一种酮古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种酮古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用。该酮古龙酸杆菌工程菌株包括氨基酸合成途径中的关键基因；氨基酸合成途径中的关键基因为苏氨酸合成途径中的关键基因、脯氨酸合成途径中的关键基因或组氨酸合成途径中的关键基因。本发明通过在菌种体内构建氨基酸合成路径中缺失基因，促使酮古龙酸杆菌工程菌株单独发酵时更好的将山梨糖转化为酮古龙酸；将酮古龙酸杆菌工程菌株和内生芽孢杆菌混菌发酵时，减少发酵周期，相比原始菌株，周期缩短10h左右，节约时间成本；在产率方面，相比原始菌提高20％左右；同时混菌发酵时可以更少的依赖伴生菌的作用，从而减少伴生菌即芽孢杆菌的用量，减少成本和污染。
【专利说明】
-种酬古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物工程技术领域，特别设及一种酬古龙酸杆菌工程菌株及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 维生素 C(英语:Vitamin C，又称心抗坏血酸)为酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸 内醋，主要来源新鲜水果和蔬菜，是维持机体生长和代谢所必须的一种水溶性维生素。维生 素 C有レ型和D-型两种异构体，只有レ型的才具有生理功能，还原型和氧化型都有生理活 性。在生物体内，维生素 C为抗体及胶原形成，组织修补(包括某些氧化还原作用），苯丙氨 酸、酪氨酸、叶酸的代谢，铁、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白质的合成，维持免疫功能，径化 与径色胺，保持血管的完整，促进非血红素铁吸收等所必需。同时维生素 C还具备有抗氧化， 抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成，从而达到美白，淡斑的功效。目前广泛应用于医药、食品、 饲料和化妆品领域，市场稳定。
[0003] 酬古龙酸菌化etogulonigenium vulgare，K.vulgare)是中国维生素 C二步发酵工 业中的关键菌株。维生素 C的二步发酵法，主要指从D-山梨醇开始，经过两步发酵转化为维 生素 C前体一一2-酬-k古龙酸的过程。第一步，利用氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为 心山梨糖;第二步利用酬古龙酸杆菌及其伴生菌(主要为芽抱杆菌）的混菌体系将k山梨糖 转化为2-酬-k古龙酸(2-ketoA-gulonic acid,简称2-KGA)。但酬古龙酸杆菌单独培养生 长缓慢且易染菌，发酵周期长，产酸量较低，影响其在扩增培养、菌种活化的工业应用。
[0004] 目前常采用添加外源物质的方法提高菌种生物量及产酸量。添加外源物质，包括 添加硫辛酸（申请号：CN 2011 10235170)、谷脫甘肤（申请号：CN200910069697、CN 201 1 10419275)、Ξ簇酸循环中的四碳酸或其盐（申请号：CN 20 1010160 154、CN 201010160178)、辅因子（申请号:CN 201410546538)、添加更利于小菌利用的碳源(包括2碳 单位如乙醇、乙醒及乙酸（盐）及6碳单位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖）（申请号：CN 201410545705)、加入琉基化合物（申请号:CN 200910069697)、外源添加氨基酸(Zhang et al.2011)(Fan et al.2014)。运些外源添加物均对酬古龙酸杆菌生长有促进作用。但由于 外源添加物质需要耗费时间和人力成本，同时添加物质的浓度直接关系到企业成本，具有 企业应用局限。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种酬古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用。该酬 古龙酸杆菌工程菌株通过在菌种体内构建氨基酸合成路径中缺失基因，促使其单独发酵时 更好的将山梨糖转化为酬古龙酸，无需添加外源物质。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种酬古龙酸杆菌工程菌株，该酬古龙酸杆菌工程菌株包括氨基酸 合成途径中的关键基因；氨基酸合成途径中的关键基因为苏氨酸合成途径中的关键基因、 脯氨酸合成途径中的关键基因或组氨酸合成途径中的关键基因中的一种或几种。
[0008] 作为优选，苏氨酸合成途径中的关键基因为高丝氨酸激酶基因，脯氨酸合成途径 中的关键基因为化咯嘟-5-簇酸还原酶基因，组氨酸合成途径中的关键基因为组胺醇憐酸 酶基因。
[0009] 本发明经过基因组测序，发现酬古龙酸杆菌氨基酸合成路径中很多基因缺失，如 图1所示，酬古龙酸杆菌氨基酸合成路径中缺失的基因包括高丝氨酸激酶基因、化咯嘟-5- 簇酸还原酶基因或组胺醇憐酸酶基因。
[0010] 其中，高丝氨酸激酶化C编号为2.7.1.39)为苏氨酸(Threonine)路径缺失关键基 因，化咯嘟-5-簇酸还原酶化C编号为1.5.1.2)是脯氨酸(Proline)路径缺失的酶，组胺醇憐 酸酶化C编号为3.1.3.15)是组氨酸化istidine)合成路径中缺失的酶。
[0011] 同时有文献报导添加不同氨基酸对小菌生长和产酸有不同的促进作用。本发明通 过在菌种体内构建氨基酸合成路径中缺失基因，促使菌种单独发酵时更好的将山梨糖转化 为酬古龙酸，混菌发酵时减少发酵周期，节约时间成本，同时可W更少的依赖伴生菌的作 用，从而减少伴生菌即芽抱杆菌的用量，减少成本和污染。因而在酬古龙酸杆菌体内构建缺 失的氨基酸模块促进其生长和产酸更具有生物学意义。
[0012] 作为优选，在本发明中高丝氨酸激酶基因、化咯嘟-5-簇酸还原酶基因或组胺醇憐 酸酶基因中包括启动子和终止子序列。
[0013] 作为优选，高丝氨酸激酶基因的序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示。
[0014] 在本发明提供的实施例中，序列如SEQ ID NO: 1的高丝氨酸激酶基因来源于氧化 葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)。
[0015] 在本发明提供的另一实施例中，序列如SEQ ID NO: 2的高丝氨酸激酶基因来源于 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0016] 作为优选，化咯嘟-5-簇酸还原酶基因的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示。
[0017] 在本发明提供的实施例中，序列如SEQ ID N0:3的化咯嘟-5-簇酸还原酶基因来源 于氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter 0巧dans)。
[001引在本发明提供的另一实施例中，序列如SEQ ID N0:4的化咯嘟-5-簇酸还原酶基因 来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0019] 作为优选，组胺醇憐酸酶基因的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0020] 在本发明提供的实施例中，序列如SEQ ID N0:5的组胺醇憐酸酶基因来源于蜡状 芽抱杆菌（Bacillus cereus)。
[0021] 本发明提供了该酬古龙酸杆菌工程菌株的制备方法，包括:将氨基酸合成途径中 的关键基因转入酬古龙酸杆菌，获得酬古龙酸杆菌工程菌株;氨基酸合成途径中的关键基 因为苏氨酸合成途径中的关键基因、脯氨酸合成途径中的关键基因或组氨酸合成途径中的 关键基因中的一种或几种。
[0022] 在本发明提供的实施例中，该酬古龙酸杆菌工程菌株的制备方法具体为：
[0023] 将氨基酸合成途径中的关键基因与载体连接，转入受体细胞中克隆扩增，得到重 组子；
[0024] 从重组子中提取目标质粒，将目标质粒转入酬古龙酸杆菌，获得酬古龙酸杆菌工 程菌株。
[0025] 在本发明提供的实施例中，转入受体细胞采用热激法。
[0026] 在本发明提供的实施例中，将目标质粒转入酬古龙酸杆菌的方法采用电转化法。
[0027] 作为优选，电转化法的电压为2000V。
[0028] 在本发明中，电转化采用町培养基进行操作。
[0029] 在本发明提供的实施例中，载体为PBBR1MCS2。
[0030] 在本发明提供的实施例中，受体细胞为大肠杆菌。
[0031] 本发明还提供了一种2-酬-k古龙酸的制备方法，将本发明提供的酬古龙酸杆菌 工程菌株进行发酵培养，得到2-酬-心古龙酸。
[0032] 作为优选，将本发明提供的酬古龙酸杆菌工程菌株进行发酵培养具体为:将酬古 龙酸杆菌工程菌株接种于固体培养基中进行种子培养，然后接种于种子培养基中进行发酵 培养。
[0033] 作为优选，种子培养的溫度为30°C，时间为2地。
[0034] 作为优选，发酵培养的溫度为30°C，转速为25化/min,时间为0~62h。
[0035] 在本发明提供的实施例中，W1L培养基计，种子培养基的配方及制备方法为:称取 牛肉膏3. Og，玉米浆6. Og，酵母浸粉3. Og，蛋白腺10.0 g，无水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨 二钟1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，调节抑至7.0，另取20g山梨糖定容至0.1L，均 在12rC条件下灭菌20min;接菌前将100ml、20%糖溶液加入种子培养基中混合。
[0036] 本发明还提供了另一种2-酬-k古龙酸的制备方法，将本发明提供的酬古龙酸杆 菌工程菌株和芽抱杆菌进行发酵培养，得到2-酬-心古龙酸。
[0037] 作为优选，将本发明提供的酬古龙酸杆菌工程菌株和芽抱杆菌进行发酵培养具体 为:将酬古龙酸杆菌工程菌株接种于固体培养基中进行第一培养，将芽抱杆菌接种于种子 培养基中进行第二培养，然后将经过第一培养后的酬古龙酸杆菌工程菌株和经过第二培养 后的芽抱杆菌接种于发酵培养基中进行发酵培养。
[0038] 在该制备方法中，第一培养的溫度为30°C，时间为2地。
[0039] 在该制备方法中，第二培养的溫度为30°C，时间为12h。
[0040] 作为优选，经过第一培养后的酬古龙酸杆菌工程菌株的接种量为经过第二培养后 的芽抱杆菌的接种量的2倍。
[0041 ]作为优选，发酵培养的溫度为30°C，转速为25化/min,时间为0~8地。
[0042] 在本发明提供的实施例中，发酵培养的时间为72h。
[0043] 在本发明提供的实施例中，W1L培养基计，种子培养基的配方及制备方法为:称取 牛肉膏3. Og，玉米浆6. Og，酵母浸粉3. Og，蛋白腺10.0 g，无水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨 二钟1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，调节抑至7.0，另取20g山梨糖定容至0.1L，均 在12rC条件下灭菌20min;接菌前将100ml、20%糖溶液加入种子培养基中混合。
[0044] 在本发明提供的实施例中，W1L培养基计，发酵培养基的配方及制备方法为:称取 玉米浆15. Og，无水硫酸儀0.5g，尿素12. Og，憐酸氨二钟1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧 2 . Og，调节pH至7.0，另取80g山梨糖定容至0 .化，均在121°C条件下灭菌20min;接菌前将 200ml、40 %糖溶液加入发酵培养基中混合。
[0045] 在本发明提供的实施例中，芽抱杆菌为内生芽抱杆菌。
[0046] 本发明还提供了一种维生素 C的制备方法，将本发明提供的酬古龙酸杆菌工程菌 株进行发酵培养，得到2-酬-心古龙酸;将2-酬-k古龙酸做为原料制备维生素 C。
[0047] 本发明还提供了一种维生素 C的制备方法，将本发明提供的酬古龙酸杆菌工程菌 株和芽抱杆菌进行发酵培养，得到2-酬-心古龙酸;将2-酬-k古龙酸做为原料制备维生素 C。
[0048] 本发明提供了一种酬古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用。该酬古龙酸杆菌 工程菌株包括氨基酸合成途径中的关键基因；氨基酸合成途径中的关键基因为苏氨酸合成 途径中的关键基因、脯氨酸合成途径中的关键基因或组氨酸合成途径中的关键基因中的一 种或几种。本发明具有的有益效果为：
[0049] 本发明通过在菌种体内构建氨基酸合成路径中缺失基因，促使酬古龙酸杆菌工程 菌株单独发酵时更好的将山梨糖转化为酬古龙酸：单菌发酵62h，插入Gluconobacter oxydans来源的苏氨酸合成路径相关基因（高丝氨酸激酶基因）的酬古龙酸杆菌工程菌株 (pMCS2-Th;r.g)0D600提高了21.4%，插入Saccharomyces cerevisiae来源的苏氨酸合成路 径相关基因（高丝氨酸激酶基因）的酬古龙酸杆菌工程菌株(pMCS2-Thr.s)提高了 1.92%， 插入Saccharomyces cerevisiae来源的脯氨酸合成路径相关基因（化咯嘟-5-簇酸还原酶 基因）的酬古龙酸杆菌工程菌株pMCS2-Pro. S提高了6.4% ;单菌发酵62h，pMCSS-T'虹.g酬古 龙酸产量提高了 25.15 %，PMCS2-T虹.S提高了 6.85 %，pMCS2-Pro. S提高了 4.17 % ;
[0050] 本发明将酬古龙酸杆菌工程菌株和芽抱杆菌混菌发酵时，减少发酵周期，PMCS2- ?'虹.g、pMCS2-T'虹.s、pMCS2-Pro.s相比原始菌株，周期缩短lOh左右，节约时间成本;在产率 方面，PMCS2-T虹.g、pMCS2-T虹.S相比原始菌提高20 %左右，pMCS2-Pro. S提高了 10 %左右；
[0051] 本发明将酬古龙酸杆菌工程菌株和芽抱杆菌混菌发酵时，可W更少的依赖伴生菌 的作用，从而减少伴生菌即芽抱杆菌的用量，减少成本和污染。
【附图说明】
[0052] 图1示酬古龙酸杆菌氨基酸合成路径中缺失的关键基因；其中，黑色实屯、圆表示缺 少的物质。
[0053] 图2示本发明酬古龙酸杆菌工程菌株表达缺失氨基酸路径菌株构建思路图；
[0054] 图3示本发明中不同酬古龙酸杆菌工程菌株发酵0~62h的0D600;
[0055] 图4示不同酬古龙酸杆菌工程菌株的发酵产酸曲线;其中，Κν为原始菌株酬古龙酸 杆菌化.化Igare)的产酸曲线，Mcs为导入空质粒的酬古龙酸杆菌(PBBR1MCS2)的产酸曲线； Thr-g为pMCS2-Thr. g发酵曲线；Thr-s为pMCSS-T'虹.S发酵曲线；Pro-g为pMCS2-Pro. g发酵 曲线；Pro-s为pMCS2-Pro. S发酵曲线；His-b为pMCS2-His. b发酵曲线；
[0056] 图5示本发明中酬古龙酸杆菌与内生芽抱杆菌（Hbe)混菌发酵产量图；其中， Kv.Hbe为原始菌株和内生芽抱杆菌的混菌发酵曲线;Mcs.化e为导入空质粒的酬古龙酸杆 菌和内生芽抱杆菌的混菌发酵曲线;Pro-s.化e为pMCS2-Pro. S菌株和内生芽抱杆菌混菌发 酵曲线；Thr-s .冊e为pMCS2-Thr. S和内生芽抱杆菌混菌发酵曲线；Thr-g.冊e为PMCS2- T虹.g和内生芽抱杆菌混菌发酵曲线；
[0057] 图6示本发明中酬古龙酸杆菌与内生芽抱杆菌混菌发酵产率图。
【具体实施方式】
[0058] 本发明公开了一种酬古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用，本领域技术人员 可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0059] 本发明提供的酬古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用中所用菌种、培养基原 料、仪器等均可由市场购得。
[0060] 本发明实施例中所用培养基配方如下：
[0061 ] 1、LB培养基：10 . Og/L氯化钢，10.0 g/L膜蛋白腺，5. Og/L酵母提取物。相应固体培 养基中加入2%琼脂粉。灭菌条件：12rC，20min。该LB培养基用于培养转入质粒的重组大肠 杆困。
[0062] 2、1L町培养基化.vulgare分子操作用）：称量酵母浸粉5.0g，蛋白腺15.0g，尿素 5.0g，无水硫酸儀2.5g，定容至0.化，另称取15.0g山梨糖定容至0.化，均115°C灭菌15min。 接菌前将200ml ,7.5%糖溶液加入町培养基中混合。该HJ培养基用于酬古龙酸杆菌的电转 化过程。
[0063] 3、1L种子培养基化.vulgare发酵用）：称取牛肉膏3.0g，玉米浆6.0g，酵母浸粉 3. Og，蛋白腺10.0 g，无水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨二钟1. Og，定容至0.化，迅速加入碳 酸巧2.0g，调节抑至7.0,另取20g山梨糖定容至0.1L，均在121°C条件下灭菌20min。接菌前 将100ml ,20%糖溶液加入种子培养基中混合。该种子培养基用于酬古龙酸杆菌的单菌发 酵，W及芽抱杆菌的种子培养。
[0064] 4、1L固体培养基:称取牛肉膏3.0g，玉米浆6.0g，酵母浸粉3.0g，蛋白腺lO.Og，无 水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨二钟1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，调节pH至 7.0,最后加入15.0g琼脂糖，另取40g山梨糖定容至0.化，均在12rC条件下灭菌20min。接菌 前将200ml ,20%糖溶液加入种子培养基中混合。该固体培养基用于酬古龙酸杆菌的一级种 子培养。
[0065] 5、化发酵培养基：称取玉米浆15.0肖，无水硫酸儀0.5肖，尿素12.0肖，憐酸氨二钟 1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，调节pH至7.0，另取80g山梨糖定容至0.化，均在 12rC条件下灭菌20min。接菌前将200ml ,40%糖溶液加入发酵培养基中混合。该发酵培养 基用于混菌发酵。
[0066] 本发明实施例中产物检测方法如下：
[0067] 1、菌浓度测定:使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中菌株的生长曲线，波 长采用600nm，即0D600;
[0068] 2、酬古龙酸产量测定:高效液相色谱检测，采用Aminex HPX-87H色谱柱，示差检测 器。0.5mM硫酸作流动相，柱溫65°C，检测器溫度50°C。
[0069] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0070] 实施例1菌种的构建
[0071] 经过基因组测序，发现酬古龙酸杆菌氨基酸合成路径中很多基因缺失，包括高丝 氨酸激酶、化咯嘟-5-簇酸还原酶、组胺醇憐酸酶，K.化Igare氨基酸合成路径基因缺失图见 图1。本实施例中将高丝氨酸激酶基因、化咯嘟-5-簇酸还原酶、组胺醇憐酸酶导入酬古龙酸 杆菌中。表达缺失氨基酸路径菌株构建思路见图2。
[0072] l、pMCS2-Tlir.g 菌种的构建
[0073] 高丝氨酸激酶化C编号为2.7.1.39)为苏氨酸(Threonine)路径缺失关键基因，合 成改造基因时选择Gluconobacter 0巧dans来源，然后再将序列如SEQ ID N0:1所示的目的 基因经过ΚρηΙ和化ndlll连接到质粒PBBR1MCS2上，转入大肠体内克隆扩增，得到大肠杆菌 重组子。从大肠杆菌中提取克隆扩增的目标质粒，再将质粒在2000V条件下电转入酬古龙酸 杆菌，获得编码高丝氨酸激酶基因载体的重组酬古龙酸杆菌，命名简写为PMCS2-T虹.邑。
[0074] 2、pMCS2-Tlir.s 菌种的构建
[00巧]合成改造基因时选择Saccharomyces cerevisiae来源，然后再将序列如SEQ ID ^):2所示的目的基因经过牡111和化11(1111连接到质粒口881?謹〔52上，转入大肠体内克隆扩 增，得到大肠杆菌重组子。从大肠杆菌中提取克隆扩增的目标质粒，再将质粒在2000V条件 下电转入酬古龙酸杆菌，获得编码高丝氨酸激酶基因载体的重组酬古龙酸杆菌，命名简写 为PMCS2-T虹.S。
[0076] 3、pMCS2-Pro.g 菌种的构建
[0077] 化咯嘟-5-簇酸还原酶化C编号为1.5.1.2)是脯氨酸(Proline)路径缺失的酶，合 成改基因时选择Gluconobacter oxydans来源，然后再将序列如SEQ ID N0:3所示的目的基 因经过ΚρηΙ和Hindlll连接到质粒地BR1MCS2上，转入大肠体内克隆扩增，得到大肠杆菌重 组子。从大肠杆菌中提取克隆扩增的目标质粒，再将质粒在2000V条件下电转入酬古龙酸杆 菌，获得编码化咯嘟-5-簇酸还原酶基因载体的重组酬古龙酸杆菌，命名简写为PMCS2- Pro.go
[0078] 4、pMCS2-Pro.s 菌种的构建
[00巧]合成改基因时选择Saccharomyces cerevisiae来源，然后再将序列如沈Q ID NO: 4所示的目的基因经过ΚρηΙ和Hindlll连接到质粒地BR1MCS2上，转入大肠体内克隆扩增，得 到大肠杆菌重组子。从大肠杆菌中提取克隆扩增的目标质粒，再将质粒在2000V条件下电转 入酬古龙酸杆菌，获得编码化咯嘟-5-簇酸还原酶基因载体的重组酬古龙酸杆菌，命名简写 为 pMCS2-P;ro. S。
[0080] 5、pMCS2-His.b 菌种的构建
[0081] 组胺醇憐酸酶化C编号为3.1.3.15)是组氨酸化istidine)合成路径中缺失的酶， 合成改基因时选择Bacillus cereus来源，然后再将序列如SEQ ID N0:5所示的目的基因经 过ΚρηΙ和化ndlll连接到质粒地BR1MCS2上，转入大肠体内克隆扩增，得到大肠杆菌重组子。 从大肠杆菌中提取克隆扩增的目标质粒，再将质粒在2000V条件下电转入酬古龙酸杆菌，获 得编码组胺醇憐酸酶基因载体的重组酬古龙酸杆菌，命名简写为pMCS2-His.b。
[0082] 在上述5种工程菌构建过程中，目的片段或质粒通过电转化的方法进入K.vulgare 细胞内。电转化的基本步骤分为感受态细胞的制备、电转及筛选。
[0083] 1 .K.vulgare感受态细胞的制备
[0084] K.vulgare甘油菌经过固体平板活化，转接于50mL町培养基中，培养13h至菌体到 达指数期后期；取40mL菌体于50mL预冷的离屯、管中，冰浴15min;在4°C冷冻离屯、机内 450化pm离屯、15min，倒掉上清液；用预冷的10 %的甘油进行洗涂，重悬细胞，450化pm离屯、 15min，同样去除上清液;重复上一步骤;加入30mL的灭菌预冷的超纯水重悬细胞，450化pm 离屯、15min，倒掉上清;加入90化L提前预冷的10 %甘油，重悬细胞，用预冷的枪头分装感受 态细胞于1.5mL EP管内，每管内有感受态细胞90化。制备好的感受态细胞放置于-80°C冰箱 内保存，需要时取出使用。
[0085] 2.电转
[0086] 从-80°C冰箱中取出已制备好的K.vulgare感受态细胞，置于冰上融化；用冷冻枪 头加入10化质粒(浓度最好在lOOngW上），注意质粒需缓慢加入，且不可反复吹吸感受态细 胞，小屯、轻弹EP管外壁混匀细胞和质粒，然后静置5min;将EP管内的混合物用冷冻枪头转移 到事先预冷的电转杯中，电转杯始终进行冰浴;设置电击电压2. OkV，控制电击时间4~6ms， 电击后迅速加入预冷的无抗町培养基;在30°C，150rpm摇床中进行复苏化，离屯、菌体涂布于 与质粒抗性基因对应的抗性平板上。
[0087] 3.筛选
[0088] 通过提质粒酶切验证获得正确的转化子。
[0089] 实施例2单菌摇瓶发酵试验
[0090] 将实施例1中获得的含有编码氨基酸载体的酬古龙酸杆菌(91〔52-化'.旨、91〔52- T虹.S、pMCS2-Pro. g、pMCS2-Pro. S、pMCS2-His. b)进行种子培养，然后接种到发酵培养基中 进行发酵，具体操作如下：
[0091 ] 1)酬古龙酸杆菌种子培养方法：
[0092] 取保存的甘油菌20化L于抗性固体平板上，平板所含抗性为卡那霉素，浓度为50μ g/mL。小幅度倾斜摇晃使菌液均匀地、完整地覆盖于固体平板上，在30°C时培养2地。原始菌 株在不加抗性的固体平板上培养24小时。
[0093] 2)单菌摇瓶发酵
[0094] 将原始的酬古龙酸杆菌和导入不同氨基酸模块的不同重组菌分别加20化L在固体 种子培养基中，3(TC培养24h，之后从平板上洗下，W相同的初始0D接入种子培养基中，30 °(：、250'/111111进行摇瓶发酵，0}1、12}1、2地、36}1、4她、62}1等不同时间点取样分析检测00600 (菌种浓度），测定发酵62h后的酬古龙酸产量。菌种浓度检测结果见图3、图4,发酵62h后的 酬古龙酸产量结果见表1。
[00M]表1单菌摇瓶发酵结果
[0096]
[0097] 由图4试验结果可知，单菌发酵62h，pMCS2-Thr.g 0D600提高了 21.4%，pMCS2- Thr. S提高了 1.92 %，pMCS2-Pro. S提高了 6.4 %，其他改造菌（pMCS2-Pro. g、pMCS2-Hi S. b) 生长促进作用不明显。
[009引由表1试验结果可知，单菌发酵62h，PMCS2-化r. g酬古龙酸产量提高了 25.15 %， PMCS2-T虹.S提高了6.85%，pMCS2-Pro. S提高了4.17%，其他改造菌（pMCS2-Pro. g、pMCS2- His.b)酬古龙酸产量与原始菌酬古龙酸产量差异不明显。
[0099] 实施例3混菌(不同氨基酸改造菌与内生芽抱杆菌)发酵试验
[0100] 将原始的酬古龙酸杆菌和实施例1获得的导入不同氨基酸模块的不同重组菌分别 加 200化在固体种子培养基中，3(TC培养24h，之后从平板上洗下，内生芽抱杆菌甘油菌接 450化于种子培养基中，30°C培养12h，不同氨基酸改造菌W相同的初始OD接入发酵培养基 中，芽抱杆菌初始接种〇〇600为酬古龙酸杆菌的l/^2接入发酵培养基中，30°C、250r/min进行 摇瓶发酵，Oh、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h等不同时间点取样分析，检测酬古龙酸（2- 酬-k古龙酸)产量和产率。结果见表2、表3、图5、6。
[0101] 表2不同菌株发酵培养后的酬古龙酸(2-KGA)的产量(g^)
[0102]
[0106] 由试验结果可知，挑选效果好的Ξ株菌（pMCS2-Thr . g、pMCS2-Thr . S、pMCS2- Pro . s)混菌发酵时，相比原始菌株，周期缩短lOh左右；在产率方面，pMCS2-Thr. g、pMCS2- Τ虹.s相比原始菌提高20 %左右，pMCS2-Pro. s提高了 10 %左右。
[0107] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种酮古龙酸杆菌工程菌株，其特征在于，所述酮古龙酸杆菌工程菌株包括氨基酸 合成途径中的关键基因；所述氨基酸合成途径中的关键基因为苏氨酸合成途径中的关键基 因、脯氨酸合成途径中的关键基因或组氨酸合成途径中的关键基因中的一种或几种。2. 根据权利要求1所述的酮古龙酸杆菌工程菌株，其特征在于，所述苏氨酸合成途径中 的关键基因为高丝氨酸激酶基因，所述脯氨酸合成途径中的关键基因为吡咯啉-5-羧酸还 原酶基因，所述组氨酸合成途径中的关键基因为组胺醇磷酸酶基因。3. 根据权利要求2所述的酮古龙酸杆菌工程菌株，其特征在于，所述高丝氨酸激酶基因 的序列如SEQIDN0:1或SEQIDN0 :2所示； 所述吡咯啉-5-羧酸还原酶基因的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示； 所述组胺醇磷酸酶基因的序列如SEQ ID N0:5所示。4. 如权利要求1至3中任一项所述酮古龙酸杆菌工程菌株的制备方法，其特征在于，包 括:将氨基酸合成途径中的关键基因转入酮古龙酸杆菌，获得酮古龙酸杆菌工程菌株;所述 氨基酸合成途径中的关键基因为苏氨酸合成途径中的关键基因、脯氨酸合成途径中的关键 基因或组氨酸合成途径中的关键基因中的一种或几种。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体为： 将氨基酸合成途径中的关键基因与载体连接，转入受体细胞中克隆扩增，得到重组子； 从所述重组子中提取目标质粒，将所述目标质粒转入酮古龙酸杆菌，获得酮古龙酸杆 菌工程菌株。6. 根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述将目标质粒转入酮古龙酸杆 菌的方法采用电转化法，所述电转化法的电压为2000V;所述载体为TOBR1MCS2;所述受体细 胞为大肠杆菌。7. -种2-酮-L-古龙酸的制备方法，其特征在于，将如权利要求1至3中任一项所述酮古 龙酸杆菌工程菌株进行发酵培养，得到2-酮-L-古龙酸。8. -种2-酮-L-古龙酸的制备方法，其特征在于，将如权利要求1至3中任一项所述酮古 龙酸杆菌工程菌株和芽孢杆菌进行发酵培养，得到2-酮-L-古龙酸。9. 一种维生素 C的制备方法，其特征在于，将如权利要求1至3中任一项所述酮古龙酸杆 菌工程菌株进行发酵培养，得到2-酮-L-古龙酸;将所述2-酮-L-古龙酸做为原料制备维生 素 C。10. -种维生素 C的制备方法，其特征在于，将如权利要求1至3中任一项所述酮古龙酸 杆菌工程菌株和芽孢杆菌进行发酵培养，得到2-酮-L-古龙酸;将所述2-酮-L-古龙酸做为 原料制备维生素 C。
【文档编号】C12R1/01GK106011043SQ201610652365
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月10日
【发明人】潘才惠, 丁明珠, 王瑞钊, 元英进
【申请人】天津大学