一种st细胞低血清培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种ST细胞低血清培养基，包括：氨基酸或其盐110～250份，D?葡萄糖210～280份，无机盐120～240份，维生素1～2份，植物蛋白水解物2～3份，微量元素0.002～0.003份，谷胱甘肽0.008～0.012份，氢化可的松0.00004～0.00009份，次黄嘌呤0.01～0.03份，亚油酸0.0006～0.0010份，胰岛素0.026～0.038份，苯酚红0.005～0.01份，HEPES90～280份。本发明培养基成分简单、相对成本较低、质量稳定，并且该培养基的制备方法操作简单，易于控制，各个组分在培养基中分散均匀，各批次培养基之间的差异较小。
【专利说明】
-种ST细胞低血清培养基及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及细胞培养领域，具体设及一种ST细胞低血清培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] ST细胞系猪睾丸（swine testis)细胞，体外培养成贴壁生长，培养过程中增殖较 为缓慢，且细胞消化传代中容易结团。ST细胞对多种病毒比较敏感，如猪攝病毒(CSFV)、猪 细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒等。目前ST细胞通过动物血清培养，动物个体不同，血清产地、 批号不同，每批质量差异甚大，不利于ST细胞的培养。
[0003] ST细胞低血清培养基是指需要添加少量血清就可W维持细胞在体外城市间生长 和繁殖的合成培养基，由多种氨基酸、维生素、微量元素、植物蛋白水解物W及无机化合物 组成，为ST细胞提供最优化的生长环境。ST细胞低血清培养基生产属于生物医药行业的基 础产品。随着生物制药和生物医疗行业技术的更新换代，细胞培养技术也在不对进化，血清 用量逐渐减少，生产企业需要不断创新技术，开发高质量ST细胞低血清细胞培养基产品满 足下游客户需求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的W上问题，提供一种ST细胞低血清培养基 及其制备方法，本发明培养基成分简单、相对成本较低、质量稳定，并且该培养基的制备方 法操作简单，易于控制，各个组分在培养基中分散均匀，各批次培养基之间的差异较小。
[0005] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过W下技术方案实现：
[0006] -种ST细胞低血清培养基，按照重量份数计，包括： 氨基酸或其盐 110~250份 D-葡萄糖 210~280份 无机盐 120~240份 维生素 1~2份 植物蛋白水解物2~3份 微量元素 0.002~0.003份
[0007] 谷脫甘肤 0.008~0.012份 每化可的松 0.00004~0.00009份 次黄嚷吟 化刖~化03份 亚油酸 0.0006~0,0010份 膜岛素 0.026~0,038份 苯酪红 0.005~0.01份 HEPES 90 ~280 份.
[000引进一步地，按照重量份数计，所述氨基酸或其盐包括： k两氨酸 2. 5~10. 7份 k精氨酸或其截 4 5~14. 7份 k天口冬酷胺 12~巧份 心夭口冬氨酸 策4~5. 7份 心半脫氨酸或其盐0.5~2. 7份
[0009] k脫氨酸或其盤 11~18. 5傲 ^谷氨酸 8. 5~22份 心谷氨醜胺 溯~礎粉 甘氨酸 1. 4~2份 k组氯酸或其盜 3.绞~見目份 心哲脯氨酸 0. 3~0. 5份 心异亮氨酸 6.日~Η. 5份 k亮氨酸 7. 1~15. 6份 心赖氨酸或其盐 5. 4~9. 9份 k蛋氨酸 0. 8~2. 2份 心苯丙氨酸 1. 2~5. 8份
[0010] k脯氨酸 4. 7~10份 k丝氨酸 3. 8~8. 2份 L-苏/安、酸 2. 6~10. 1份 k色氨酸 0. 6~3份 k酪氨酸 1.3~3. 4份 k鑛氨酸 3.1~7份。
[0011] 进一步地，按照重量份数计，所述无机盐包括： 氯化钢 97~189份 无水憐酸二氨钢 0. 8~1. 4務 无氷氯化巧 1. 5~3份 四水合硝酸钩 0.4~1.3務 /!.水合硫酸铜 0. 00008~0. 00012份
[0012] 氯化娜 1日.5~24:傲 六水合氣化模 1~3份 无水硫酸樣 1.3~1.目份 无氷憐酸氨二钢 4, 4~13. 2份 屯水合硫酸轉 0. Q08~0. 012份 走水硫酸亚铁 0. 008~0. 012份。
[0013] 进一步地，按照重量份数计，所述维生素包括： 牛.物索 0.0016~0.0021份
[0014] 氯化胆碱 0.35~0.68份 D-泛暇卽 0. 04~0. 16份 叶酸 0.06~0.09份 肌醇 0.'17~0.9份 硫辛峻 0.0 OiG~0. 〇〇2'1份 亚砸酸納 0. 0004~0. 0006份 烟酷胺 0.023~0.044份
[0015] 对氨基苯甲酸 0. 008~0. 012份 1，4-了二胺二盐酸盐 0. 0016~0. 0024 份 盐酸化咚醒 0 0008~0. 0012份 盐酸化唆醇 0. 02~0. 05份 核黄素 0.006~0.009份。
[0016] 进一步地，所述植物蛋白水解物包括W下中的一种或几种:大豆蛋白水解物、小麦 蛋白水解物、±豆蛋白水解物、魏豆蛋白水解物。
[0017] 进一步地，按照重量份数计，所述微量元素包括： 四水合二氯化濡 2.2X10-8~斗.齡1〇-8傲 亚砸酸 4.()χ 1〇-7 ~7.9X [0-7 份 二氧化错 2.1X10-6 ~4.7Χ 10-6 傲 六水合Η氯化络 1.2x1 0-6~5.3 XI 0-6份 偏级酸银 3.4Χ10-5~底0xl0-5槪 氯化伽 1.2x10-5 ~2.0x10-5 份 氯化铜 4.1 X1炉~5.1X 1化5份
[001 引 乂水合氣化错 3如10-S~4.1X 10-5份 硫酸辕 1 .0χ 1妒~2,4χ 1化5份 八水氧氣化错 3.8Χ10-5~5.5X10-S份 氣化钢 4,3χ10-5 ~6.2Χ10-5 傲 四水合钥酸镑 0.00003~0.00011份 二氷合氯化铜 0.00011~0.00015份 試化削 0.00006~0.00012份
[0019]六水合氣化铅 0.0028~0.0032份。
[0020] 进一步地，一种ST细胞低血清培养基的制备方法，包括W下步骤：
[0021] 步骤一、按照配方中各组分的重量份数配比，将氨基酸或其盐、碳水化合物D-葡萄 糖、苯酪红、肥阳S混合均匀，干燥，制得第一组分；
[0022] 步骤二、按照配方中各组分的重量份数配比，将无机盐各成分混合均匀，干燥，审U 得第二组分；
[0023] 步骤Ξ、将维生素、谷脫甘肤、氨化可的松、次黄嚷岭、亚油酸、膜岛素配制成溶液， 在溶液中加入赋形剂，干燥，制得第Ξ组分，赋形剂在第Ξ组分中的含量为85~95 % ;
[0024] 步骤四、将微量元素中各组分配置成溶液后，在溶液中加入赋形剂，干燥，制得第 四组分，赋形剂在第四组分中的含量为85~95% ;
[0025] 步骤五、将所述第一组分、第二组分、第Ξ组分和第四组分混合后，加入植物蛋白 水解物球磨，制得ST细胞低血清培养基。
[00%] 进一步地，步骤一中的干燥在70~90°C的溫度下进行，并且干燥时间为2~3小时； 步骤二中的干燥在105~120°C的溫度下进行，并且干燥时间为3~5小时;步骤Ξ和步骤四 中的干燥均为真空冷冻干燥。
[0027]进一步地，步骤五中控制球磨时间为2-4小时，并使ST细胞低血清培养基的平均粒 度不小于120目。
[00%]进一步地，将制备的ST细胞低血清培养基配制成培养液，对ST细胞进行培养，其 中，控制培养液中ST细胞低血清培养基的质量含量为1~3%。
[0029] 进一步地，所述赋形剂可为本领域常规的赋形剂，例如甘露醇、氯化钟、葡萄糖、组 氨酸、甘氨酸等。
[0030] 在本发明的步骤Ξ中，可W根据第Ξ组分中各成分的溶解性质而采用水、酸溶液、 碱溶液中的一种进行溶解，各成分可W单独进行溶解，也可W使溶解性质相同的成分按照 重量份同时溶解于水、酸溶液、碱溶液中的一种中，在混合形成的第一混合溶液中，各成分 的重量份应当满足第Ξ组分中各成分的重量份配比要求，并且第Ξ组分中各成分在第一混 合溶液的总质量含量可W为5~15%。
[0031] 在本发明的步骤四中，可W根据第四组分中各成分的溶解性质而采用水、酸溶液、 碱溶液中的一种进行溶解，并且在混合形成的第二混合溶液中，各成分的重量份应当满足 第四组分中各成分的重量份配比要求，并且第四组分中各成分在第二混合溶液的总质量含 量可W为5~15%。
[0032] 具体地，溶解各成分所采用的水可为超纯水;酸溶液的质量浓度可W为5%-30%， 并且酸溶液所采用的酸的类型可选自盐酸、硫酸和硝酸中的一种;碱溶液的质量浓度可W 为10%-50%，并且碱溶液所采用的碱的类型可选自氨氧化钢和氨氧化钟中的一种。
[0033] 进一步优选地，在制备第Ξ组分和第四组分时，可按照扩大的重量份进行制备，W 使各成分在培养基中分散更加均匀;并且，在制备第Ξ组分和第四组分后，可按照重量份要 求与第一组分和第二组分进行混合，并使最终制得的动物细胞培养基中各成分的重量份满 足上述重量份要求。
[0034] 本发明还提供上述任一所述的ST细胞低血清培养基在动物细胞培养上的应用。该 ST细胞低血清培养基在用于ST细胞培养时，需添加少量血清、即可使ST细胞生长良好且稳 定。
[0035] 本发明还提供一种ST细胞低血清培养方法，将上述任一所述的ST细胞低血清培养 基制成培养液后，对ST细胞进行培养，其中，控制所述培养液中ST细胞低血清培养基的质量 含量为1~3%，例如2%。并且，在对ST细胞进行培养时，ST细胞的接种密度可W为常规密 度，例如lXl〇5个细胞/cm2。
[0036] 进一步优选地，将上述任一所述的ST细胞低血清培养基制成培养液，包括：
[0037] 将上述任一所述的ST细胞低血清培养基溶于水后，加入碳酸氨钢，揽拌混匀，制得 培养液;其中，可W控制所述培养液中碳酸氨钢的质量含量为2~3%。制得的培养液的pH值 为6.8~7.4。
[0038] 进一步地，所培养的动物细胞包括但不限于ST细胞
[0039] 本发明的有益效果是：
[0040] 1、本发明的ST细胞低血清培养基不含血清，含植物蛋白水解物等，其组成简单并 且明确，各成分均可通过普通市售而容易地获得，从而有利于在ST细胞培养中的实际应用。
[0041] 2、本发明的ST细胞低血清培养基的制备方法操作简单、易于控制，采用各组分分 别进行配制的方式不仅有利于保证各成分不受到破坏，而且有利于保证各成分在培养基中 的均匀分散，制备的各批次培养基之间差异小，产品质量稳定。
[0042] 3、本发明的ST细胞低血清培养基在应用时针对性强，可用于ST细胞培养，并且培 养的细胞生长状态良好且稳定，目标产品产量高，可达到常规含血清培养基的培养水平;此 夕h该ST细胞低血清培养基在应用时不对目标产品的分离纯化W及分析检测造成影响，应 用前景广泛。
[0043] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，本发明的【具体实施方式】由W下实施例详细给出。
【具体实施方式】
[0044] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0045] 各实施例所采用的原料的质量要求及来源为：
[0046] 各氨基酸或其盐、D-葡萄糖:药用级，纯度>99%，购自sigma;
[0047] 各无机盐:注射级，纯度> 99 %，购自S igma;
[004引各维生素:药用级，纯度>99%，购自sigma;
[0049] 各微量元素:试剂级，纯度> 98 %，购自国药集团；
[0050] 蛋白组分中的各成分:购自Ker巧公司；
[0051 ] 肥阳S:试剂级，纯度>99%，购自Robiot;
[0052] 胆碱、激素:试剂级，纯度>98%，购自国药集团药业股份有限公司；
[0053] ST细胞:来自中国药品生物制品检定所(简称中检所）。
[0化4] 实施例1
[0055]实施例1中公开了一种ST细胞低血清培养基，由第一组分、第二组分、第Ξ组分、第 四组分和植物水解蛋白组成，其中植物水解蛋白由2.5重量份的大豆蛋白水解物、小麦蛋白 水解物、±豆蛋白水解物和魏豆蛋白水解物中的一种或多种组成。
[0056] 其中；
[0057] 第一组分由如表1中的成分组成：
[0化引表1实施例1中第一组分表
[0化9]
[0060]
[0061] 第二组分包括如表2中所示。
[0062] 表2实施例1中第二组分表
[0063]
[0064]
[00化]第Ξ组分包括如表3中所示。
[0066] 表3实施例1中的第Ξ组分表
[0067]
[006引
[0069] 第四组分包括如表4中所示。
[0070] 表4实施例1中第四组分表
[0071]
[0072]
[0073] 上述ST细胞低血清培养基可通过如下方法制备得到：
[0074] 1、制备第一组分
[0075] 按照上述重量份配比分别称取第一组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于 电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥溫度为80°C，干燥时间为2.5小时，制得第一组分。
[0076] 2、制备第二组分
[0077] 按照上述重量份配比分别称取第二组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于 电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥溫度为11(TC，干燥时间为4小时，制得第二组分。
[007引 3、制备第Ξ组分
[0079] 将第Ξ组分中的氯化胆碱、肌醇、D-泛酸巧、亚砸酸钢、烟酷胺、对氨基苯甲酸、盐 酸化唉醒和盐酸化唉醇溶于超纯水中，揽拌混匀，制得第一溶液;将第Ξ组分中的膜岛素溶 于浓度为10%的盐酸溶液中，揽拌混匀，制得第二溶液;将第Ξ组分中的其余成分溶于浓度 为20%的氨氧化钢溶液中，揽拌混匀，制得第Ξ溶液；
[0080] 分别将第一溶液、第二溶液和第Ξ溶液按照上述重量份配比混合形成第一混合溶 液，向第一混合溶液中加入甘露醇(赋形剂），其中控制第Ξ组分中各成分在第一混合溶液 中的总质量含量为10%，甘露醇在第一混合溶液中的质量含量为90%，揽拌混匀后，采用冷 冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第Ξ组分。
[0081] 4、制备第四组分
[0082] 将第四组分中的二氧化错溶于浓度为15%的氨氧化钢容运种，揽拌混匀，制得第 四溶液;将第四组分中的其余成分溶于超纯水中，揽拌混匀，制得第五溶液；
[0083] 分别将第四溶液、第五溶液按照上述重量份配比混合形成第二混合溶液，向第二 混合溶液中加入甘露醇，其中控制第四组分中各成分在第二混合溶液中的总质量含量为 10%，甘露醇在第二混合溶液中的质量含量为90%，揽拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空 冷冻干燥，制得第四组分。
[0084] 5、制备ST细胞低血清培养基
[0085] 按照上述重量份将第一组分、第二组分、第Ξ组分、第四组分和植物蛋白水解物混 合均匀后，采用球磨机球磨3小时左右，制得平均粒度为120目W上的ST细胞低血清培养基。 [00化]实施例2
[0087]实施例2中公开了一种ST细胞低血清培养基，由第一组分、第二组分、第Ξ组分、第 四组分和植物水解蛋白组成，其中植物水解蛋白由2重量份的大豆蛋白水解物、小麦蛋白水 解物、±豆蛋白水解物和魏豆蛋白水解物中的一种或多种组成。
[008引 其中；
[0089] 第一组分由如表5中的成分组成：
[0090] 表5实施例2中第一组分表
[0091]
[0092]
[0093] 第二组分包括如表6中所示。
[0094] 表6实施例2中第二组分表
[0095]
[0096]
[0097] 第Ξ组分包括如表7中所示。
[009引表7实施例2中的第Ξ组分表
[0099]
[0100]
[0101] 第四组分包括如表8中所示。
[0102] 表8实施例2中第四组分表
[0103]
[0104]
[0105] 上述ST细胞低血清培养基可通过如下方法制备得到：
[0106] 1、制备第一组分
[0107] 按照上述重量份配比分别称取第一组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于 电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥溫度为7(TC，干燥时间为3小时，制得第一组分。
[010引 2、制备第二组分
[0109] 按照上述重量份配比分别称取第二组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于 电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥溫度为l〇5°C，干燥时间为3小时，制得第二组分。
[0110] 3、制备第S组分
[0111] 将第Ξ组分中的氯化胆碱、肌醇、D-泛酸巧、亚砸酸钢、烟酷胺、对氨基苯甲酸、盐 酸化唉醒和盐酸化唉醇溶于超纯水中，揽拌混匀，制得第一溶液;将第Ξ组分中的膜岛素溶 于浓度为5%的盐酸溶液中，揽拌混匀，制得第二溶液;将第Ξ组分中的其余成分溶于浓度 为10%的氨氧化钢溶液中，揽拌混匀，制得第Ξ溶液；
[0112] 分别将第一溶液、第二溶液和第Ξ溶液按照上述重量份配比混合形成第一混合溶 液，向第一混合溶液中加入甘露醇(赋形剂），其中控制第Ξ组分中各成分在第一混合溶液 中的总质量含量为5%，甘露醇在第一混合溶液中的质量含量为90%，揽拌混匀后，采用冷 冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第Ξ组分。
[0113] 4、制备第四组分
[0114] 将第四组分中的二氧化错溶于浓度为10%的氨氧化钢容运种，揽拌混匀，制得第 四溶液;将第四组分中的其余成分溶于超纯水中，揽拌混匀，制得第五溶液；
[0115] 分别将第四溶液、第五溶液按照上述重量份配比混合形成第二混合溶液，向第二 混合溶液中加入甘露醇，其中控制第四组分中各成分在第二混合溶液中的总质量含量为 5%，甘露醇在第二混合溶液中的质量含量为90 %，揽拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空 冷冻干燥，制得第四组分。
[0116] 5、制备ST细胞低血清培养基
[0117] 按照上述重量份将第一组分、第二组分、第Ξ组分、第四组分和植物蛋白水解物混 合均匀后，采用球磨机球磨2小时左右，制得平均粒度为120目W上的ST细胞低血清培养基。 [011引实施例3
[0119] 实施例3中公开了一种ST细胞低血清培养基，由第一组分、第二组分、第Ξ组分、第 四组分和植物水解蛋白组成，其中植物水解蛋白由3重量份的大豆蛋白水解物、小麦蛋白水 解物、±豆蛋白水解物和魏豆蛋白水解物中的一种或多种组成。
[0120] 其中；
[0121] 第一组分由如表5中的成分组成：
[0122] 表9实施例3中第一组分表
[0123]
[0124]
[01巧]第二组分包括如表10中所示。
[0126] 表10实施例3中第二组分表
[0127]
[012引第Ξ组分包括如表11中所示。
[0129] 表11实施例3中的第Ξ组分表
[0130]
[0131]
[0132] 第四组分包括如表12中所示。
[0133] 表12实施例3中第四组分表
[0134]
[0135]
[0136] 上述ST细胞低血清培养基可通过如下方法制备得到：
[0137] 1、制备第一组分
[0138] 按照上述重量份配比分别称取第一组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于 电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥溫度为90°C，干燥时间为2小时，制得第一组分。
[0139] 2、制备第二组分
[0140] 按照上述重量份配比分别称取第二组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于 电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥溫度为120°C，干燥时间为3小时，制得第二组分。
[0141] 3、制备第Ξ组分
[0142] 将第Ξ组分中的氯化胆碱、肌醇、D-泛酸巧、亚砸酸钢、烟酷胺、对氨基苯甲酸、盐 酸化唉醒和盐酸化唉醇溶于超纯水中，揽拌混匀，制得第一溶液;将第Ξ组分中的膜岛素溶 于浓度为30%的盐酸溶液中，揽拌混匀，制得第二溶液;将第Ξ组分中的其余成分溶于浓度 为50%的氨氧化钢溶液中，揽拌混匀，制得第Ξ溶液；
[0143] 分别将第一溶液、第二溶液和第Ξ溶液按照上述重量份配比混合形成第一混合溶 液，向第一混合溶液中加入甘露醇(赋形剂），其中控制第Ξ组分中各成分在第一混合溶液 中的总质量含量为15%，甘露醇在第一混合溶液中的质量含量为90%，揽拌混匀后，采用冷 冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第Ξ组分。
[0144] 4、制备第四组分
[0145] 将第四组分中的二氧化错溶于浓度为50%的氨氧化钢容运种，揽拌混匀，制得第 四溶液;将第四组分中的其余成分溶于超纯水中，揽拌混匀，制得第五溶液；
[0146] 分别将第四溶液、第五溶液按照上述重量份配比混合形成第二混合溶液，向第二 混合溶液中加入甘露醇，其中控制第四组分中各成分在第二混合溶液中的总质量含量为 15%，甘露醇在第二混合溶液中的质量含量为90%，揽拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空 冷冻干燥，制得第四组分。
[0147] 5、制备ST细胞低血清培养基
[0148] 按照上述重量份将第一组分、第二组分、第Ξ组分、第四组分和植物蛋白水解物混 合均匀后，采用球磨机球磨4小时左右，制得平均粒度为120目W上的ST细胞低血清培养基。
[0149] 实施例4
[0150] 采用实施例1的方法制备Ξ批实施例1的ST细胞低血清培养基，分别记为培养基1 ~培养基3。
[0151] 分别将2g各培养基溶于100ml超纯水中，揽拌混匀后，加入2g碳酸氨钢，揽拌混匀 后，加入2%血清，制得各培养液;将培养基1~培养基3制成的培养液分别记作低血清培养 液1~低血清培养液3。
[0152] 同时，分别将2g的国内G公司ST细胞培养基、国内R公司ST细胞培养基溶于100ml超 纯水中，揽拌混匀后，加入10%血清，制得含血清培养液;将G公司ST细胞培养基制得含血清 培养液记作含血清培养液1，将R公司ST细胞培养基制得含血清培养液记作含血清培养液2。
[0153] 在无菌条件下，用已灭菌移液器分别将50ml的低血清培养液1~低血清培养液3及 含血清培养液1~含血清培养液2转移到T75细胞培养瓶中，向各细胞培养瓶分别接种ST细 胞悬液，接种密度为1X105个细胞/cm2,在37°C溫度、5%C02条件下进行贴壁培养。
[0154] 培养72小时后，在显微镜下观察细胞，显微结果表明：低血清培养液1~低血清培 养液3培养的ST细胞均形态饱满，轮廓清晰，生长状态良好。
[0155] 使用膜酶消化制成悬液，采用贝克曼细胞计数仪进行细胞计数并测定细胞活力 (细胞活力为总细胞中活细胞所占的百分比），结果见表13。
[0156] 表13各培养液培养后的细胞计数及细胞活力结果
[0157]
[015引 由表13可知：
[0159] 上述ST细胞低血清培养基能够较好地培养ST细胞，细胞生长状态良好，细胞增殖 倍数高，并且可达到常规含血清培养基的培养水平。
[0160] 上述各批次ST细胞低血清培养基在对ST细胞进行培养时的培养稳定性良好，所培 养的细胞数差异较小，说明本发明的ST细胞低血清培养基质量稳定。
[0161] 对照例1
[0162] W仅由实施例1中第一组分、第二组分、第Ξ组分和植物蛋白水解物组成的ST细胞 低血清培养基作为对照培养基1(即不含有实施例1中的第四组分）。
[0163]将2g对照培养基1溶于100ml超纯水中，揽拌混匀后，加入2g碳酸氨钢，揽拌混匀， 加入2 %血清，制得对照培养液1。
[0164]在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液1转移到T75细胞培养瓶中， 向细胞培养瓶接种ST细胞悬液，接种密度为1 X 105个细胞/cm2，在37 °C溫度、5 % C〇2条件下 进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。
[01化]对照例2
[0166]除第四组分中不含有偏饥酸锭、亚砸酸、六水合Ξ氯化铭和氣化钢之外，其它成分 与实施例1的ST细胞低血清培养基相同，W该培养基作为对照培养基2。
[0167]将2g对照培养基2溶于100ml超纯水中，揽拌混匀后，加入2g碳酸氨钢，揽拌混匀， 加入2 %血清，制得对照培养液2。
[0168] 在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液2转移到T75细胞培养瓶中， 向细胞培养瓶接种ST细胞悬液，接种密度为1 X 105个细胞/cm2，在37 °C溫度、5 % C〇2条件下 进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。
[0169] 对照例3
[0170] 除第四组分中不含有二氧化错、氯化钢、六水合氯化钻和八水氧氯化错之外，其它 成分与实施例1的ST细胞低血清培养基相同，W该培养基作为对照培养基3。
[0171 ]将2g对照培养基3溶于100ml超纯水中，揽拌混匀后，加入2g碳酸氨钢，揽拌混匀， 加入2 %血清，制得对照培养液3。
[0172] 在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液3转移到T75细胞培养瓶中， 向细胞培养瓶接种ST细胞悬液，接种密度为1 X 105个细胞/cm2，在37 °C溫度、5 % C〇2条件下 进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。
[0173] 对照例4
[0174] 除第四组分中不含有四水合二氯化儘、氯化儒、硫酸儀和氯化裡之外，其它成分与 实施例1的ST细胞低血清培养基相同，W该培养基作为对照培养基4。
[0175] 分别将Ig对照培养基4溶于100ml超纯水中，揽拌混匀后，加入2g碳酸氨钢，揽拌混 匀，加入2 %血清，制得对照培养液4。
[0176] 在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液4转移到T75细胞培养瓶中， 向细胞培养瓶接种ST细胞悬液，接种密度为1 X 105个细胞/cm2，在37 °C溫度、5 % C〇2条件下 进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。
[0177] 对照例5
[0178] 除第四组分中不含有二氧化错、偏饥酸锭、四水合钢酸锭、二水合氯化铜和六水合 氯化侣之外，其它成分与实施例1的ST细胞低血清培养基相同，W该培养基作为对照培养基 5。
[0179]分别将3g对照培养基5溶于100ml超纯水中，揽拌混匀后，加入3g碳酸氨钢，揽拌混 匀，加入2 %血清，制得对照培养液5。
[0180]在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液5转移到T75细胞培养瓶中， 向细胞培养瓶接种ST细胞悬液，接种密度为1 X 105个细胞/cm2，在37 °C溫度、5 % C〇2条件下 进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。
[0181 ]表14各对照培养液培养后的细胞计数结果 [0182]
[0183] 由表14可知：
[0184] 缺少本发明ST细胞低血清培养基中的第四组分或第四组分中的几种成分的培养 基在用于培养ST细胞时细胞的密度和活力明显下降。由此说明，上述第四组分中的各成分 在本发明的动物细胞培养基中均是不可或缺的，其对ST细胞的培养均具有显著作用。
[0185] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对运些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可W在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的运些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种ST细胞低血清培养基，其特征在于，按照重量份数计，包括： 氨基酸或其盐 IiO~250份 D-葡萄糖 21:0~280份 无机盐 120~240份 维生素 l·~2份 植物蛋白水解物2~3份 微量元素 0.002~0.003份 谷胱甘肽 0.008~0.012份 氢化可的松 0.00004~0.00009份 次黄嘌呤 OiH~0.03份 亚油酸 0.0006 -0.0010 # 胰岛素 0.026~0.038份 苯酚红 0.005~0.0丨份 HEPES 9(卜280 份。2. 根据权利要求1所述的一种ST细胞低血清培养基，其特征在于，按照重量份数计，所 述氨基酸或其盐包括： L-丙氨酸 2. 5~10, 7份 L-精氨酸或其盐 4. 5~14. 7份 L-天门冬酰胺 12~25份 I -- 人丨、j冬M酸 3. 7I~? · 7份 L-半胱氨酸或其盐0. 5~2. 7份 L-胱氨酸或其盐 I 1~18. 5份 L-谷氨酸 8. 5~22份 L-谷氨酰胺 29~52份 甘氨酸 1. 4~2份 L-组氨酸或其盐 3. 8~5. 6份 L-轻脯氨酸 〔)· 3~0. 5份 L-异亮氨酸 6. 5~1生5:份 L-亮氨酸 7.1~15. 6份 L-赖氨酸或其盐 5. 4~9. 9份 L-蛋氨酸 0. 8~2. 2份 L.-苯丙氨酸 L 2~5, 8份 L-脯氨酸 4. 7~10价 L-丝氨酸 3. 8~8. 2份 L-苏氨酸 2. 6~10, 4份 L-色氨酸 0. 6~3份 L-酪氨酸 1. 3~3, 4份 L-缬氨酸 3. 1~7份。3. 根据权利要求1所述的一种ST细胞低血清培养基，其特征在于，按照重量份数计，所 述无机盐包括： 氯化钠 97~189份 无水磷酸二氢钠 0. 8~1.4份 无水氯化钙 1. 5~3份 四水合硝酸钙 0.4~1.3份 五水合硫酸铜 （).00008~0. ()0012份 氯化钾 16. 5~:M份 八水合氣化镁 1~3份 无水硫酸镁 1.3~1.9份 无水磷酸氢二钠 /1. 4~13. 2份 七水合硫酸锌 0. 008~0. 012份 七水硫酸亚铁 0. 008~0. 012份。4. 根据权利要求1所述的一种ST细胞低血清培养基，其特征在于，按照重量份数计，所 述维生素包括： 牛.物紊 0.00 Ui~0.0024份 氯化胆碱 0. 35~0. 68份 D-泛酸钙 （UM~0。16份 叶酸 0.06~0.09份 肌醇 0. 47~0. 9份 硫辛酸 0.0016~0.0024份 亚硒酸钠 0. 0004~0. 0006份 烟酰胺 0.023~0.044份 对氨基苯甲酸 0. 008~0. 012份 1, 4-丁二胺二盐酸盐 0. 0016~0. 0024 份 盐酸吡哆醛 0, 0008~0. 0012份 盐酸吡哆醇 （).02~0. 05份 核黄索 Q. 006~0.009份。5. 根据权利要求1所述的一种ST细胞低血清培养基，其特征在于，所述植物蛋白水解物 包括以下中的一种或几种：大?蛋白水解物、小麦蛋白水解物、土?蛋白水解物、婉?蛋白 水解物。6. 根据权利要求1所述的一种ST细胞低血清培养基，其特征在于，按照重量份数计，所 述微量元素包括： 四氷合二氯化锰 2.2x10-8~4.2Χ10-8份 亚硒酸 4, 10_7~7.9χ 10_7 份 二氧化锗 2.1乂10_6~4,7><1〇-6份 六水合三氯化铬 1.2x 10-6~5.3Χ 1〇-6份 偏钒酸铵 3.4Χ10-5~6.0Χ10-5份 氯化铷 1.2χ ΙΟ-:5 ~2.0X ΙΟ-5 份 氯化镉 4.1Χ10-5 ~5.1χ10_5 份 六水合氯化钻 3.8χ 1:0·5~4.1X10_5份 硫酸镍 1 .〇χ I ο-5 ~2.4x I 〇-5 份 八水氧氯化锆 3.8xl0·5~5.5X10-5份 氟化钠 4.3X10-5 ~6.2χ ΙΟ-5 份 四水合钼酸铵 0.00003~0.00011份 二水合氯化铜 0.00011~0.00015份 氯化锂 0.00006~0.00012份 六水合氯化铝 0.0028~0.0032份。7. -种权利要求1-6任意一项中所述的ST细胞低血清培养基的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤： 步骤一、按照配方中各组分的重量份数配比，将氨基酸或其盐、碳水化合物D-葡萄糖、 苯酚红、HEPES混合均匀，干燥，制得第一组分； 步骤二、按照配方中各组分的重量份数配比，将无机盐各成分混合均匀，干燥，制得第 二组分； 步骤三、将维生素、谷胱甘肽、氢化可的松、次黄嘌呤、亚油酸、胰岛素配制成溶液，在溶 液中加入赋形剂，干燥，制得第三组分，赋形剂在第三组分中的含量为85~95 % ; 步骤四、将微量元素中各组分配置成溶液后，在溶液中加入赋形剂，干燥，制得第四组 分，赋形剂在第四组分中的含量为85~95 % ; 步骤五、将所述第一组分、第二组分、第三组分和第四组分混合后，加入植物蛋白水解 物球磨，制得ST细胞低血清培养基。8. 根据权利要求7所述的ST细胞低血清培养基的制备方法，其特征在于，步骤一中的干 燥在70~90°C的温度下进行，并且干燥时间为2~3小时；步骤二中的干燥在105~120°C的 温度下进行，并且干燥时间为3~5小时;步骤三和步骤四中的干燥均为真空冷冻干燥。9. 根据权利要求7所述的ST细胞低血清培养基的制备方法，其特征在于，步骤五中控制 球磨时间为2-4小时，并使ST细胞低血清培养基的平均粒度不小于120目。10. 根据权利要求7所述的ST细胞低血清培养基的制备方法，其特征在于，将制备的ST 细胞低血清培养基配制成培养液，对ST细胞进行培养，其中，控制培养液中ST细胞低血清培 养基的质量含量为1~3%。
【文档编号】C12N5/071GK106011050SQ201610629337
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月4日
【发明人】赵洪磊
【申请人】天信和(苏州)生物科技有限公司