是利用微生物及其代谢产生的生物表面活性剂进行驱油。生物表面活性剂的驱油 机理主要有W下几点：降低油水界面张力，从而大大降低或消除地层的毛细管作用，减少了 剥离原油所需的粘附功，提高了洗油效率;乳化原油，表面活性剂体系对原油具有较强的乳 化能力，在水油两相流动剪切的条件下，能迅速将岩石表面的原油分散、剥离，形成水包油 (0/W)型乳状液，从而改善油水两相的流度比，提高波及系数;改变岩石表面的润湿性(润湿 反转机理），合适的表面活性剂，可W使原油与岩石间的润湿接触角增加，使岩石表面由油 湿性向水湿性转变;提高表面电荷密度，当驱油表面活性剂为阴离子(或非离子-阴离子型） 表面活性剂时，它们吸附在油滴和岩石表面上，可提高表面的电荷密度，增加油滴与岩石表 面间的静电斥力，使油滴易被驱替介质带走，提高了洗油效率;改变原油的流变性，用表面 活性剂水溶液驱油时，一部分表面活性剂溶入油中，吸附在渐青质点上，可W增强其溶剂化 外壳的牢固性，减弱渐青质点间的相互作用，削弱原油中大分子的网状结构，从而降低原油 的极限动剪切应力，提高采收率。
[0005] 近年来，随着石油行业的快速发展，原油开采过程中产生的油田污水和含油固废 已成为主要的工业污染源之一。目前油田污水基本可W分为水驱的含油污水和聚驱的含聚 污水。含油污水和含聚废水已经严重影响了周围±壤、农作物、生物W及人类的健康，油田 污水的无害化处理将关系到整个石油行业的生存与发展。迄今为止，物理的化学的方法都 已经普遍应用于油田污水的处理，但其处理效果比较局限，成本较高，尤其是"水十条"等环 保法的颁布，迫切需要高效和低成本的处理技术，国内外学者已经开始把目光投向了微生 物处理，微生物处理技术也已经成为油田污水处理技术的研究热点。含油固废主要包括钻 井泥浆和老化油等，其中钻井泥浆成分复杂，含有悬浮颗粒、重金属离子、油、化学处理剂、 盐类等，具有污染物种类多、COD含量高、色度大、可生化性差的特点；老化油含有重质化原 油、多种采油措施后的化学残液、采出液携带的矿物质、泥沙等，成分非常复杂，具有高胶 质、高渐青质、高盐份、高乳化程度、高杂质含量等特点。另外，压裂返排液污染主要来自油 水井的压裂工艺，压裂作业排出的残余压裂液中，含有瓜胶、原油及各种添加剂，若不处理 直接排放，将会对周围环境造成污染。在油田污水、含油固废和压裂返排液污染的处理技术 中，与传统物理和化学处理方法相比，生物处理技术具有作用持久、低成本、环境友好等优 势，具有广阔的开发与应用前景。针对石油、瓜胶和聚合物等难降解的有机物，利用能够高 效降解运些污染物的优良菌种，调控生态因子，从而使污染物达到排放标准具有重要的工 业价值。
[0006] 目前，有关解淀粉芽抱杆菌及其生物活性产物在微生物采油和环境修复领域中应 用的相关报道较少。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在提供一种可通过发酵生产微生物采油用表面活性素的微生物菌株，并 提供利用该菌株制备生化型驱油剂的方法和应用。
[0008] 本发明所提供的生产表面活性素的解淀粉芽抱杆菌（B a C i 1 1 U S amyloliquefaciens)CB-019是由某油田采出液中筛选获得的。该菌株已在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称:CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，保藏号为CGMCC No. 11950，保藏日期为2016 年1月4日。
[0009] 本发明的解淀粉芽抱杆菌CB-019的生理生化特征及遗传学特征如下：
[0010] (1)菌体特征:单个细胞(0.7~0.8) X (2.0~3.0)μπι，着色均匀；芽抱(0.6~0.9) X (1.0~1.5)μπι，楠圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽抱形成后菌体不膨大;在液体培养 基中生长时，常形成皱釀。
[0011] (2)菌落特征:菌落表面粗糖不透明，污白色或微黄色。
[0012] (3)理化性质:革兰氏阳性菌，接触酶和氧化酶反应均为阳性，淀粉水解、解酪素 及水解明胶均为阳性，巧樣酸利用试验呈阳性，甲基红试验呈阴性。
[001引（4)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amylolique化ciens)相似但又有区别的类群，定名为CB-019。
[0014] 本发明还提供利用所述解淀粉芽抱杆菌CB-019制备的生化型驱油剂，按质量百分 比包括如下组分： 解淀粉芽抱杆菌CB-019发酵液 40~85% 非离子型表面活性剂 0.5~1.0%
[0015] 氣碳表面活性剂 0.001~0.005% 蒸溜水 余量。
[0016] 进一步地，所述的非离子型表面活性剂为烷基酪聚氧乙締酸、脂肪酸二乙醇酷胺 和多元醇脂肪酸脂中的至少一种。
[0017] 进一步地，所述的氣碳表面活性剂为非离子氣碳表面活性剂。
[0018] 本发明还提供上述生化型驱油剂的制备方法，包括如下步骤：
[0019] (1)将解淀粉芽抱杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，30~37°C培养0.5~ 2d，所述LB固体培养基为琼脂粉18~20g/L，蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~ lOg/L，补水至lL，pH 7.0~8.0;
[0020] (2)将LB固体培养基单菌落接种于种子培养基内，在30~37°C、100~30化pm下振 荡培养1~4d，得种子液，所述种子培养基为：蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~ lOg/L，补水至lL，pH 7.0~8.0;
[0021] (3)将种子液按照体积比1:20~50接入发酵培养基中，在30~37°C、100~30化pm 下振荡培养2~5d，离屯、，得解淀粉芽抱杆菌CB-019发酵液，所述发酵培养基为:葡萄糖10~ 12邑/1，心谷氨酸钢2~3g/L，酵母粉0.5~lg/L，K2HP〇4 3~4g/L，K此P〇4 1.5~2g/L，FeS〇4 0.005~0.01g/L，MnS〇4 0.005~0.01g/L，MgS〇4 0.01~0.02g/L，CaCl2 0.01~0.02g/L，补 水至lL，pH 7.0~8.0;
[0022] (4)在25~50°C下，根据质量百分比将解淀粉芽抱杆菌CB-019发酵液、非离子型表 面活性剂、氣碳表面活性剂和蒸馈水混合揽拌40~60min。
[0023] 本发明还提供解淀粉芽抱杆菌CB-019在含油污水、压裂返排液和含聚废水处理中 的应用。所述解淀粉芽抱杆菌CB-019具有降解原油、瓜胶和高分子聚合物的能力。其应用方 向还包括，但不限于，石油工业领域中的钻井泥浆处理、老化油及油泥处理、油田有害微生 物抑制（如硫酸盐还原菌），原油污染的±壤生物处理，W及在食品、医药、造纸、纺织印染、 饲料工业等领域。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明的解淀粉芽抱杆菌CB-019是一株高产表面活性素的菌株，菌株发酵及制备 生化型驱油剂的方法简单易行，制备的生化型驱油剂的环境适应性好，能保持较高的表界 面活力和原油乳化降粘能力；同时解淀粉芽抱杆菌CB-019在油田污水的处理过程中，环境 敏感性弱，对来水水质要求不严格，具有高效的原油和瓜胶降解能力，可满足微生物采油技 术和环境修复领域的工程需求。
【附图说明】
[00%]图1为菌株CB-019的革兰氏染色镜检图；
[0027]图2为菌株CB-019的系统发育树；
[00%]图3为菌株CB-019发酵产物的红外图谱；
[0029] 图4为菌株CB-019发酵产物的核磁共振图谱；
[0030] 图5为菌株CB-019的排油圈；
[0031 ]图6为菌株CB-019降解原油前后的气相色谱对比图；
[0032] 图7为菌株CB-019降解瓜胶水解圈。
【具体实施方式】
[0033] 下属非限制性实施例可W使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不W 任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方 法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0034] 下述实施例采用的培养基及其组成如下：
[00巧]LB固体培养基：琼脂粉18~20g/L，蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~ lOg/L，补水至lL，pH 7.0~8.0;
[0036] 种子培养基:蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~lOg/L，补水至lL，pH 7.0 ~8.0;
[0037] 发酵培养基：葡萄糖10~12旨凡心谷氨酸钢2~3g/L，酵母粉0.5~lg/L，K2HP〇4 3 ~4g/L，K出P〇4 1.5~2g/L，FeS〇4 0.005~0.01g/L，MnS〇4 0.005~0.01g/L，MgS〇4 0.01~ 0.02g/L，CaCl2 0.01 ~0.02g/L，补水至lL，pH 7.0~8.0。
[0038] 实施例1菌株CB-019的筛选及鉴定
[0039] 1.菌株CB-019的分离
[0040] (1)样品来源:某油田采出液。
[0041] (2)菌株初筛:将样品用无菌水按浓度梯度稀释至10-3~10-8,取O.lmL均匀涂布于 血平板培养基上，放于37Γ培养箱中培养。将有溶血圈的菌落转接至新鲜的血平板上，划线 纯化后接种至斜面培养基中，4Γ保存，备用。
[0042] (3)菌株复筛:将保存的菌种接种至LB培养基中，37°C、160巧m振荡培养2地，再W 1:50的接种量接种至发酵培养基中，37 °C下、16化pm振荡培养30~36h。取上述发酵液30血， 500化/min条件下离屯、后测定上清液的表面张力。其中表面张力值最低（29.35mN/m)的菌 株，编号为CB-019。
[0043] 2.菌株CB-019的鉴定
[0044] (1)菌体特征:单个细胞(0.7~0.8) X (2.0~3.0)μπι，着色均匀；芽抱(0.6~0.9) X (1.0~1.5)μπι，楠圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽抱形成后菌体不膨大;在液体培养 基中生长时，常形成皱釀。
[0045] (2)菌落特征:菌落表面粗糖不透明，污白色或微黄色。
[0046] (3)理化性质:革兰氏阳性菌(革兰氏染色镜检如图1所示），接触酶和氧化酶反应 均为阳性;淀粉水解、水解酪素及水解明胶均为阳性;巧樣酸利用试验呈阳性；甲基红试验 呈阴性。
[0047] ( 4)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于解淀粉芽抱杆菌（Baci 1 lus amyloliquefaciens)相似但又有区别的类群，定名为CB-019,被分类于解淀粉芽抱杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中屯、保藏，保藏号为CGMCC No. 11950，保藏日期为2016年1月4日。菌株CB-019的16S rDNA序 列具体可见序列表，系统发育树如图2所示。
[004引实施例2菌株CB-019的发酵产物提取及鉴定
[0049] 菌株CB-019的发酵:将解淀粉芽抱杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，在35 °C培养Id,将单菌落接种于种子培养基内，在35°C、15化pm下振荡培养2d，成为种子液，种子 液按照体积比1:20接入发酵培养基中，在35°C、150巧m下振荡培养3d，离屯、，得发酵液。
[0050] 发酵液采用酸沉淀法提取CB-019中的发酵产物:将发酵液离屯、去除菌体，调节上 清液抑为2.0，静置过夜，离屯、收集沉淀，沉淀用抑2.0盐酸洗涂，用化肥化粉末调节盐酸洗 涂液至pH 8.0,加入氯仿甲醇(3:1)混合物作萃取剂，保留水相，冷冻干燥后得发酵产物。
[0051] 分别采用巧Ξ酬显色反应、红外图谱和核磁图谱对发酵产物进行鉴定。
[0052] 巧Ξ酬显色反应为紫色，说明菌株CB-019的发酵产物含有肤类物质；红外图谱的 ii定结果如图3所示，由图可知，3410cnfi处的吸收带为N-H、〇-H键伸缩振动吸收。2928cnfi、 2859cnfi为脂肪族碳链上的C-H键伸缩振动的吸收带，1468cm-i和1390cm-i为碳链上C-H的弯 曲振动吸收带，说明存在碳链结构。在1658cm-i和1545cm-i处是酷胺谱带I和II，说明CB-019 发酵产物分子中存在肤键；1240cm-i是C-0-C键的吸收峰，说明物质中有醋基结构;Η-醒R核 磁共振图谱的测定结果如图4所示，由图可知，化学位移0.5~1.25的峰，可W推断含有烧控 链，且峰面积较大，说明存在长链脂肪酸，化学位移4.6的峰，可W推断締控的存在。
[0053] 综合巧Ξ酬显色反应、红外光谱和核磁图谱的分析结果，推断出CB-019的表面活 性产物具有表面活性素的结构特征，CB-019发酵产物为表面活性素。
[0054] 实施例3菌株CB-019生物活性物质性能测定
[0055] 采用实施例2得到的菌株CB-019的发酵液进行如下的测定。
[0056] 1.乳化性能测定
[0057] (1)发酵液排油圈测定:〇.5g苏丹红虹加入到lOOmL液体石蜡中，将液体石蜡染色， 过滤后备用。将8mL染色后的液体石蜡加入到装有60mL蒸馈水的9cm平皿中，平皿表面形成 一层均匀分散的染色后的液体石蜡薄膜后，在油膜中屯、慢慢滴入菌株CB-019发酵液ImL，观 察排油圈大小，结果如图5所示，结果表明CB-019能产生较大排油圈，直径约5~6cm。
[0058] (2)煤油和液体石蜡乳化率:取煤油和液体石蜡各5mL，在刻度试管内分别与等体 积的菌株CB-019发酵液混合，縱满振荡器震荡Imin，混合后静置，5min后观察起泡层高度， 结果表明CB-019对煤油乳化率可达72%，对液体石蜡乳化率可达55%。
[0059] (3)原油乳化测定:发酵培养基中分别加入10%的4种原油样品，接入CB-019种子 液，接种量为1:10，在35 °C、150rpm培养3d后，观察原油变化。结果如表1所示，结果表明CB- 019对原油具有较好的乳化效果。
[0060] 表1菌株CB-019的原油乳化性能
[0061]
[0062] 2.环境适应性
[0063] (1)耐溫适应性:将CB-019种子液按照体积比1:10接种于发酵培养基，置于不同溫 度下培养2地，测定发酵液表面张力。结果如表2所示，结果表明菌株CB-019可在溫度为25~ 45°C的范围内生长，并产生生物表面活性剂，35°C下代谢产物活性最高，表面张力最低，可 达 27.aiiN/m。
[0064] 表2菌株CB-019的耐溫适应性
[00 化]
[0066] (2)耐碱适应性:将CB-019种子液接种于不同抑的发酵培养基，培养2地，测定发酵 液表面张力。结果如表3所示，结果表明菌株CB-019可在抑为4~9的范围内生长，并产生生 物表面活性剂，抑=6下表面张力最低，可达28.9mN/m。
[0067] 表3菌株CB-019的耐碱适应性 [006引
[0069] ~(3)耐盐适应性:将CB-019种子液接按照体积比1:10种于由化C1配制的不同矿化 度的发酵培养基，培养24h，测定发酵液表面张力。结果如表4所示，结果表明菌株CB-019可 在矿化度《l〇Xl〇4mg/L的范围内生长，并产生生物表面活性剂。矿化度为5X104mg/L下表 面张力最低，可达27.3mN/m。
[0070] 表4菌株CB-019的耐盐适应性
[0071]
[0072] 实施例4菌株CB-019原油降解能力测定
[0073] 发酵培养基中接入10%的原油样品，高溫高压灭菌后，接入CB-019种子液，接种量 为10%; 150rpm培养8d后，观察原油变化，并采用气相色谱测定CB-019降解原油前后的组分 变化。结果表明CB-019在接有原油的培养基中能够生长，且培养基呈浅栋色。图6为菌株CB- 019 降解原油前后的气相色谱对比图 ，结果表明 CB-019 处理原油样品前后，原油中各组分明 显减少，其中碳链长度小于11的组分几乎完全降解，碳链长度为11~21的降解情况如表5所 示，CB-019对碳链长度为11~21的平均降解率可达42.15 %，说明CB-019对原油中各组分具 有较好的降解能力。
[0074] 表5 CB-019降解原油前后组分含量变化
[0075]
[0076]
[0077] 实施例5生化型驱油剂的表面张力测定
[0078] 按照如下方法制备生化型驱油剂，并进行表面张力测定。
[0079] (1)将解淀粉芽抱杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，35°C培养Id,所述LB固 体培养基为琼脂粉18g/L，蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，NaCl lOg/L，补水至lL，pH 7.0~8.0;
[0080] (2)将LB固体培养基单菌落接种于种子培养基内，35Γ、振荡培养Id,成为种子液， 所述种子培养基为:蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，NaCl lOg/l，补水至lL，pH 7.0~8.0;
[0081] (3)将种子液接入发酵培养基中，培养2d，离屯、，得发酵液，所述发酵培养基为:葡 萄糖 10旨/1，心谷氨酸钢2g/L，酵母粉lg/L，K2HP〇4 3g/L，K也P〇4 1.5g/L，FeS〇4 O.Olg/L， MnS04 0.01g/L，MgS04 0.02g/L，CaCl20.02g/L，补水至lL，pH7.0~8.0。
[0082] 其中所述的培养条件还包括所述振荡速率为15化pm;所述种子液与发酵液培养基 的体积比为1:20。
[0083] 在50°C下，将质量百分比为70%的菌株CB-019的发酵液、0.8%的非离子型表面活 性剂(烷基酪聚氧乙締酸、脂肪酸二乙醇酷胺或多元醇脂肪酸脂中的一种）、〇.002%的非离 子氣碳表面活性剂FC-03(聚氧乙締酸类)混合揽拌50min，分别测定表面张力值。实验结果 如表6所示，复配的生化型驱油剂表面张力值较低，可达25. OmN/m左右，具有较高的降低表 面张力的能力。
[0084] 表6生化型驱油剂的表面张力测定
[0085]
[0086] 实施例6模拟驱油试验
[0087] 按照如下方法进行菌株CB-019发酵液和生化型驱油剂的填砂管驱油试验。
[008引（1)使用的填砂管长度为30cm，内径为2.5cm，其中1#为对照组为CB-019发酵液 实验组，3#为生化型驱油剂实验组，实验用砂为粒径大小不一的砂粒，人工压制填实。
[0089] (2)将制备好的砂管通氮气测定气相渗透率。
[0090] (3)砂管用模拟配制矿化度为7 X 104mg/L的水抽真空饱和2地，比较饱和地层水前 后的岩屯、质量差W确定孔隙体积PV，然后计算孔隙度。
[0091] (4)测定在恒流下整个岩屯、段的压差，通过达西定律来确定绝对渗透率。
[0092] (5)用采集获得的原油驱替岩屯、管中的地层水直至出口产出液含水小于2%，计算 驱出水体积即原油饱和体积，计算出原始含油饱和度。
[0093] (6)砂管在37°C条件下老化7d。
[0094] (7)1#砂管进行水驱，水驱至含水95%。计算水驱采收率。
[0095] (8)将CB-019发酵液分别注入其它2根砂管中，37°C条件下解育7d后水驱，计算采 收率。
[0096] 结果如表7所示，结果表明CB-019可使驱油效率提高14.71%，生化型驱油剂可使 驱油效率提高18.86%，表明生化型驱油剂具有更好的驱油能力，在提高原油采收率方面具 有很大的潜力。
[0097] 表7菌株CB-019的填砂管试验结果 [009引
[0099] 实施例7菌株CB-019处理含油废水试验
[0100] 发酵培养基中接入约500mg/L的原油样品，高溫高压灭菌后，接入CB-019种子液， 接种量为10%; 150巧m培养8d后，加入适量的石油酸萃取至发酵液无色，经无水硫酸钢脱 水，保证萃取液不浑浊，在430nm的波长下比色。结果如表8所示，结果表明菌株CB-019能够 降531.2mg/L的含油废水降解至171.8mg/L，降解率达67.66 %，菌株CB-019对含油废水有较 好的处理效果。
[0101] 表8菌株CB-019处理含油污水前后对比
[0102]
[0103] 实施例8菌株CB-019瓜胶降解能力测定
[0104] 1.菌株CB-019降解瓜胶水解圈
[0105] 挑取菌株CB-019单菌落，稀释平板涂布于含油0.5%瓜胶的固体培养基上，于37°C 下培养4她，往平板中倒入一层舰液，静置lOmin，观察菌落和透明水解圈。结果如图7所示， 结果表明能看见明显降解瓜胶的水解圈，菌株CB-019具有降解瓜胶的能力。
[0106] 2.菌株CB-019降解瓜胶粘度
[0107] 将CB-019种子液接种至装有5.OmL瓜胶的发酵培养基中静置3d，W加蒸馈水作为 对照，分别测定粘度。结果如表9所示，结果表明CB-019可将粘度为10.27mPa · S的瓜胶降至 1.62m化· S，对瓜胶的降解率达84.2%，可应用于压裂返排液的处理。
[0108] 表9菌株CB-019降解瓜胶试验结果
[0109]
【主权项】
1. 一种生产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CB-〇 19,保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 11950。2. 如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌CB-019在含油污水、压裂返排液或含聚废水处 理中的应用。3. -种生化型驱油剂，其含有解淀粉芽孢杆菌CB-019发酵液。4. 根据权利要求3所述的生化型驱油剂，其特征在于，按质量百分比包括如下组分： 解淀粉芽孢杆菌CB-019发酵液 40~85% 非离子型表面活性剂 0.5~10% 氟碳表面活性剂 0.00丨~0,005% 蒸懐水 余量。5. 根据权利要求4所述的生化型驱油剂，其特征在于，所述的非离子型表面活性剂为烷 基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸二乙醇酰胺和多元醇脂肪酸脂中的至少一种。6. 根据权利要求4所述的生化型驱油剂，其特征在于，所述的氟碳表面活性剂为非离子 氟碳表面活性剂。7. 如权利要求4所述的生化型驱油剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下 步骤： (1) 将解淀粉芽孢杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，30~37 °C培养0.5~2d，所 述LB固体培养基为琼脂粉18~20g/L，蛋白胨8~10g/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~10g/L，补 水至IUpH 7.0~8.0; (2) 将LB固体培养基单菌落接种于种子培养基内，在30~37°C、100~300rpm下振荡培 养1~4d，得种子液，所述种子培养基为:蛋白胨8~10g/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~10g/L， 补水至IUpH 7.0~8.0; (3) 将种子液按照体积比1: 20~50接入发酵培养基中，在30~37°C、100~300rpm下振 荡培养2~5d，离心，得解淀粉芽孢杆菌CB-019发酵液，所述发酵培养基为:葡萄糖10~12g/ 1^儿-谷氨酸钠2~38/1，酵母粉0.5~18/1，1(2册〇4 3~48/1，腿2?〇4 1.5~28/1^65〇4〇.005 ~0.018/1，]?11504 0.005~0.018/1，]\%5040.01~0.028/1，〇&(：12 0.01~0.028/1，补水至 IUpH 7.0~8.0; (4) 在25~50°C下，按照质量百分比将解淀粉芽孢杆菌CB-019发酵液、非离子型表面活 性剂、氟碳表面活性剂和蒸馏水混合搅拌40~60min。
【文档编号】C09K8/584GK106011035SQ201610632519
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月4日
【发明人】赵静, 韩俊杰
【申请人】大连知微生物科技有限公司